Summary
Bakteri ve Archaea yılında CRISPR / Cas sistemleri aracılık adaptif bağışıklık. Birçok Cas proteinlerin uzunluğu değişen crRNA öncüllerinin hareket endoribonucleases olarak hareket etmek önerilmektedir. Burada Cas endonuclease aktivitesinin biyokimyasal analiz için önceden crRNA yüzeyler oluşturmak için üç farklı yaklaşımlar sergiler.
Abstract
Virüsler ve prokaryotik ana etkileşim bakteri ve arke yaşamın evrimini şekillendirdi. Prokaryotlar restriksiyon modifikasyon, başarısız enfeksiyon ve CRISPR / Cas sistemlerini içerir viral saldırılardan kaçınmak için çeşitli stratejiler geliştirilmiştir. C i s hort p alindromic r EPEAT (CRISPR) dizileri ve sociated (Cas) genler olarak C RISPR bir dizi (Şekil 1) 1-3 nterspaced egularly r lüsterli birçok bakteri ve en Archaea bulunan bu adaptif bağışıklık sistemi oluşur. Cas proteinler ve tekrarları farklı setleri CRISPR / Cas sistemleri 4 en az üç büyük farklı türlerini tanımlar. Evrensel proteinler Cas1 ve Cas2 viral DNA almasında rol aldığı öne eminuzayan CRISPR küme 5, 5 'terminalinde iki tekrarlar arasında yeni bir ayırıcı eleman oluşturur. Tüm küme tüm boşluk ve tekrar dizileri içeren bir prekürsör-crRNA dönüştürüldü ve daha sonra küçük crRNAs 6-8 içine farklı Cas6 ailesinin bir enzim tarafından işlenir. Bu crRNAs bir 5 'terminal (8 nükleotidler) ve bir 3' Tekrar dizisi 9 türetilmiş uç etiket ile takviye boşluk sekans içerir. Yeni crRNA viral DNA için Cas protein kompleksi (Cascade) yönettiği ve taban tamamlayıcılık 10 üzerinden bu tür olarak tanımlamak olacak gibi virüsün yinelenen A enfeksiyonu artık bloke edilebilir. Nihayet, CRISPR / Cas tip 1 sistemleri için, nükleaz CAS3 tespit işgalci DNA 11,12 yok edecektir.
Bu süreçler prokaryot bir adaptif bağışıklık sistemi gibi CRISPR / Cas tanımlamak ve tutulan Cas proteinlerin çalışması için büyüleyici bir araştırma alanı açıldı.Birçok Cas proteinlerin fonksiyonu hala zor olduğunu ve CRISPR / Cas sistemlerinin belirgin çeşitlilik için nedenleri aydınlatılmaya kalır. Çoğu Cas proteinlerin Potansiyel faaliyetleri detaylı hesap analizleri ile tahmin edilmiştir. Cas proteinlerin önemli bir kısmını Görüntülenen veya 4 endonükleazları olarak işlev önerilmiştir.
Burada, Cas endoribonucleases çalışma için crRNAs ve öncü-cRNAs oluşturmak için yöntemler sunuyoruz. Farklı endonükleaz deneyleri doğrudan RNA oligonükleotidler veya run-off transkripsiyon vitro T7 RNA polimeraz aracılığıyla oluşturulan uzun crRNA ve pre-crRNA dizileri olarak sentezlenmiş olabilir ya kısa tekrar dizileri gerektirir. Bu metodoloji dahili etiketli endonükleaz yüzeylerde ve sentetik veya mutant crRNAs oluşturulması nesil için radyoaktif nükleotidlerin birleşme sağlar. Cas6 endonükleaz etkinliği 5'-hidr crRNAs ile içine önceden crRNAs olgunlaşması için kullanılmaktadıroksil ve bir 2 ', 3'-siklik fosfat termini.
Protocol
1. PCR ile uzun ön crRNA substratların Nesil
- Bir CRISPR küme boşluk bölgeleri hedefleyen Tasarım PCR primerleri. T7 RNA polimeraz ekleme klonlanması için ileri primer ve kısıtlama siteleri (T7RNAP) promoter sekansı (5 '-taatacgactcactata-3') iki astarın (pUC19 için örneğin, BamHI ve Hind III, Şek. 2A) bir vektör içine PCR ürünü .
