Summary
CRISPR / Cas-systemer megle adaptiv immunitet i bakterier og Archaea. Mange Cas proteiner er foreslått å fungere som endoribonucleases virker på crRNA forløpere av varierende lengde. Her har vi illustrere tre ulike tilnærminger for å generere pre-crRNA substrater for den biokjemiske analysen av Cas endonuclease aktivitet.
Abstract
Samspillet mellom virus og deres prokaryote verter formet utviklingen av bakterier og archaeal liv. Prokaryoter utviklet flere strategier for å unngå virus angrep som inkluderer begrensning modifikasjon, mislykket infeksjon og CRISPR / Cas-systemer. Disse adaptive immunforsvar finnes i mange bakterier og de fleste Archaea består av c lustered r egularly jeg nterspaced s hort p alindromic r EPEAT (CRISPR) sekvenser og en rekke C RISPR som tilknyttede (CAS) gener (Fig. 1) 1-3. Ulike sett av Cas proteiner og gjentar definere minst tre store avvikende typer CRISPR / Cas systemer 4. De universelle proteiner Cas1 og CAS2 foreslås å være involvert i opptaket av virus-DNA somvil generere en ny spacer element mellom to rapporter på 5 'terminus av en forløpende CRISPR klynge 5. Hele klyngen er transkribert til en forløper-crRNA inneholder all spacer og repeterte sekvenser og er senere behandlet av et enzym i et mangfoldig CAS-6 familien i mindre crRNAs 6-8. Disse crRNAs består av avstandsstykket sekvensen flankert av en 5 'terminal (8 nukleotider) og en 3' terminal tag avledet fra repetisjonssekvensen 9. En gjentatt infeksjon av viruset kan nå blokkeres som ny crRNA ledes av en CAS proteinkompleks (Cascade) til det virale DNA og identifisere det som sådan via basen komplementaritet 10. Til slutt, for CRISPR / Cas type 1-systemer, vil nuklease Cas3 ødelegge oppdaget inntrenger DNA 11,12.
Disse prosessene definerer CRISPR / Cas som en adaptiv immunsystemet prokaryoter og åpnet en fascinerende forskningsfelt for studiet av de involverte Cas proteiner.Funksjonen til mange Cas proteiner er fortsatt unnvikende og årsakene til den tilsynelatende mangfoldet av CRISPR / Cas-systemer gjenstår å bli opplyst. Potensielle aktiviteter i de fleste Cas proteiner ble spådd via detaljerte beregningsorientert analyser. En stor fraksjon av Cas proteiner er enten vist eller foreslått for å fungere som endonukleaser 4.
Her presenterer vi metoder for å generere crRNAs og forløperen-cRNAs for studiet av Cas endoribonucleases. Ulike endonuclease analyser krever enten korte repeterte sekvenser som kan direkte syntetiseres som RNA oligonukleotider eller lengre crRNA og pre-crRNA sekvenser som genereres via in vitro T7 RNA polymerase avrenning transkripsjon. Denne metodikken kan inkorporering av radioaktive nukleotider for generering av internt merket endonuklease substrater og etablering av syntetisk eller mutant crRNAs. CAS-6 endonuclease aktivitet benyttes for å modne pre-crRNAs inn crRNAs med 5'-hydroxyl og en 2 ', 3'-cykliske fosfat termini.
Protocol
1. Generasjon av lang pre-crRNA underlag via PCR
- Design PCR primere rettet mot spacer områder av en CRISPR klyngen. Tilsett T7 RNA polymerase (T7RNAP) promotersekvens (5 '-taatacgactcactata-3') til den fremre primer og restriksjonsseter for kloning PCR produktet inn i en vektor til begge primere (f.eks BamHI og Hind III for pUC19, fig. 2A) .
Merk: T7RNAP trenger et guanidin residuum for riktig initiering av transkripsjon. - Forsterke din pre-crRNA sekvens av interesse fra genomisk DNA med PCR.
- Separer PCR produktene ved agarose gel elektroforese og gel ekstrahere det ønskede bånd. Fordøy PCR produktet med restriksjonsenzymer for å opprette klebrige ender (f.eks BamHI og Hindlll, fig. 2A). Rense PCR-produkt med en PCR rensing kit å eliminere spalting biprodukter.
