Summary
A maioria dos estudos de doença herpética corneal utilizar um modelo de infecção primária. No entanto, a infecção primária por HSV-1 normalmente não conduzem à doença humana. Aqui nós descrevemos um modelo recorrente de doenças da córnea herpética, que mais imita a doença humana.
Abstract
Doença ocular herpética, denominado ceratite herpética estromal (HSK), é uma infecção potencialmente ofuscante da córnea, que resulta em mais de 300.000 por ano visitas clínicas para o tratamento. Entre 1 e 2 por cento dos pacientes com doença clínica vai ocorrer perda de visão da córnea infectada. A grande maioria destes casos é o resultado da reactivação de uma infecção latente pelo vírus herpes simplex tipo I, vírus e não devido a doença aguda. Curiosamente, a infecção aguda é o modelo mais usado para estudar essa doença. No entanto, considerou-se que um modelo recorrente de HSK seria mais reflexivo do que ocorre durante a doença clínica. Os modelos animais recorrentes para HSK ter empregado dois coelhos e ratos. A vantagem é que os coelhos que experimentam a reactivação da latência na ausência de qualquer estímulo conhecido. Dito isto, torna-se difícil explorar o papel que muitos factores imunológicos desempenham na HSK recorrente, porque o modelo de coelho não tem o immunrecursos genéticos e fisiológicos que o mouse possui. Optamos por utilizar o modelo de mouse para HSK recorrente porque tem a vantagem de haver muitos recursos disponíveis e também sabemos quando reativação ocorrerá porque a reativação é induzida pela exposição à luz UV-B. Até agora, este modelo tem permitido os laboratórios de usá-lo para definir vários fatores imunológicos que são importantes para esta doença. Também permitiu-nos testar a terapêutica e a eficácia da vacina.
Protocol
Nota Animal Care: Analgésicos não são utilizadas neste modelo uma vez que são anti-inflamatórios e, assim, invalidar o modelo.
1. Preparação de Vírus
- Crescer HSV-1 em células Vero (80% confluentes) utilizando uma diluição de partida de 0,01 multiplicidade de infecção (em balão T-150, cerca de 5 x 10 5 unidades formadoras de placa) durante 3-4 dias até que todas as células foram arredondados para cima e são facilmente retirados por bater o frasco.
- Remova a mídia para tubos de centrífuga estéreis, e centrifugar na Sorvall Legend RT a 4 ° C e 3500 rpm durante 15 min. Depois de remover o sobrenadante (ver 1.3), ressuspender pellet grande de cada tubo de 50 ml com 5 ml de meios totais. Sonicar durante 1 min em dois bursts 30 seg.
- Remover o sobrenadante e colocados em tubos de 50 ml estéreis, Oak Ridge e centrifugar a 9000 rpm, durante 1 hora a 4 ° C numa centrífuga Beckman J2-21. Isto é para produzir um sedimento pequeno viral. Descartar o sobrenadante.
- Combine sonicate de 1,2 sagacidadeh pellet de 1,3 e sonicar novamente por 45 segundos. Centrífuga Sorvall Legend em RT a 1.500 rpm durante 5 min a 4 ° C. Salve o sobrenadante. Esta constitui a reserva de vírus, que é dividido em alíquotas e armazenado a -70 ° C.
- Vírus de título em células Vero. I placa geralmente de 10 0 a 10 -8 diluição (cada um sendo uma diluição de 10 vezes) a partir de 2 x 2 conjuntos de diluição separadas. Titulação do vírus é realizada em placas de 12 poços estéreis.
2. Infecção do mouse
- Injectar cada rato com 0,1 ml de anestésico cocktail/20 peso corporal do rato g (cetamina, 60 mg / kg de xilazina + 5 mg / kg, que é diluído em HBSS). Este coquetel é usado porque ele é um dos mais seguros meios de anestesia quando doses adequadas são utilizados e os efeitos da droga são muito curta.
- Quando os ratos são anestesiados arranhar a córnea do olho direito, com uma agulha de calibre 30, utilizando um microscópio de dissecação para assegurar que a córnea não é perfurada.
- Cada rato received uma injecção intraperitoneal de 1 ml de soro humano (Sigma, Temecula, Califórnia; reactividade anti-HSV com uma dose efectiva para 50% de neutralização viral de 1:800), a fim de proteger as córneas de danos durante a infecção primária.
- Número os ratos com clipes ou qualquer um dos ouvidos pela orelha soco.
