Summary
De flesta studier av herpetisk hornhinnan sjukdomar använder en primär infektion modell. Emellertid primär infektion med HSV-1 inte normalt leda till human sjukdom. Här beskriver vi en återkommande modell för herpetisk hornhinnan sjukdom som närmare efterliknar mänsklig sjukdom.
Abstract
Herpetisk ögonsjukdom, kallas herpetisk stromal keratit (HSK), är en potentiellt bländande infektion i hornhinnan som resulterar i över 300.000 kliniska besök varje år för behandling. Mellan 1 och 2 procent av de patienter med klinisk sjukdom kommer att uppleva synförlust den infekterade hornhinnan. De allra flesta av dessa fall är resultatet av reaktivering av en latent infektion av herpes simplex typ I-virus och inte på grund av akut sjukdom. Intressant nog är den akuta infektionen modellen oftast används för att studera denna sjukdom. Dock det kändes att en återkommande modell av HSK skulle vara mer reflekterande av vad som sker under klinisk sjukdom. De återkommande djurmodeller för HSK har använt både kaniner och möss. Fördelen med kaniner är att de upplever reaktivering från latens frånvarande någon känd stimulans. Som sagt, det är svårt att undersöka den roll som många immunologiska faktorer spelar i återkommande HSK eftersom kaninen modellen inte har Immunmiologiska och genetiska resurser att musen har. Vi valde att använda musmodell för återkommande HSK eftersom det har fördelen av att det finns många resurser tillgängliga och även vi vet när reaktivering sker eftersom reaktivering induceras av exponering för UV-B-ljus. Hittills har denna modell får dessa laboratorier använder den för att definiera flera immunologiska faktorer som är viktiga för denna sjukdom. Det har också gett oss möjlighet att testa både terapeutisk och vaccin effekt.
Protocol
Animal Care Anmärkning: Analgetika används inte i denna modell eftersom de är anti-inflammatoriska och därmed skulle ogiltig modellen.
1. Framställning av virus
- Grow HSV-1 på Vero-celler (80% sammanflytande) med en start utspädning av 0,01 multiplicitet av infektion (i T-150-kolv, omkring 5 x 10 5 plackbildande enheter) under 3-4 dagar tills alla celler har rundade upp och kan lätt rubbas genom att träffa kolven.
- Ta media till sterila centrifugrör och centrifugera i Sorvall Legend RT vid 4 ° C och 3500 rpm i 15 min. Efter avlägsnande supernatanten (se 1,3), resuspendera pelleten stor från varje 50 ml rör med 5 ml medium totalt. Sonikera under 1 min i två 30 sek skurar.
- Avlägsna supernatanten och tas i 50 ml sterila rör Oak Ridge och centrifugera vid 9.000 varv per minut, under 1 timme vid 4 ° C i en Beckman J2-21 centrifug. Detta är att åstadkomma en liten viralt pellet. Kasta bort supernatanten.
- Kombinera sonikera från 1,2 kvickheth pellets från 1,3 och sonikera igen för 45 sek. Centrifugera i Sorvall Legend RT vid 1.500 rpm under 5 minuter vid 4 ° C. Spara supernatanten. Detta utgör den virusstam som alikvoteras och lagras vid -70 ° C.
- Titer virus på Vero-celler. Jag platta vanligtvis 10 0 ut till 10 -8 utspädning (vardera är en 10-faldig utspädning) 2x från 2 separata set utspädning. Titrering av virus utförs på 12-brunnars plattor sterila.
2. Mus Infektion
- Injicera varje mus med 0,1 ml av bedövningsmedel cocktail/20 g mus kroppsvikt (Ketamin, 60 mg / kg + Xylazin 5 mg / kg som spädes i HBSS). Denna cocktail används eftersom det är en av de säkraste anestesi när lämpliga doser används och effekterna av detta läkemedel är mycket kortlivade.
- När mössen sövs repa hornhinnan i höger öga med en 30 gauge nål med ett dissektionsmikroskop för att säkerställa att hornhinnan inte är perforerad.
- Varje mus RecEived en intraperitoneal injektion av 1 ml av sammanslaget humant serum (Sigma, Temecula, Kalifornien, anti-HSV-reaktivitet med en effektiv dos för 50% viral neutralisering av 1:800) för att skydda hornhinnor från skada under primärinfektion.