- Sette opp en ligeringsreaksjonen som inneholder T4 DNA ligase, T4 DNA-ligase-buffer ogen 3:1 molforhold av spaltet PCR-produkt og defosforylert lineære pUC vektor med tilsvarende klebrige ender. Inkuber blandingen ved 16 ° C over natten. Transformere ligeringsblandingen inn kompetente Escherichia coli DH5α celler ved standardprotokoller og bruke blå hvit screening for å identifisere vellykket ligation.
- Isoler plasmider fra hvite kolonier ved hjelp av en plasmid forberedelse kit. Identifisere positive kloner av plasmid sekvensering. Alternativt kan koloni PCR benyttes for screening.
2. Generasjon av middels pre-crRNA underlag via annealing av DNA-oligonukleotider
- Design forover og bakover oligonukleotider med ønsket CRISPR gjenta / spacer sekvens. Oligonukleotidene inneholde sekvensen av et T7 RNAP promotor samt terminal restriksjonsseter (f.eks BamHI og Hind III for pUC19). Avslutte oligonukleotider for å sikre at endene klebrig form etter annealing (se fig. 2B
- 5'-fosforylere 1 nmol av hver oligonukleotid i en egen 20 ul reaksjon inneholdende 5 pl av T4 polynukleotidkinase (PNK), 2 pl av T4 PNK 10x buffer, 2 pl ATP (10 mM). Inkuber hver prøve i 1 time ved 37 ° C.
- Hybridisere de to fosforylerte oligonukleotider. Kombiner 1μl av fosforylert forover oligo blanding (fra 2,2.), 1 pl av den fosforylerte revers oligo blanding (fra 2,2.), 1 pl av T4 DNA-ligase 10x buffer i en 10 pl reaksjon. Inkuber prøvene i 5 min ved 95 ° C på en varmeblokk eller i kokende vann, slå av varmekilden og la blandingen avkjøles til romtemperatur (~ 2-3 timer).
Merk: I denne kritiske trinnet favoriserer langsom kjøleprosessen hybri av de to oligonukleotider forhold til dannelsen av strukturer innenfor hver enkelt oligonukleotid. - Ligere 4 pl av hybridiseringsreaksjonen blanding, 1μl av fordøyd og defosforylert pUC vektoren (0,1 ug /ul) med T4 DNA-ligase, T4 DNA-ligase 10x buffer og 10 mM ATP i et 20 ul ligeringsblandingen. Inkuber prøven ved 16 ° C over natten.
- Transformere ligatisert plasmider inn kompetente Escherichia coli DH5α celler ved standardprotokoller og utnytte blå hvit screening. Isoler plasmider og identifisere positive kloner ved oppslutning (å screene for innstikk av den ønskede størrelse) og påfølgende plasmid sekvensering.
3. Generasjon av kort Cas RNA underlag via custom RNA oligonukleotidsyntese
Design kort Cas RNA underlag (f.eks enkle repeterte sekvenser, fig. 2C) og utnytte egne RNA oligonukleotidsyntese fasiliteter.
Merk: Inkludering av en deoksyribonukleotid ved en angitt posisjon av en RNA oligonukleotid (fig. 2C) kan brukes til å fastslå området av RNA spaltning.
4. In vitro T7 RNA polymerase transkripsjon
- Isoler plasmider med designet konstruere (fra 1.9. Eller 2,7.) Med en maxiprep plasmid rensing kit.
- Linearisere plasmidet med restriksjonsenzymet som kløyver nedstrøms klonet fragmentet (f.eks Hindlll). Sikre fullstendig fordøyelse.
Merk: Hvis en avvikende definert 3 'terminus av RNA transkriptet er ønsket, bør det utformet konstruktet inneholde en ytterligere spesifikk restriksjonssete for "run-off" transkripsjon oppstrøms for Hindlll sekvensen. - Rense lineariserte plasmid etter fenol: kloroform (1:1) ekstraksjon og etanolutfelling. Gjenopprette nukleinsyrene ved oppslemme pelleten i DEPC behandlet sterilt vann.
- Sett opp en in vitro T7 RNAP rømme transkripsjon blanding som inneholder 40 mM HEPES / KOH (pH 8), 22 mM MgCl 2, 5 mM ditiotreitol, 1 mM spermidin, 4 mM av hver nukleosid trifosfat (ATP, CTP, GTP, UTP ), 40-100 ug / ml av fordøydplasmid og 0,1 mg / ml T7 RNAP i DEPC behandlet vann. Inkuber i 3 timer ved 37 ° C.