- Depois de todos os ratinhos foram contados, usando um pipetador de 20 ul, que infectam cada olho com 10 6 PFU (5 ul). Nós infectar apenas um olho e normalmente o olho direito. Nós também colocar 5 ul de HBSS para o outro olho para mantê-lo húmido enquanto eles são anestesiados. 5 ul é suficiente para manter a hidratação dos olhos uma vez que os procedimentos são realizados em menos de 10 min, e os animais são doseados com anestésico em conformidade. A infecção é confirmada por raspagem ratinhos 3 dias pós-infecção com um aplicador de algodão estéril que foi hidratado em 1 ml de meio de Vero. Em seguida, 100 ul é adicionada a células Vero cultivadas em placas de 48 poços. Estas placas estão monitorando diariamente para efeitos citopáticos (ECP).
3. Reativação do Ratos de Latência
- Os ratos são anestesiados pelo menos 5 semanas após a infecção primária. Deve notar-se que nos ratos reactivadas até um ano após a infecção primária e não observaram diferenças significativas nas respostas.
- Uma vez anestesiados são colocados TM20 transiluminador cromatografia, Vu, que emite radiação UV-B a um comprimento de onda máximo de 302 nm de tal forma que apenas um único olho é exposto à luz UV-B. Cada rato é exposto a 250 cm de luz mJ de UV-B 2.
- A reactivação é determinada por raspagem olhos com aplicador de algodão estéril, que é primeiro colocada em 1 ml de meio de Vero no dia 0 (antes da exposição ao UV-B para controlar shedders espontâneas) e, em seguida, em 1-7 dias pós-irradiação UV-B. O material de mecha é avaliada como descrito em 2.5). Para aqueles que têm zaragatoas vírus infeccioso a quantidade de vírus é tituladas por um ensaio de placas padrão utilizando placas de 12 poços.
- Os ratinhos são avaliados para a doença ocular clínico por um observador cego, utilizando um microscópio binocular de dissecação.
- Opacidade da córnea é classificado numa escala de 0 a 4, onde 0 indica estroma clara, 1 indica a opacificação do estroma ligeira, 2 indica opacidade moderada com características discerníveis íris, 3 indica a opacidade densa, com perda de detalhe definido íris excepto margens da pupila, e 4 indica opacidade total com nenhuma visão posterior.
- A neovascularização é classificado numa escala de 1-8, dividindo a córnea em quatro quadrantes iguais e determinar a extensão da vascularização em cada um destes quadrantes.
- Blefarite é medida da seguinte forma: 0, sem lesões; 1, pálpebra mínimo inchaço; 2, descarga ocular moderada inchaço e mal-humorado, 3, inchaço grave, perda de cabelo moderada periocular, e lesões de pele, e 4, inchaço grave com os olhos fechados para crostas, perda de cabelo grave periocular, e lesões de pele.
- Evidência de encefalite inclusãoded corcunda, cabelo babados e óbvias anormalidades neurológicas. Os ratos são sacrificados quando eles exibem sinais significativos de encefalite.
5. Resultados representativos
O modelo de repetição, que foi descrito acima, foi publicada pela primeira vez por Shimeld, et al. 1-3. Eles testaram e nosso laboratório tem vindo a utilizar uma versão modificada do modelo de publicar muitos manuscritos sobre os 4-15 anos. O modelo foi utilizado para definir o papel que a citoquina interferon γ-peças na doença recorrente por HSV-1 10. Como mostrado na Figura 3, os ratos que faltam IFNy exibida pior doença da córnea do que ratinhos de tipo selvagem 14. Também foi usado com sucesso para definir o valor terapêutico da vacina diferente várias construções 6,10,11. Note-se que, num caso, a vacina testada funcionou bem profilacticamente, mas não provou ser terapeuticamente eficaz 6. No entanto,quando uma vacina de replicação incompetente-viral foi testado, não só foi eficaz profilacticamente, mas também foi muito eficaz terapeuticamente 10,11, ver a Figura 5 na referência 10. Mais recentemente temos usado este modelo para determinar se as diferenças de gênero foram detectáveis em ratos submetidos a HSK recorrente. Como a Figura 1 mostra, camundongos machos C57BL / 6 exibir opacidade da córnea significativamente menos do que os do sexo feminino C57BL / 6 ratos. Da mesma forma, quando a neovascularização da córnea, foi avaliado, ratos macho demonstraram significativamente menos o crescimento dos vasos de novo na córnea do que ratinhos fêmea (Figura 2). No momento, estamos testando se este fenótipo é cepa específica através da realização de análise semelhante em outras linhagens de camundongos. Nós também irá determinar se a diferença é devida à falta de testosterona ou a presença de estrogénios.