Not: T7RNAP transkripsiyonun başlatılması için uygun bir guanidin kalıntı gerektirir. - PCR ile genomik DNA ilgi öncesi crRNA dizisi Amplify.
- Agaroz jel elektroforezi ile PCR ürünleri ayırın ve jel istenen bant ayıklayın. Yapışkan uçları (örneğin, BamHI ve HindIII, Şek. 2A) oluşturmak için sınırlama enzimleri ile sindirmek PCR ürünü. Yan ürünler bölünme ortadan kaldırmak için, bir PCR arıtma kiti ile PCR ürünü, üzerine koyulmuştur.
- Bir T4 DNA ligaz içerir ligasyon reaksiyonu, T4 DNA ligaz tamponu ve kurmayarılan PCR ürünü ve karşılık gelen yapışkan uçları dephosphorylated doğrusal pUC vektörünün bir molar oranı 3:1. 16 ° C'da gece boyunca karışım inkübe edin. Standart protokoller tarafından yetkili Escherichia coli DH5α hücrelerine ligasyon karışımı Dönüşümü ve başarılı ligasyonu tanımlamak için mavi beyaz tarama kullanın.
- Bir plazmid hazırlık seti kullanarak beyaz kolonilerden plazmid izole edin. Plazmid sekanslamasıyla pozitif klonları tanımlamak. Alternatif olarak, koloni PCR ile tarama için kullanılabilir olabilir.
2. DNA oligonükleotidler tavlama yoluyla orta öncesi crRNA substratların Nesil
- İleri Tasarım ve istenilen CRISPR tekrarlama / boşluk dizisi ile oligonükleotidler tersine. Oligonükleotidler bir T7 promotörü RNAP hem de uç kısıtlama siteleri (pUC19 için örneğin, BamHI ve Hind III) 'ün sekansı içerir. (Bkz. Şek. 2B Tavlama sonrası bu yapışkan uçları formu sağlamak için oligonükleotidler Terminate
- T4 polinükleotid kinaz 5 ul (PNK), T4 PNK 10x tampon, 2 ul ATP (10 mM) ve 2 ul ihtiva eden bir ayrı 20uL reaksiyon bölgesindeki her bir oligonükleotid 5'-fosforile 1 nmol. 37 de 1 saat için her bir örnek inkübe ° C.
- İki fosforile oligonükleotidler melezleşme. Fosforlu ileri oligo karışımı (2.2)., Fosforlu ters oligo karışımı (2.2)., Bir 10 ul reaksiyon 10x T4 DNA ligaz tamponu 1 ul 1 ul 1μl birleştirin. 95 az 5 dakika süreyle örneklerin inkübe ° bir ısıtma bloğu veya kaynar suda C, ısı kaynağını kapatın ve oda sıcaklığında (~ 2-3 saat) aşağı karışımı soğumaya bırakın.
Not: Bu kritik adımda, yavaş soğutma işlemi her biri tek bir oligonükleotid içindeki yapıların oluşumu ile karşılaştırıldığında, iki oligonükleotidlerin tavlanması yanadır. - Sindirilir ve dephosphorylated pUC vektör 1μl hibridizasyon karışımı 4 ul, (Arter 0.1 mikrogram /T4 DNA ligazı, 10x T4 DNA ligaz tampon ve bir 20 mikrolitre ligasyon karışımı içinde, 10 mM ATP) ile ul. 16 ° C'da gece boyunca numune inkübe edin.
- Standart protokoller tarafından yetkili Escherichia coli DH5α hücrelerine bağlanan plazmid Dönüşümü ve mavi beyaz tarama kullanır. Plazmid izole ve sindirim (istenilen büyüklükte uçlar için ekrana) ve sonraki plazmid sekanslamasıyla pozitif klonları tanımlamak.