- Analysere de oppnådde RNA-transkripter på en denaturerende 8 M urea 12% polyakrylamidgel (fig. 3A). RNAet transkripter kan renses via Mono Q anionbytte kromatografi 13 og gjenvunnet ved etanolutfelling av RNA brøker og resuspendering av pelleten i DEPC behandlet sterilt vann. For fremtidig bruk, lagre RNA ved -80 ° C.
5. CAS-6 endonuclease analysen
- Sette opp en 20fil in vitro T7 RNAP rømme transkripsjon blanding (se 4.4) som inneholder en redusert mengde av 2 mM ATP og er supplert med 2,5 pl α-[32 P]-ATP (10 mCi / ml, 5000 Ci / mmol). Rens reaksjonsprodukter via gel utvinning fra en denaturerende 8 M urea 12% polyakrylamidgel. Visualisere band ved autoradiografi.
- Produsere og rense de ønskede rekombinante Cas proteiner. I dette eksemplet, CAS6 fra Clostridium thermocellum ble renset via varme ventet og Ni-NTA-kromatografi.
- Sett opp en endonuklease assay reaksjoner (f.eks for Clostridium thermocellum CAS-6, inneholder reaksjonsblandingen 20 mM HEPES (KOH PH8), 250 mM KCl, 2 mM MgCl 2, 1 mM DTT, 12 000 cpm RNA substrat og 1 uM enzym og ble inkubert ved 37 ° C i 30 min).
- Belastning 5 pl av reaksjonsblandingen (10 pl + RNA lasting buffer inneholdende 95% formamid) på en 8 M urea 12% polyakrylamidgel. Visualiser spaltningsproduktene etter elektroforese ved autoradiografi.
6. Representant Resultater
Et eksempel av RNA substrater for analyse av Cas endonuklease aktivitet er vist i figur 3A. En alikvot av 5 ul av en analytisk 100 ul in vitro transkripsjon reaksjonen ble lastet. Vennligst merk at effektiviteten av RNA produksjonen varierer mellom ulike konstruksjoner. Noen faktorer tlue ble observert å påvirke mengden av utvunnet RNA er (i) den første sekvensen etter en G kreves for transkripsjon initiering, (ii) muligheten for RNA struktur formasjon under transkripsjon og (iii) valg av restriksjonssete for generering av avrenningen cleavage posisjon.
Etterforskningen av RNA endonuclease aktivitet krever både høyt renset rekombinant Cas proteiner (Fig. 3B) og riktig negative kontroller. Ideelt sett skiller denne negative kontrollprøve så lite som mulig fra den undersøkte Cas endonuclease reaksjon. Dette kan oppnås ved inkubering av RNA med reaksjonsbuffer og celle-lysat uten Cas uttrykk (og følge den identiske rensing prosedyre). En ideell negativ kontroll er tillegg av en deoksyribonukleotid på de foreslåtte spaltningssete. I figur 3C, er spaltningen av en 5 'terminal merket repetisjonssekvensen vist for Clostridium thermocellum CAS-6. Under identiske betingelser, er dette ikke et substrat gjenta lenger når en deoksyribonukleotid innføres i posisjon -9. Denne metoden tilveiebringer også informasjon om spaltningssete. Endelig, er en lang internt merket før crRNA spaltet ved CAS-6 og to kutteseter fragmenter observeres.
Figur 1. Skjematisk oversikt over CRISPR / Cas aktivitet. Oversikten følger innsetting av en viral DNA-sekvens (protospacer) inn i CRISPR klyngen (tilpasning), transkripsjon og prosessering av CRISPR matrisen i små crRNAs av en CAS-6 endonuklease, opptaket av crRNAs inn Cascade komplekse og forstyrrelser av en gjentatt viral angrep basert på komplementaritet mellom crRNA og protospacer. Protospacer tilstøtende motiver (PAM) mark viral protospacer sekvenser.
igur 2 "src =" / files/ftp_upload/4277/4277fig2.jpg "/>
Figur 2. Generasjon av RNA underlag for Cas proteiner. Ordningen viser arbeidsflyten for generering (A) long pre-crRNA substrater, (B) mellomprodukt før crRNA substrater og (C) kort Cas RNA substrater for pre-crRNA produksjon. Eksempel sekvenser presenteres for CRISPR rekke Clostridium thermocellum. Klikk her for å se større figur .