- Antal möss med antingen öronclips eller på gehör punsch.
- Efter alla mössen har numrerats, med användning av en 20 pl pipett, infektera vi varje öga med 10 6 PFU (5 pl). Vi infekterar endast ett öga och typiskt höger öga. Vi lägger också 5 pl av HBSS till det andra ögat för att hålla den fuktig medan de sövs. 5 ul är tillräcklig för att upprätthålla hydratisering av ögonen eftersom förfarandena utförs i mindre än 10 minuter, och djuren doseras med bedövningsmedel därefter. Infektion bekräftas genom badda möss 3 dagar efter infektion med en steril bomull applikator som hydratiserades i 1 ml Vero medier. Därefter 100 il tillsätts till Vero-celler odlade i 48-brunnars plattor. Dessa plattor övervakar dagligen för cytopatiska effekter (CPE).
3. Reaktivering av möss från latens
- Möss sövs minst 5 veckor efter primär infektion. Det bör noteras att vi har reaktiveras mössen upp till ett år efter primär infektion och har inte observerats signifikanta skillnader i svar.
- När bedövades de placeras TM20 kromatografiskt Vu transilluminator, som avger UV-B vid en toppvåglängd av 302 nm, så att endast en enda öga exponeras för UV-B-ljus. Varje mus utsätts för 250 mJ UV-B-ljus cm 2.
- Reaktivering bestäms genom badda ögonen med steril bomull applikator som först placeras i 1 ml Vero medier på dag 0 (Före UV-B exponering för att kontrollera spontana shedders) och sedan på dag 1 till 7 efter UV-B bestrålning. Svabben materialet utvärderades såsom beskrivits i 2,5). För de kompresser som har infektiöst virus mängden virus fnittrade av en vanlig plackanalys med användning 12 brunnsplattor.
- Möss utvärderas för klinisk ögonsjukdomar av en maskerad observatör som använder en kikare dissektionsmikroskop.
- Hornhinneopacitet har fått betyget på en skala från 0 till 4, där 0 anger tydligt stroma, visar 1 mild stromal grumling indikerar 2 måttlig opacitet med urskiljbara iris funktioner visar 3 tät opacitet med förlust av definierade iris detalj utom elev marginaler och 4 indikerar totala opacitet utan posterior vy.
- Neovaskularisation har värderas på en skala av 1 till 8 genom att dela hornhinnan i 4 lika stora kvadranter och bestämma omfattningen av vaskularisering i vardera av dessa kvadranter.
- Blefarit mäts enligt följande: 0, inga skador, 1, minimal ögonlocket svullnad, 2, måttlig svullnad och knaprig okulär ansvarsfrihet, 3, kraftig svullnad, måttlig periokulär håravfall och hudskador, och 4, kraftig svullnad i ögonen crusted avstängning, svår periokulär håravfall, och hudskador.
- Bevis på encefalit inkluDED böjd rygg, ruggig hår och uppenbara neurologiska avvikelser. Möss avlivas när de visar tydliga tecken på encefalit.
5. Representativa resultat
Den återkommande modellen som beskrevs ovan publicerades först av Shimeld et al. 1-3. De testade och vårt laboratorium har använt en modifierad version av denna modell att publicera många manuskript under åren 4-15. Modellen har använts för att definiera den roll som cytokin interferon-γ spelar i återkommande HSV-1 sjukdom 10. Såsom visas i figur 3, gjorde möss som saknade IFNy visade sämre korneal sjukdom än vildtypsmöss 14. Det var också framgångsrikt använts för att definiera det terapeutiska värdet av flera olika konstruktioner vaccin 6,10,11. Notera att i det ena fallet vaccinet testade fungerade bra profylaktiskt men inte visar sig vara terapeutiskt effektiva 6. Emellertidnär en replikationsinkompetent virusvaccin testades var det inte bara effektiv profylaktiskt, men var också mycket effektiv terapeutiskt 10,11, se figur 5 i referens 10. På senare tid har vi använt denna modell för att avgöra om könsskillnader kunde detekteras i möss som genomgår återkommande HSK. Som Figur 1 visar, C57BL / 6 möss uppvisar betydligt mindre korneal opacitet än vad kvinnlig C57BL / 6 möss. Likaså när hornhinneneovaskularisation utvärderades, visade hanmöss betydligt mindre ny kärltillväxt i hornhinnan än gjorde honmöss (figur 2). Vi testar för närvarande om denna fenotyp är stamspecifik genom att utföra liknande analyser i andra stammar av möss. Vi kommer också att avgöra huruvida skillnaden beror på brist på testosteron eller närvaro av östrogen.
