Summary
De fleste studier av postherpetisk hornhinnen sykdom bruke en primær infeksjon modell. Imidlertid ikke primær infeksjon med HSV-1 ikke vanligvis føre til sykdom hos mennesker. Her beskriver vi en tilbakevendende modell av postherpetisk hornhinnen sykdom, som mer etterligner menneskelig sykdom.
Abstract
Postherpetisk øyesykdom, kalt herpetic stromal keratitt (HSK), er en potensielt blindende infeksjon i hornhinnen som resulterer i over 300.000 kliniske besøk hvert år for behandling. Mellom 1 og 2 prosent av pasienter med klinisk sykdom vil oppleve tap av syn av den infiserte hornhinnen. De aller fleste av disse tilfellene er et resultat av reaktivering av en latent infeksjon av herpes simplex type I virus og ikke på grunn av akutt sykdom. Interessant, er akutt infeksjon modellen som oftest brukt til å studere denne sykdommen. Imidlertid ble det føltes som en tilbakevendende modell av HSK ville være mer reflekterende av hva som skjer under klinisk sykdom. De tilbakevendende dyremodeller for HSK har ansatt både kaniner og mus. Fordelen med kaniner er at de opplever reaktivering fra latency fraværende enhver kjent stimulans. Når det er sagt, er det vanskelig å utforske rollen som mange immunologiske faktorer spiller i tilbakevendende HSK fordi kanin modellen ikke har Immunological og genetiske ressurser at musen har. Vi valgte å bruke mus modell for tilbakevendende HSK fordi det har fordelen av at det er mange ressurser tilgjengelig, og også vi vet når reaktivering vil skje fordi reaktivering er indusert ved eksponering for UV-B lys. Hittil har denne modellen tillatt de laboratoriene bruke den til å definere flere immunologiske faktorer som er viktig for denne sykdommen. Det har også tillatt oss å teste både terapeutisk og vaksineeffekt.
Protocol
Animal Care Merk: Analgetika brukes ikke i denne modellen som de er anti-inflammatorisk og dermed ville oppheve modellen.
1. Utarbeidelse av virus
- Grow HSV-1 på Vero-celler (80% confluent) ved hjelp av en start fortynning på 0,01 mangfold av infeksjon (i T-150 kolbe, ca 5 x 10 5 plakk forming units) i 3-4 dager før alle cellene har rundet opp og er lett forskyves ved å treffe i kolben.
- Fjerne media til sterile sentrifugerør og sentrifugerør i Sorvall Legend RT ved 4 ° C og 3500 opm i 15 min. Etter fjernelse supernatant (se 1.3), resuspender large pellet fra hver 50 ml rør med 5 ml av media totalt. Sonicate i 1 min i to 30 sek serieopptak.
- Fjern supernatant og satt i 50 ml sterile Oak Ridge rør og sentrifuger ved 9000 rpm, i 1 time ved 4 ° C i en Beckman J2-21 sentrifuge. Dette er for å produsere en liten viral pellet. Kast supernatanten.
- Kombiner sonicate fra 1,2 viddh pellet fra 1,3 og sonicate igjen for 45 sek. Sentrifuge i Sorvall Legend RT på 1500 rpm for 5 min ved 4 ° C. Ta vare på supernatanten. Dette utgjør det viruset lager som er alikvoteres og lagret ved -70 ° C.
- Titer virus på Vero-celler. Jeg vanligvis platen 10 0 til 10 -8 fortynning (hver er en 10-dobbel fortynning) 2x fra 2 separate fortynningstrinn settene. Titrering av virus utføres på 12-brønns sterile plater.
2. Mus Infeksjon
- Injiser hver mus med 0,1 ml av anestesi cocktail/20 g mus kroppsvekt (Ketamin, 60 mg / kg + xylazin 5 mg / kg, som er fortynnet i HBSS). Denne cocktailen er brukt fordi det er en av de sikreste middel for anestesi når riktige doser brukes og effekten av dette stoffet er svært kortvarig.
- Når mus bedøves ripe hornhinnen i høyre øye med en 30 gauge nål med et disseksjonsmikroskop for å sikre at hornhinnen er ikke perforert.
- Hver mus received en intraperitoneal injeksjon av 1 ml av samlet humant serum (Sigma, Temecula, Calif, anti-HSV reaktivitet med en effektiv dose for 50% nøytralisering av viral 1:800) for å beskytte hornhinner fra skade under primær infeksjon.