3. Özel RNA oligonükleotid sentezi yoluyla kısa Cas RNA substratların Nesil
Tasarım kısa Cas RNA yüzeylerde (örn. tek tekrar dizileri, Şek. 2C) ve özel RNA oligonükleotid sentezi imkanları kullanmaktadır.
Not: RNA oligonükleotid belirtilen bir pozisyonu (Şekil 2C) bir deoksiribonükleotid dahil edilmesi, RNA bölünme yerinde kesin olarak belirlemek için kullanılabilir.
4. In vitro T7 RNA polimeraz transkripsiyon
- Senin tasarlanmış yapı (1.9. Veya 2.7 'den.) Bir maxiprep plazmid saflaştırma kiti kullanılarak plazmid izole edin.
- Klonlanmış parçası (örneğin Hind III) akış aşağı parçalayarak kısıtlama enzimi ile linearize plazmid. Tam sindirim olun.
Not: RNA transkriptinin farklı tanımlanmış bir 3 'terminaline istenirse, tasarlanmış bir yapı HindIII sekans yukarı akış yönünde "run-off" transkripsiyon için ilave bir belirli sınırlandırma bölgesi içermelidir. - Kloroform (1:1) ekstraksiyon ve etanol yağış: lineerleştirilebilir fenol plazmid arındırın. DEPC işlenmiş steril suda pelet resuspending göre nükleik asitler kurtarma.
- In vitro T7 RNAP içinde bir 40 mM Hepes / KOH (pH 8), 22 mM MgCl2, 5 mM ditiotreitol, 1 mM spermidin, her bir nükleosit trifosfat 4 mM (ATP, CTP, GTP, UTP içeren transkripsiyon karışım kapalı çalışır ayarlama ), 40-100 ug / ml arasında sindirilmişplazmid ve DEPC işlenmiş su içinde 0.1 mg / ml T7 RNAP. 37 C'de 3 saat için inkübe ° C.
- Bir 8 M üre denatüre% 12 poliakrilamid jel (Şekil 3A) üzerinde elde edilen RNA transkriptleri analiz edin. RNA transkriptleri Mono Q anyon değişim kromatografisi yolu ile saflaştırıldı ve 13 DEPC işlenmiş steril suda RNA fraksiyonu ve pelet yeniden süspanse edilmesi ve etanol çökeltme ile geri kazanılabilir. Gelecekte kullanılmak üzere -80 ° C'de saklayın RNA
5. Cas6 endonükleaz tahlil
- Bir ayarlama Vitro T7 RNAP 20 ul 2 mM ATP azaltılmış miktarda içerir ve ile tamamlanmaktadır (4.4) transkripsiyon karışımı kaçıp 2.5 ul α-[32 P]-ATP (10 mCi / ml, 5000 Ci / mmol). Bir denatüre edici 8 M üre,% 12 poliakrilamit jel arasından jel çıkarma yolu ile reaksiyon ürünleri, temizler. Otoradyografi bantları gözünüzde canlandırın.
- İstediğiniz rekombinant Cas proteinler üretin ve arındırmak. Bu örnekte, CClostridium thermocellum dan AS6 ısı çökeltme ve Ni-NTA kromatografi yolu ile saflaştınldı.
- Clostridium thermocellum Cas6 için bir endonükleaz tahlil reaksiyon (örneğin ayarlama, reaksiyon karışımı, 20 mM Hepes (KOH PH8), 250 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM DTT, 12,000 cpm RNA alt tabaka ve 1 uM enzim içeren ve inkübe edildi 37 ° C'de 30 dakika süre ile).
- 8 M üre, bir% 12 poliakrilamid jel üzerinde reaksiyon karışımı (% 95 formamit ihtiva eden 10 ul + RNA, yükleme tamponu) 5 ul yerleştirin. Otoradyografi elektroforez sonrası parçalanma ürünleri gözünüzde canlandırın.