Figura 1. Doença de córnea em C57BL masculino e feminino / 6 linhagens de camundongos após UV-B reativação induzida. Ratinhos com infecção latente foram induzidos para reactivar com irradiação UV-B e os ratinhos foram monitorizados quanto a opacidade da córnea durante 35 dias. O número de ratos utilizados nestes estudos foram os seguintes: os machos, n = 15; fêmeas, n = 15. Os resultados indicam a média ± SEM. * Não foi significativamente maior doença induzida por vírus em ratinhos fêmea C57BL / 6 para os dias 14-35 (P = 0,001-0,01).
Figura 2. Doença de córnea em C57BL masculino e feminino / 6 linhagens de camundongos após UV-B reativação induzida. Ratinhos com infecção latente foram induzidos para reactivar com irradiação UV-B e os ratinhos foram monitorizados quanto a neovascularização da córnea durante 35 dias. O número de ratos utilizados nestes estudos foram os seguintes: os machos, n= 15; fêmeas, n = 15. Os resultados indicam a média ± SEM. * Não foi significativamente maior doença induzida por vírus em ratinhos fêmea C57BL / 6 para os dias 14-28 (P = 0,001-0,01).
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Discussion
O modelo de repetição de ceratite herpética estromal (HSK) aqui descrito permite ao investigador para estudar HSK humano num modelo que é mais consistente com o que é observado durante a doença humana. Assim, as intensidades do modelo são a doença que ocorre no contexto de um sistema imunitário que tem já por estimulado durante a doença primária. Uma vez que estes ratos já têm uma resposta imune contra HSV-1, os factores que reativam resposta imunitária que provavelmente diferentes daqueles que originalmente gerou. Portanto, a intervenção terapêutica para evitar HSK primário não vai sempre levar a melhoria da HSK recorrente, que temos demonstrado em várias publicações ao avaliar as diferenças entre HSK primária e recorrente 6,8,10-13,15. Como indicado anteriormente, esta é nomeadamente o caso quando o desenvolvimento de vacinas para prevenir HSK humano. A maioria das vacinas irá impedir o desenvolvimento de HSK primário, mas muito poucas têm sido demonstrado ser eficaz na redução da recurrent HSK 6,10,11.
Os pontos fracos deste modelo é que leva muito mais tempo para realizar um experimento. Há um período de uma semana a seguir à infecção quase 6 primário, durante o qual os ratos tornam-se infectados de forma latente e o soro humano administrado é metabolizado. Além disso, nem todos os ratinhos que estão infectadas de forma latente verterá vírus detectáveis no filme lacrimal do olho infectado. Isso não significa que eles não reativar, só que não podemos detectar a sua reativação por vírus cultura. É altamente provável que a maioria, se não todos os ratos que reactivar mas que não produzem um número suficiente de vírus para ser detectados por ensaio de placas.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Jay Pepose para ajudar ensinando o modelo para nós. Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health Grants EY11885 (SPM), EY21247 (SPM) e uma concessão irrestrita de Pesquisa para prevenir a cegueira para o Departamento de Oftalmologia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma | D5796 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Human Serum | Sigma | S7023 | |
| L-Glutamine | Cellgro | 25-005-C1 | |
| Pen/ Strep | Sigma | P4333 | |
| Fungizone | Invitrogen | 15290018 | |
| Centrifuge | Sorvall | Legend RT | |
| Centrifuge | Beckman | 52-21 | |
| Transilluminatior | UVP | 95-0452-02 | |
| Sonicatior | Branson | Sonifier 450 | |
| Oak Ridge Tubes | Nalgene | Z 720410 | |
| Flasks- 7150 | Corning | 430823 | |
| Plates- 12 well | Corning | CLS 3513 | |
| Plates- 48 well | Corning | CLS 3548 | |
| Sterile Conical Tubes- 30 ml | Corning | CLS 430828 | |
| Sterile Cotton-tipped Applicators | Fisher | 23-400-125 | |
| 30G Needles | Becton-Dickinson | 305106 | |
| 25G Needles | BD | 305122 | |
| 10 ml Syringe | BD | 309602 | |
| 10 ml Syringe | BD | 309604 |
References
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