Figur 3. CAS-6 endonuclease analysen. A.) toluidinblått farget polyakrylamidgel fra et spesialdesignede RNA oligonukleotid (250 pmol) og to in vitro RNA transkripter (5 pl av en typisk 100 ul reaksjon). B.) SDS-PAGE gel av en CAS-6 preparat (80 pmol) fra Clostridium thermocellum etter varmealdringutfelling ved 50 ° C i 1 time og Ni-NTA kromatografi. C.) Påvisning av endonucleolytic CAS-6 aktivitet for 5 'terminal merket repeterte sekvenser og pre-crRNA in vitro transkripsjoner. Innføringen av en dNTP i posisjon -9 avskaffer CAS-6 spalting for en kort Cas RNA substrat (S, fig. 2C). En 5 'terminal 8 nt tag er generert for crRNA modning fra lang pre-crRNA underlag (L, fig. 2A). Båndene ble separert på en denaturerende 8 M urea 12% polyakrylamidgel og visualisert ved autoradiografi.
Discussion
De presenterte metoder aktivere generasjon av Cas endonuclease underlag av forskjellige størrelse varierer og med varierende frihet i rekkefølge design. Den mest rett-frem tilnærming for generering av syntetiske RNA oligonukleotid underlag er begrenset til korte RNA design på grunn av økende kostnader og tekniske begrensninger i å skape lengre RNA oligomerer. Mens vellykket RNA syntese har blitt rapportert for umodifiserte RNA oligomerer av over 100 nukleotider lengde, ligger praktisk og økonomisk maksimum for tilpassede RNA syntese under 40 nukleotider. Imidlertid kan enhver sekvens bli syntetisert og målrettet innføring av modifiserte nukleotider (f.eks deoksyribonukleotider) kan benyttes til å analysere kutteseter i detalj. Lengre pre-cRNAs skal genereres via in vitro transkripsjon.
Hybri av oligonukleotider som inneholder en T7 RNA polymerase promoter tillater for produksjon av mellomliggende lengde før CRRNSom. Den maksimale lengden på rutinemessig og økonomisk syntetiserte DNA-oligonukleotider er like over 150 nukleotider og representerer den maksimale av syntetiske pre-crRNAs via denne metoden. Sammenstillingen av flere annealed DNA oligonukleotid parene som danner klebrige ender med hverandre kan utvide denne maksimal lengde men nødvendiggjør økende utfordringer i kloning av konstruksjonen. Den største fordelen med denne metoden er evnen til å generere pre-crRNA konstruerer (og derfor Cas endonuklease substrater) med hvilken som helst ønsket sekvens. Dette tillater testing av syntetiske crRNA motiver.
Endelig kan større pre-crRNAs fås fra PCR amplificates av hele genom CRISPR elementer eller fraksjoner. Endringer på in vitro transkripsjon mal plasmid kan innføres via seterettet mutagenese for generering av pre-crRNA varianter. Disse konstruksjoner kan brukes til å analysere den globale endonucleolytic cleavage mønster innenfor en helpre-crRNA.
Den pionerarbeid for produksjon av umodifisert RNA via T7 RNA polymerase in vitro transkripsjon ble basert på overføring RNA 14 og brome mosaikk virus RNA 15. Konsensus T7 RNA polymerase promotor består av en anerkjennelse domene (-17 gjennom -5) og en initiering domene (-4 gjennom 6) med transkripsjon initiering ved en essensiell guanosin en 16. Positions nedstrøms en kan varieres som tillater transkripsjon av nesten hvilket som helst ønsket RNA sekvensen. De presenterte metoder for å generere in vitro avrenning transkripsjon maler tillate in vitro syntese av komplette pre-crRNAs som svarer genomisk CRISPR regioner eller syntetiske pre-crRNA varianter. Transkripsjonene er generert med en 5'-terminal trifosfat til stede med mindre transkripsjon reaksjonen er primet med GMP å skaffe 5 'monofosfat termini 14. Slike termini er nødvendig dersom transkripsjoner skal merkesmed T4 polynukleotid-kinase og γ-[32 P]-ATP. Cleavage aktivitet av CAS-6 og CAS-6-lignende enzymer genererer crRNA som inneholder 5'-hydroksyl og en 2 ', 3'-cykliske fosfat termini. Disse RNAer kan deretter analyseres for anerkjennelse av Cascade komplekset.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke Jeanette Schermuly for utarbeidelse av rekombinant T7 RNA polymerase og Norman Ebelt for bistand i utarbeidelse Figur 1. Dette arbeidet ble finansiert av midler fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG FOR1680) og Max Planck Society.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antarctic Phosphatase | NEB | M0289L | |