6. Temsilcisi Sonuçlar
Cas endonükleaz etkinliği analizi için substrat RNA'nın bir örneği Şekil 3A'da gösterilmiştir. In vitro transkripsiyon reaksiyonunda bir analitik 100 ul 5 ul lik bir örnek yüklendi. RNA üretim verimliliğini Farklı yapıları arasındaki farklılık gösterebileceğini unutmayın. Bazı faktörler tşapka transkripsiyon başlatma için gereken +1 G, transkripsiyon sırasında RNA yapı formasyonu (ii) olasılığı ve üretim için sınırlama alanı (iii) aşağıdaki tercih olup elde edilen RNA miktarı, (i) ilk sıra etki gözlenmiştir run-off bölünme pozisyonunun.
RNA endonükleaz aktivite incelemesi hem yüksek oranda saflaştırılmış rekombinant Cas proteinler (Şekil 3B) ve uygun negatif kontroller gerektirir. İdeal olarak, bu negatif kontrol örneği incelenmiştir Cas endonükleaz reaksiyon mümkün olduğunca az farklıdır. Bu ifade Cas (ve aynı arıtma prosedürü izleyerek) olmadan reaksiyon tamponu ve hücre lizatı ile RNA inkübasyon yoluyla elde edilebilir. İdeal bir negatif kontrol önerilen bölünme sitesinin bir deoksiribonükleotid bir eklenmesidir. Şekil 3C, bir 5 'terminal tekrarı etiketli dizisinin bölünme Clostridium thermocellum Cas6 için gösterilir. Altında aynı koşullar, bu tekrar bir deoksiribonükleotid, -9 pozisyonunda tanıtıldıktan sonra artık bir substrat değildir. Bu yöntem aynı zamanda bölünme sitesinin ilgili bilgi sağlar. Son olarak, bir uzun içten etiketli ön crRNA Cas6 ile parçalanır ve iki yarılma parçaları görülmektedir.
CRISPR / Cas aktivitesi Şekil 1. Şematik gösterimi. Genel CRISPR küme (adaptasyon), bir Cas6 endonükleaz ile küçük crRNAs içine CRISPR dizi transkripsiyonu ve işleme, Cascade kompleksi içine crRNAs alımını ve müdahalesi bir viral DNA dizisi (protospacer) yerleştirilmesini takip crRNA ve protospacer arasındaki tamamlayıcılık esas viral saldırı tekrarladı. Protospacer bitişik motifler (PAM) işareti viral protospacer dizileri.
ŞEKIL 2 "src =" / files/ftp_upload/4277/4277fig2.jpg "/>
Şekil 2. Cas proteinleri RNA substratların Nesil. Düzeni (A) uzun ön crRNA substratlar, (B), orta ön crRNA alt tabakalar ve ön-crRNA üretimi için (C) kısa Cas RNA alt tabakalar üretmek için akışı gösterilmektedir. Örnek dizileri Clostridium thermocellum arasında CRISPR dizisi için sunulmuştur. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 3. Cas6 endonükleaz denemesi. A.) Toluidin blue ile boyanan poliakrilamid özel tasarlanmış RNA oligonükleotid (250 pmol) jel ve in vitro RNA transkriptleri (tipik 100 ul reaksiyon 5 ul) iki. Isı sonra Clostridium thermocellum bir Cas6 hazırlık (80 pmol) B.) SDS-PAGE jel1 saat ve Ni-NTA kromatografisi için 50 ° C de yağış. 5 'terminal etiketli tekrar sıraları ve in vitro transkriptleri ön crRNA için endonucleolytic Cas6 aktivitesi C) tespit eder. -9 Pozisyonunda bir dNTP tanıtımı kısa Cas RNA substratın (S, Şek. 2C) için Cas6 bölünme ortadan kaldırmaktadır. Bir 5 'terminal 8 nt etiketi de uzun ön crRNA substratlar (L, Şek. 2A) dan crRNA olgunlaşması için oluşturulur. Bantları denatüre 8 M üre% 12 poliakrilamid jel üzerinde ayrılmış ve otoradyografi ile görselleştirilmiş edildi.