- Antall musene med enten øreklipsene eller øret punch.
- Etter alle mus har blitt nummerert, ved hjelp en 20 ul pipetten, infisere vi hvert øye med 10 6 PFU (5 ul). Vi infisere bare ett øye og typisk høyre øye. Vi legger også 5 pl HBSS til det andre øyet til å holde det fuktig mens de er bedøvet. 5 ul er tilstrekkelig for å unngå uttørking av øynene Siden fremgangsmåtene utføres i mindre enn 10 min, og dyrene blir dosert med bedøvelse tilsvarende. Infeksjon bekreftes av swabbing mus 3 dager etter infeksjon med en steril bomull applikator som ble hydrert i 1 ml Vero medier. Deretter 100 pl tilsettes til Vero-celler dyrket i 48-brønners plater. Disse platene er overvåking daglig for cytopatisk effekter (CPE).
3. Reaktivering av mus fra Latency
- Mus bedøves minst 5 uker etter primær infeksjon. Det bør bemerkes at vi har reaktivert mus opp til ett år følgende primær infeksjon og har ikke observert signifikante forskjeller i respons.
- Gang bedøvet de er plassert TM20 kromatografisk-Vu transilluminator, som avgir UV-B på en topp bølgelengde av 302 nm slik at bare et enkelt øye utsettes for UV-B lys. Hver mus er eksponert for 250 mJ av UV-B lys cm 2.
- Reaktivering bestemmes av swabbing øyne med steril bomull applikator som er først plassert i 1 ml Vero media på dag 0 (Før UV-B eksponering for å kontrollere for spontane shedders) og deretter på dag 1-7 etter UV-B bestråling. Pinnen materiale blir evaluert som beskrevet i 2.5). For de som har vattpinner infeksiøst virus mengden av virus er kniste av en standard plaque analyse ved hjelp av 12 brønners plater.
- Mus blir evaluert for klinisk øyesykdom av en maskert observatør med en kikkert disseksjonsmikroskop.
- Hornhinne er rangert på en skala fra 0 til 4, hvor 0 indikerer klart stroma, viser en mild stromal opacification, indikerer to moderat tetthet med merkbar iris funksjoner, viser tre tett dekkevne med tap av definerte iris detalj bortsett elev marginer, og 4 indikerer total dekkevne uten bakre visning.
- Neovaskularisering er vurdert på en skala fra 1-8 ved å dele hornhinnen i 4 like kvadranter og å bestemme omfanget av vaskularisering i hver av disse kvadranter.
- Blefaritt er målt som følger: 0, ingen skade; 1, minimal øyelokk hevelse, 2, moderat hevelse og crusty okulær utslipp, 3, kraftig hevelse, moderat periokulær hårtap, og hudskader, og 4, kraftig hevelse med øynene crusted stengt, alvorlig periokulær håravfall, og hudlesjoner.
- Bevis på encefalitt included bøyd tilbake, ruffled håret, og åpenbare nevrologiske abnormiteter. Mus er avlives når de viser betydelige tegn på hjernehinnebetennelse.
5. Representant Resultater
Den tilbakevendende modell som ble beskrevet ovenfor ble først publisert av Shimeld, et al. 1-3. De testet og vårt laboratorium har brukt en modifisert versjon av denne modellen til å publisere mange manuskripter årene 4-15. Modellen ble brukt til å definere rollen som cytokin interferon-γ spiller i tilbakevendende HSV-1 sykdom 10. Som vist i figur 3, gjorde mus mangler IFNγ vises verre hornhinnen sykdom enn vill-type mus 14. Det ble også brukt med hell for å definere den terapeutiske verdi av flere forskjellige vaksine konstruerer 6,10,11. Legg merke til at i ett tilfelle vaksinen testet fungerte bra profylaktisk men ikke viser seg å være terapeutisk virkning seks. Imidlertidnår en replikering-inhabil virusvaksine ble testet, var det ikke bare effektive forebyggende, men var også svært effektiv terapeutisk 10,11, se figur 5 i referanse 10. Mer nylig har vi brukt denne modellen til å avgjøre om kjønnsforskjeller ble påvist i mus gjennomgår tilbakevendende HSK. Som figur 1 viser, mannlige C57BL / 6 mus viser betydelig mindre hornhinne enn gjør kvinnelige C57BL / 6 mus. Likeledes når hornhinnen neovaskularisering ble evaluert, demonstrerte hannmus betydelig mindre nytt fartøy vekst i hornhinnen enn gjorde hunnmus (figur 2). Vi tester nå ut om dette fenotype er stammespesifikk ved å utføre tilsvarende analyse i andre stammer av mus. Vi vil også bestemme om forskjellen skyldes mangel av testosteron eller tilstedeværelse av østrogen.