Figur 1. Hornhinnan sjukdomar i manliga och kvinnliga C57BL / 6 stammar mus efter UV-B-inducerad reaktivering. Latent infekterade möss inducerades att reaktivera med UV-B-strålning och mössen övervakades för korneal opacitet för 35 dagar. Antalet möss som användes för dessa studier var följande: män, n = 15, kvinnor, n = 15. Resultaten visar medelvärdet ± SEM. * Det var signifikant större virusinducerad sjukdom honkön C57BL / 6 möss för dagarna 14-35 (P = 0,001 till 0,01).
Figur 2. Hornhinnan sjukdom i manlig och kvinnlig C57BL / 6 mus-stammar efter UV-B-inducerad reaktivering. Latent infekterade möss inducerades att reaktivera med UV-B-strålning och mössen övervakades för hornhinneneovaskularisering under 35 dagar. Antalet möss som användes för dessa studier var följande: män, N= 15; kvinnor, n = 15. Resultaten visar medelvärdet ± SEM. * Det var signifikant större virusinducerad sjukdom honkön C57BL / 6 möss för dagarna 14-28 (P = 0,001 till 0,01).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den återkommande modellen av herpetisk stromal keratit (HSK) beskrivs här gör det möjligt för utredaren att studera människans HSK i en modell som är mer i linje med vad som observeras under mänskliga sjukdomar. Således modellens styrkor är att sjukdomen förekommer i samband med ett immunförsvar som redan genom stimulerad under grundsjukdomen. Eftersom dessa möss har redan ett immunsvar mot HSV-1, de faktorer som återaktivera att immunsvaret är sannolikt skiljer sig från dem som ursprungligen genererade den. Därför kommer terapeutisk intervention för att förhindra primär HSK inte alltid leder till förbättring av återkommande HSK, som vi har visat i olika publikationer vid utvärdering skillnader mellan primär och återkommande HSK 6,8,10-13,15. Såsom angivits tidigare, är detta fallet när utveckla vacciner för att förhindra mänsklig HSK. De flesta vacciner kommer att förhindra utvecklingen av primära HSK men mycket få har visat sig vara effektivt för minskning RECUrrent HSK 6,10,11.
Bristerna i denna modell är att det tar mycket längre tid att utföra ett experiment. Det finns en nästan 6 veckors period efter primär infektion under vilken mössen blir latent infekterade och den administrerade humanserum metaboliseras. Vidare kommer inte alla möss som latent är infekterade skjul detekterbar virus i tårfilmen den infekterade ögat. Detta betyder inte att de inte återaktivera bara att vi inte kan upptäcka sin reaktivering genom odling virus. Det är mycket troligt att de flesta, om inte alla möss inte återaktivera men att de inte producerar tillräckligt många virus som kan detekteras genom plackanalys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Dr Jay Pepose för att hjälpa lära modellen för oss. Detta arbete stöddes av National Institutes of Health bidrag EY11885 (PMS), EY21247 (PMS) och en obegränsad bidrag från forskning att förebygga blindhet för Ögonkliniken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma | D5796 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Human Serum | Sigma | S7023 | |
| L-Glutamine | Cellgro | 25-005-C1 | |
| Pen/ Strep | Sigma | P4333 | |
| Fungizone | Invitrogen | 15290018 | |
| Centrifuge | Sorvall | Legend RT | |
| Centrifuge | Beckman | 52-21 | |
| Transilluminatior | UVP | 95-0452-02 | |
| Sonicatior | Branson | Sonifier 450 | |
| Oak Ridge Tubes | Nalgene | Z 720410 | |
| Flasks- 7150 | Corning | 430823 | |
| Plates- 12 well | Corning | CLS 3513 | |
| Plates- 48 well | Corning | CLS 3548 | |
| Sterile Conical Tubes- 30 ml | Corning | CLS 430828 | |
| Sterile Cotton-tipped Applicators | Fisher | 23-400-125 | |
| 30G Needles | Becton-Dickinson | 305106 | |
| 25G Needles | BD | 305122 | |
| 10 ml Syringe | BD | 309602 | |
| 10 ml Syringe | BD | 309604 |
References
- Shimeld, C., Hill, T. J., Blyth, B., Easty, D. An improved model of recurrent herpetic eye disease in mice. Curr. Eye Res. 8, 1193-1205 (1989).