Discussion
Sunulan yöntemler farklı boyut aralıkları Cas endonükleaz substratların oluşturmayı etkinleştirmek ve sıra tasarım özgürlüğü değişen. Sentetik RNA oligonükleotid substratların nesil için en düz ileri yaklaşım artık RNA oligomerler oluşturarak artan maliyetler ve teknik sınırlamalar nedeniyle kısa RNA tasarımları ile sınırlıdır. Başarılı RNA sentezi üzerinde 100 nükleotid uzunlukta değiştirilmemiş RNA oligomerleri için rapor edilmiş olsa da, özel RNA sentezi için pratik ve ekonomik azami altında 40 nükleotidler yatıyor. Ancak, herhangi bir sıra sentez edilebilir ve modifiye nükleotidler (örn. deoxyribonucleotides) ve hedeflenen giriş ayrıntılı olarak yarılma bölgeleri analiz etmek için kullanılabilir. Daha uzun ön cRNAs in vitro transkripsiyon kullanılarak oluşturulan olmalıdır.
Bir T7 RNA polimeraz promotörü içeren oligonükleotidler ara tavlama uzunluğu önceden crRN üretimi için olanak sağlarGibi. Rutin olarak ve ekonomik olarak sentezlenmiş oligonükleotid DNA'nın maksimum uzunluğu sadece 150 nükleotid üzerinde ve bu yöntem vasıtasıyla sentetik ön crRNAs azami temsil eder. Birbirleri ile yapışkan uçları oluştururlar birkaç tavlı DNA oligonükleotid çiftleri düzeneği bu maksimal uzatmak ancak yapının klonlama artan zorlukları zorunlu olabilir. Bu yöntemin başlıca avantajı, herhangi bir istenen sırada ile ön crRNA yapıları (ve bu nedenle Cas endonükleaz substrat) oluşturmak için yeteneğidir. Bu sentetik crRNA tasarımları test yapılmasını sağlar.
Son olarak, daha büyük bir ön crRNAs bunların tüm genomik CRISPR elemanları ya da fraksiyonları PCR amplificates elde edilebilir. In vitro transkripsiyon plasmidi şablon olarak değişiklikler için önceden crRNA varyantlarının üretilmesi için site-yönlendirmeli mütajenez yoluyla sokulabilir. Bu yapı, bir bütün içinde küresel endonucleolytic bölünme kalıp analiz etmek için de kullanılabilirön crRNA.
In vitro transkripsiyon içinde T7 RNA polimeraz aracılığıyla değiştirilmemiş RNA üretimi için öncü çalışma devri RNA'lar 14 ve brom mozaik virüs RNA 15 dayanmaktadır. Uzlaşma T7 RNA polimeraz promotörü bir tanıma alanı (-5 ile -17) ve önemli bir guanozin +1 16 de transkripsiyon başlangıcı olan bir inisiyasyon alanı (+6 aracılığıyla -4) oluşmaktadır. +1 Pozisyonlar akış hemen hemen arzu edilen herhangi bir RNA sekansının transkripsiyon olanak sağlayan çeşitli olabilir. In vitro transkripsiyon akıntısı oluşturmak için şablon olarak sunulan yöntemler CRISPR genomik bölge ya da sentetik ön crRNA türevleri neticesinde komple bir ön-crRNAs in vitro sentezi için izin verir. Transkripsiyon reaksiyonu 5 'monofosfat termini 14 elde etmek için GMP ile astarlanmalıdır sürece dökümleri 5'-terminali trifosfat mevcut oluşturulur. Transkript etiketli isteniyorsa, bu tür termini gerekmektedirT4 polinükleotid kinaz ve γ-[32 P]-ATP. sahip Cas6 ve Cas6-benzeri enzim aktivitesi Yarılma 5'-hidroksil ile bir 2 ', 3'-siklik fosfat termini ihtiva crRNA oluşturur. Bu RNA'lar sonra Cascade kompleksi tarafından tanınması için analiz edilebilir.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Yazarlar, rekombinant T7 RNA polimeraz ve Şekil 1 türlerinin hazırlanması için Norman Ebelt hazırlanması için Schermuly Jeanette teşekkür ederiz. Bu çalışma Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG FOR1680) ve Max Planck Topluluğu fonları tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antarctic Phosphatase | NEB | M0289L | |
| in vitro Transcription Grade Ultrapure Nucleotide Triphosphates | Jena Bioscience | NU-1010 - NU-1013 | |
| Liquid chromatography, ktapurifier 100 | GE Healthcare | ||
| DNA oligonucleotides | MWG Operon | ||