Figur 1. Corneal sykdom i mannlige og kvinnelige C57BL / 6 muselinjer etter UV-B indusert aktivering. Latent infiserte mus ble overtalt til å aktivere med UV-B-stråling og mus ble overvåket for hornhinne for 35 dager. Numrene av mus brukes for disse studiene var som følger: hanner, n = 15; hunner, n = 15. Resultatene tyder gjennomsnitt ± SEM. * Det var betydelig større virus-indusert sykdom i kvinnelige C57BL / 6 mus for dager 14-35 (P = 0,001 til 0,01).
Figur 2. Corneal sykdom i mannlige og kvinnelige C57BL / 6 muselinjer etter UV-B indusert aktivering. Latent infiserte mus ble overtalt til å aktivere med UV-B-stråling og mus ble overvåket for hornhinnen neovascularization i 35 dager. Numrene av mus brukes for disse studiene var som følger: hanner, n= 15; hunner, n = 15. Resultatene tyder gjennomsnitt ± SEM. * Det var betydelig større virus-indusert sykdom i kvinnelige C57BL / 6 mus for dager 14-28 (P = 0,001 til 0,01).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den tilbakevendende modell av postherpetisk stromal keratitt (HSK) beskrevet her gjør etterforsker for å studere menneskelig HSK i en modell som er mer i samsvar med det som er observert under sykdom hos mennesker. Dermed modellens styrke er at sykdom oppstår i sammenheng med et immunsystem som allerede har ved stimulert under primær sykdom. Siden disse musene allerede har en immunrespons mot HSV-1, de faktorene som reaktiveres at immunrespons sannsynligvis forskjellig fra de som opprinnelig ble generert den. Derfor vil terapeutisk intervensjon for å hindre primære HSK ikke alltid fører til forbedring av tilbakevendende HSK, som vi har vist i ulike publikasjoner ved vurdering forskjeller mellom primær og residiverende HSK 6,8,10-13,15. Som indikert tidligere, er dette spesielt når man utvikler vaksiner for å hindre menneskelig HSK. Fleste vaksiner vil hindre utvikling av primær HSK men svært få har vist seg å være effektive i å redusere reçurrent HSK 6,10,11.
Svakhetene ved denne modellen er at det tar mye lengre tid å utføre et eksperiment. Det er en nesten 6 ukers periode etter primær infeksjon der musene blir latent infisert og administreres humant serum metaboliseres. Videre vil ikke alle mus som er latent infiserte kaste påviselig virus i tear film av den infiserte øyet. Dette betyr ikke at de ikke aktivere, bare at vi ikke kan oppdage sin reaktivering ved dyrking virus. Det er svært sannsynlig at de fleste, om ikke alle mus ikke aktivere, men at de ikke produserer tilstrekkelig antall virus for å bli oppdaget av plakk analysen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke dr. Jay Pepose for å hjelpe lære modellen til oss. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health Grants EY11885 (PMS), EY21247 (PMS) og en ubegrenset tilskudd fra Research for å hindre blindhet til Institutt for Ophthalmology.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma | D5796 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Human Serum | Sigma | S7023 | |
| L-Glutamine | Cellgro | 25-005-C1 | |
| Pen/ Strep | Sigma | P4333 | |
| Fungizone | Invitrogen | 15290018 | |
| Centrifuge | Sorvall | Legend RT | |
| Centrifuge | Beckman | 52-21 | |
| Transilluminatior | UVP | 95-0452-02 | |
| Sonicatior | Branson | Sonifier 450 | |
| Oak Ridge Tubes | Nalgene | Z 720410 | |
| Flasks- 7150 | Corning | 430823 | |
| Plates- 12 well | Corning | CLS 3513 | |
| Plates- 48 well | Corning | CLS 3548 | |
| Sterile Conical Tubes- 30 ml | Corning | CLS 430828 | |
| Sterile Cotton-tipped Applicators | Fisher | 23-400-125 | |
| 30G Needles | Becton-Dickinson | 305106 | |
| 25G Needles | BD | 305122 | |
| 10 ml Syringe | BD | 309602 | |
| 10 ml Syringe | BD | 309604 |
References
- Shimeld, C., Hill, T. J., Blyth, B., Easty, D. An improved model of recurrent herpetic eye disease in mice. Curr. Eye Res. 8, 1193-1205 (1989).