- Shimeld, C., Hill, T. J., Blyth, W. A., Easty, D. L. Reactivation of latent infection and induction of recurrent herpetic eye disease in mice. J. Gen. Virol. 71, 397-404 (1990).
- Shimeld, C., Hill, T. J., Blyth, W. A., Easty, D. L. Passive immunization protects the mouse eye from damage after herpes simplex virus infection by limiting spread of virus in the nervous system. J. Gen. Virol. 71, 681-687 (1990).
- Laycock, K. A., Lee, S. F., Brady, R. H., Pepose, J. S. Characterization of a murine model of recurrent herpes simplex viral keratitis induced by ultraviolet B radiation. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 32, 2741-2746 (1991).
- Keadle, T. L., Stuart, P. M. IL-10 ameliorates corneal disease in a mouse model of recurrent herpetic keratitis. Microbial Path. 38, 13-21 (2005).
- Keadle, T. L., Laycock, K. A., Miller, J. K., Hook, K. K., Fenoglio, E. D., Francotte, M., Slaoui, M., Stuart, P. M., Pepose, J. S. Efficacy of a recombinant glycoprotein D subunit vaccine on the development of primary and recurrent ocular infection with herpes simplex virus type 1 in mice. J. Inf. Dis. 176, 331-338 (1997).
- Keadle, T. L., Laycock, K. A., Pepose, J. S., Stuart, P. M. Proinflammatory cytokines IL-1 and TNF-a are required for recurrent herpetic keratitis in NIH mice. Invest. Ophth. Vis. Sci. 41, 96-102 (2000).
- Keadle, T. L., Usui, N., Laycock, K. A., Kumano, Y., Pepose, J. S., Stuart, P. M. Corneal cytokine expression in a murine model recurrent herpetic stromal keratitis. Ocular Immunol. Inflam. 9, 193-205 (2001).
- Keadle, T. L., Morris, J. L., Pepose, J. S., Stuart, P. M. CD4+ and CD8+ cells are key participants in the development of recurrent herpetic stromal keratitis in mice. Microbial Path. 32, 255-262 (2002).
- Keadle, T. L., Morrison, L. A., Morris, J. L., Pepose, J. S., Stuart, P. M. Therapeutic immunization with a virion host shutoff-defective, replication-incompetent herpes simplex virus type 1 strain limits recurrent herpetic ocular infection. J. Virol. 76, 3615-3625 (2002).
- Keadle, T. L., Laycock, K. A., Morris, J. L., Leib, D. A., Morrison, L. A., Pepose, J. S., Stuart, P. M. Therapeutic vaccination with vhs(-) herpes simplex virus reduces the severity of recurrent herpetic stromal keratitis in mice. J. Gen. Virol. 83, 2361-2365 (2002).
- Keadle, T. L., Morris, J. L., Stuart, P. M. The effects of aminoguanidine on primary and recurrent ocular herpes simplex virus infection. Nitric Oxide. 13, 247-253 (2005).
- Stuart, P. M., Morris, J. E., Sidhu, M., Keadle, T. L. CCL3 protects mice from corneal pathology during recurrent HSV-1 infection. Front. Biosci. 13, 4407-4415 (2008).
- Keadle, T. L., Alexander, D. E., Leib, D. A., Stuart, P. M. Interferon gamma is not required for recurrent herpetic stromal keratitis. Virology. 380, 46-51 (2008).
- Carr, D. J., Austin, B. A., Halford, W. P., Stuart, P. M. Delivery of Interferon-gamma by an adenovirus vector blocks herpes simplex virus Type 1 reactivation in vitro and in vivo independent of RNase L and double-stranded RNA-dependent protein kinase pathways. J. Neuroimmunol. 206, 39-43 (2009).