| RNA oligonucleotides | MWG Operon | ||
| Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
| PCR purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
| Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27106 | |
| Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12163 | |
| BamHI | NEB | R0136L | |
| HindIII | NEB | R0104L | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| T4 Polynucleotide Kinase | Ambion | AM2310 | |
| T7 RNA Polymerase | own preparation | ||
| Deoxynucleotide Solution Mix | NEB | N0447L | |
| Mini-PROTEAN Tetra Electrophoresis System | Bio-Rad | 165-8001 | |
| Storm 840 Scanner | GE Healthcare | 163723 | |
| Storage Phosphorscreen | Molecular Dynamics | 63-0034-81 | |
| Mono Q 5/50 GL | GE Healthcare | 17-5166-01 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530L | use the GC buffer |
| Toluidine Blue | Sigma | T3260 | |
| pUC19 | NEB | N3041S | |
| γ-[32P]-ATP, α-[32P]-ATP | Hartmann Analytic | SRP-401, SRP-307 |
References
- Barrangou, R. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science. 315, 1709-1712 (2007).
- Makarova, K. S., Grishin, N. V., Shabalina, S. A., Wolf, Y. I., Koonin, E. V. A putative RNA-interference-based immune system in prokaryotes: computational analysis of the predicted enzymatic machinery, functional analogies with eukaryotic RNAi, and hypothetical mechanisms of action. Biol. Direct. 1, 7 (2006).
- Lillestøl, R. K., Redder, P., Garrett, R. A., Brugger, K. A putative viral defence mechanism in archaeal cells. Archaea. 2, 59-72 (2006).
- Makarova, K. S. Evolution and classification of the CRISPR-Cas systems. Nat. Rev. Microbiol. 9, 467-477 (2011).
- Brouns, S. J. Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes. Science. 321, 960-964 (2008).
- Carte, J., Pfister, N. T., Compton, M. M., Terns, R. M., Terns, M. P. Binding and cleavage of CRISPR RNA by Cas6. RNA. 16, 2181-2188 (2010).
- Haurwitz, R. E., Jinek, M., Wiedenheft, B., Zhou, K., Doudna, J. A. Sequence- and structure-specific RNA processing by a CRISPR endonuclease. Science. 329, 1355-1358 (2010).
- Gesner, E. M., Schellenberg, M. J., Garside, E. L., George, M. M., Macmillan, A. M. Recognition and maturation of effector RNAs in a CRISPR interference pathway. Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 688-692 (2011).
- Carte, J., Wang, R., Li, H., Terns, R. M., Terns, M. P. Cas6 is an endoribonuclease that generates guide RNAs for invader defense in prokaryotes. Genes Dev. 22, 3489-3496 (2008).
- Wiedenheft, B. Structures of the RNA-guided surveillance complex from a bacterial immune system. Nature. 477, 486-489 (2011).
- Garneau, J. E. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468, 67-71 (2010).
- Sinkunas, T. Cas3 is a single-stranded DNA nuclease and ATP-dependent helicase in the CRISPR/Cas immune system. EMBO J. 30, 1335-1342 (2011).
- Jahn, M. J., Jahn, D., Kumar, A. M., Söll, D. Mono Q chromatography permits recycling of DNA template and purification of RNA transcripts after T7 RNA polymerase reaction. Nucleic Acids Res. 19, 2786-2787 (1991).
- Sampson, J. R., Uhlenbeck, O. C. Biochemical and physical characterization of an unmodified yeast phenylalanine transfer RNA transcribed in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 1033-1037 (1988).
- Dreher, T. W., Bujarski, J. J., Hall, T. C. Mutant viral RNAs synthesized in vitro show altered aminoacylation and replicase template activities. Nature. 311, 171-175 (1984).
- McGinness, K. E., Joyce, G. F. Substitution of ribonucleotides in the T7 RNA polymerase promoter element. J. Biol. Chem. 277, 2987-2991 (2002).