- Shimeld, C., Hill, T. J., Blyth, W. A., Easty, D. L. Reactivation of latent infection and induction of recurrent herpetic eye disease in mice. J. Gen. Virol. 71, 397-404 (1990).
- Shimeld, C., Hill, T. J., Blyth, W. A., Easty, D. L. Passive immunization protects the mouse eye from damage after herpes simplex virus infection by limiting spread of virus in the nervous system. J. Gen. Virol. 71, 681-687 (1990).
- Laycock, K. A., Lee, S. F., Brady, R. H., Pepose, J. S. Characterization of a murine model of recurrent herpes simplex viral keratitis induced by ultraviolet B radiation. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 32, 2741-2746 (1991).
- Keadle, T. L., Stuart, P. M. IL-10 ameliorates corneal disease in a mouse model of recurrent herpetic keratitis. Microbial Path. 38, 13-21 (2005).
- Keadle, T. L., Laycock, K. A., Miller, J. K., Hook, K. K., Fenoglio, E. D., Francotte, M., Slaoui, M., Stuart, P. M., Pepose, J. S. Efficacy of a recombinant glycoprotein D subunit vaccine on the development of primary and recurrent ocular infection with herpes simplex virus type 1 in mice. J. Inf. Dis. 176, 331-338 (1997).
- Keadle, T. L., Laycock, K. A., Pepose, J. S., Stuart, P. M. Proinflammatory cytokines IL-1 and TNF-a are required for recurrent herpetic keratitis in NIH mice. Invest. Ophth. Vis. Sci. 41, 96-102 (2000).
- Keadle, T. L., Usui, N., Laycock, K. A., Kumano, Y., Pepose, J. S., Stuart, P. M. Corneal cytokine expression in a murine model recurrent herpetic stromal keratitis. Ocular Immunol. Inflam. 9, 193-205 (2001).
- Keadle, T. L., Morris, J. L., Pepose, J. S., Stuart, P. M. CD4+ and CD8+ cells are key participants in the development of recurrent herpetic stromal keratitis in mice. Microbial Path. 32, 255-262 (2002).
- Keadle, T. L., Morrison, L. A., Morris, J. L., Pepose, J. S., Stuart, P. M. Therapeutic immunization with a virion host shutoff-defective, replication-incompetent herpes simplex virus type 1 strain limits recurrent herpetic ocular infection. J. Virol. 76, 3615-3625 (2002).
- Keadle, T. L., Laycock, K. A., Morris, J. L., Leib, D. A., Morrison, L. A., Pepose, J. S., Stuart, P. M. Therapeutic vaccination with vhs(-) herpes simplex virus reduces the severity of recurrent herpetic stromal keratitis in mice. J. Gen. Virol. 83, 2361-2365 (2002).
- Keadle, T. L., Morris, J. L., Stuart, P. M. The effects of aminoguanidine on primary and recurrent ocular herpes simplex virus infection. Nitric Oxide. 13, 247-253 (2005).
- Stuart, P. M., Morris, J. E., Sidhu, M., Keadle, T. L. CCL3 protects mice from corneal pathology during recurrent HSV-1 infection. Front. Biosci. 13, 4407-4415 (2008).
- Keadle, T. L., Alexander, D. E., Leib, D. A., Stuart, P. M. Interferon gamma is not required for recurrent herpetic stromal keratitis. Virology. 380, 46-51 (2008).
- Carr, D. J., Austin, B. A., Halford, W. P., Stuart, P. M. Delivery of Interferon-gamma by an adenovirus vector blocks herpes simplex virus Type 1 reactivation in vitro and in vivo independent of RNase L and double-stranded RNA-dependent protein kinase pathways. J. Neuroimmunol. 206, 39-43 (2009).