| in vitro Transcription Grade Ultrapure Nucleotide Triphosphates | Jena Bioscience | NU-1010 - NU-1013 | |
| Liquid chromatography, ktapurifier 100 | GE Healthcare | ||
| DNA oligonucleotides | MWG Operon | ||
| RNA oligonucleotides | MWG Operon | ||
| Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
| PCR purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
| Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27106 | |
| Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12163 | |
| BamHI | NEB | R0136L | |
| HindIII | NEB | R0104L | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| T4 Polynucleotide Kinase | Ambion | AM2310 | |
| T7 RNA Polymerase | own preparation | ||
| Deoxynucleotide Solution Mix | NEB | N0447L | |
| Mini-PROTEAN Tetra Electrophoresis System | Bio-Rad | 165-8001 | |
| Storm 840 Scanner | GE Healthcare | 163723 | |
| Storage Phosphorscreen | Molecular Dynamics | 63-0034-81 | |
| Mono Q 5/50 GL | GE Healthcare | 17-5166-01 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530L | use the GC buffer |
| Toluidine Blue | Sigma | T3260 | |
| pUC19 | NEB | N3041S | |
| γ-[32P]-ATP, α-[32P]-ATP | Hartmann Analytic | SRP-401, SRP-307 |
References
- Barrangou, R. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science. 315, 1709-1712 (2007).
- Makarova, K. S., Grishin, N. V., Shabalina, S. A., Wolf, Y. I., Koonin, E. V. A putative RNA-interference-based immune system in prokaryotes: computational analysis of the predicted enzymatic machinery, functional analogies with eukaryotic RNAi, and hypothetical mechanisms of action. Biol. Direct. 1, 7 (2006).
- Lillestøl, R. K., Redder, P., Garrett, R. A., Brugger, K. A putative viral defence mechanism in archaeal cells. Archaea. 2, 59-72 (2006).
- Makarova, K. S. Evolution and classification of the CRISPR-Cas systems. Nat. Rev. Microbiol. 9, 467-477 (2011).
- Brouns, S. J. Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes. Science. 321, 960-964 (2008).
- Carte, J., Pfister, N. T., Compton, M. M., Terns, R. M., Terns, M. P. Binding and cleavage of CRISPR RNA by Cas6. RNA. 16, 2181-2188 (2010).
- Haurwitz, R. E., Jinek, M., Wiedenheft, B., Zhou, K., Doudna, J. A. Sequence- and structure-specific RNA processing by a CRISPR endonuclease. Science. 329, 1355-1358 (2010).
- Gesner, E. M., Schellenberg, M. J., Garside, E. L., George, M. M., Macmillan, A. M. Recognition and maturation of effector RNAs in a CRISPR interference pathway. Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 688-692 (2011).
- Carte, J., Wang, R., Li, H., Terns, R. M., Terns, M. P. Cas6 is an endoribonuclease that generates guide RNAs for invader defense in prokaryotes. Genes Dev. 22, 3489-3496 (2008).
- Wiedenheft, B. Structures of the RNA-guided surveillance complex from a bacterial immune system. Nature. 477, 486-489 (2011).
- Garneau, J. E. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468, 67-71 (2010).
- Sinkunas, T. Cas3 is a single-stranded DNA nuclease and ATP-dependent helicase in the CRISPR/Cas immune system. EMBO J. 30, 1335-1342 (2011).
- Jahn, M. J., Jahn, D., Kumar, A. M., Söll, D. Mono Q chromatography permits recycling of DNA template and purification of RNA transcripts after T7 RNA polymerase reaction. Nucleic Acids Res. 19, 2786-2787 (1991).
- Sampson, J. R., Uhlenbeck, O. C. Biochemical and physical characterization of an unmodified yeast phenylalanine transfer RNA transcribed in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 1033-1037 (1988).
- Dreher, T. W., Bujarski, J. J., Hall, T. C. Mutant viral RNAs synthesized in vitro show altered aminoacylation and replicase template activities. Nature. 311, 171-175 (1984).
- McGinness, K. E., Joyce, G. F. Substitution of ribonucleotides in the T7 RNA polymerase promoter element. J. Biol. Chem. 277, 2987-2991 (2002).
