Tissue Engineering af tarmen i en murin model

Summary

Denne artikel og den ledsagende video præsentere vores protokol for frembringelse tissue-engineered tarmen hos mus under anvendelse af en organoid enheder-on-skelet fremgangsmåde.

Abstract

Tissue-engineered tyndtarmen (Tesi) har med held blevet anvendt til at redde Lewis-rotter efter massiv resektion af tyndtarmen, hvilket medfører tilbagevenden til præoperative vægte inden for 40 dage. ^En Hos mennesker kan massiv resektion af tyndtarmen resultere i korttarmssyndrom, en funktionel malabsorptive stat, der giver høj sygelighed, dødelighed og udgifter til sundhedsvæsenet, herunder parenteral ernæring afhængighed, leversvigt og skrumpelever, og behovet for multivicerale organtransplantation. ² I dette papir, vi beskrive og dokumentere vores protokol for at skabe væv-manipuleret tarmen i en musemodel med en multicellulær organoid enheder-on-skelet fremgangsmåde. Organoid enheder er flercellede aggregater stammer fra tarmen, der indeholder både mucosale og mesenchymal elementer, ³ forholdet mellem der bevarer den intestinale stamceller niche. ⁴ I igangværende og fremtidige forskning, overgangen fra vores teknik tilmus vil give mulighed for undersøgelse af de processer, der er involveret i løbet af Tesi dannelse ved at udnytte de transgene tilgængelige værktøjer i denne art. ⁵ Tilgængeligheden af immunkompromitterede musestammer vil også tillade os at anvende teknikken til menneskelig tarmvæv og optimere dannelsen af menneskelig Tesi som en mus xenograft før dens overgang til mennesker. Vores metode anvender god fremstillingspraksis (GMP) reagenser og materialer, der allerede er godkendt til brug i humane patienter, og derfor giver en betydelig fordel i forhold til tilgange, der er baseret på decellulariseret dyrevæv. Det endelige mål med denne metode er dens translation til mennesker som en regenerativ medicin terapeutisk strategi for korttarmssyndrom.

Protocol

1. Organoid Units Forberedelse

1. Instrumenter egnede til muse-dissektion (saks og pincet) bør steriliseres ved autoklavering.
2. Humant aflive donormus efter lokale IACUC protokoller. Sørg for, at dyret er dødt, før du fortsætter.
3. Foretag en midtlinjeincision for at få adgang til bughulen. Hudlapper kan reflekteres efter behov for at forbedre eksponering.
4. Eviscerate tyndtarmen og dividere det bare distalt for ligament af Treitz. Adskil tyndtarmen fra sit mesenterium med skarp og blid stump dissektion. Identificer ileocecal krydset og opdele tyndtarmen 5 mm proksimalt i forhold til dette.
5. Med en saks, åbne tarmen på langs langs den antimesenteric kant i en petriskål med 10 ml 4 ° C, steril Hanks-pufret saltopløsning (HBSS, Invitrogen, Carlsbad CA) / 1X antibiotika-antifungal (Anti-Anti, Invitrogen) opløsning. Ryd fækalt materiale fra den åbnede tarmen medforsigtig omrøring derefter overføre åbnet tarmen til et 15 ml centrifugerør med 10 ml 4 ° C, sterile HBSS / 1X anti-anti.
6. Vask den åbnede tarmen tre gange i 10 ml 4 ° C, sterile HBSS / 1X anti-anti i et reagensglas. Hver vask kan udføres med mild omrystning i 15 ml rør i 30 sek. Efter omrystning synker tarmvævet til bunden af ​​røret. Kassér flydende materiale, som er mesenchymale debris. Fjern vaskeopløsningen forsigtigt med en pipette.
7. Hakkekød det vaskede tarmen i en petriskål med 10 ml 4 ° C, sterile HBSS / 1X anti-anti på mindre end 1 mm kvadratiske stykker med en saks. Saml det hakkede materiale op med en automatisk pipette og læg det i et reagensglas.
8. Centrifuger røret ved 500 rpm i 8 min. Supernatanten fjernes, som indeholder fedt og mesenkym.
9. Fordøje den hakkede, vaskede materiale med 10 ml sterile HBSS / 1X anti-anti plus 0,125 mg / ml dispase (Invitrogen) og 800 enheder / ml collagenase type 1 (Worthington, Lakewood NJ). Til fremstilling af 40 ml af fordøjelsen opløsningen afvejes 5 mg dispase, 142 mg collagenase, og tilføje sterile HBSS op til et volumen på 40 ml. Denne opløsning fremstilles frisk hver gang organoid enheder er forberedt, og holde ved 4 ° C, indtil klar til brug. Tilsæt fordøjelsen opløsningen direkte til pellet fra trin 1.8.
10. Inkuber reagensglasset indeholdende det hakkede, vaskede materiale med fordøjelsen opløsning ved 37 ° C i 20 minutter.
11. Hente reagensglasset og yderligere forstyrre det fordøjede væv ved triturering med en 10 ml pipette. Gentag mellem 20 til 50 gange, indtil et ensartet udseende opnås.
12. Centrifugeres reagensglasset i 5 minutter ved 800 rpm. Supernatanten fjernes, som indeholder enkeltceller.
13. Stop fordøjelse omsætning med 10 ml 4 ° C, sterile Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM, Invitrogen) plus 10% v / v varmeinaktiveret føtalt bovint serum (HI-FBS, Invitrogen). Resuspender Pellet og ryste røret.
14. Centrifugeres reagensglasset i 5 minutter ved 800 rpm. Supernatanten fjernes forsigtigt med en automatisk pipette til de sidste dråber. Brug en engangs plastik pipette for de sidste få dråber for at undgå genopslæmning af pelleten.

2. Lastning af polyglycolsyre Scaffold

1. Form 2-mm, 5 mm ydre diameter cylindriske stilladser fra vævet polyglycolsyre (2-mm pladetykkelse, 60 mg cm-3 rumvægt, porøsitet> 95%, Concordia Fibers, Coventry RI) som beskrevet i ref. 4.
2. Trimme den distale 2 mm af en engangs 1000 mikroliter pipettespids med en saks fremstillet med 70% ethanol i destilleret vand.
3. Anbringe stilladset i en 4-brønds dyrkningsplade. Indlæse organoid enheder over på stilladset med 1.000 mikroliter pipette, først ind i hulrummet, og derefter på den udvendige overflade. Anvende en pincet til at sikre overtrækning af lumenet. Ikke forstyrrer eller bryde åbne den cylindriske form af polymeren.

   3. Implantation i værtsmusen

   1. Brug en syngen vært mus på samme baggrund som donor, hvis tilgængelig. Ellers ansætte en immunkompromitteret nonobese diabetiker / svær kombineret immundefekt eller NOD / SCID dyr (Jackson Laboratories, Sacramento CA).
   2. Fremkald generel anæstesi med isofluran. Shave, prep og drapere musens mave.
   3. Foretag en 5 mm midtlinjeincision for at få adgang til bughulen. Identificere og omhyggeligt eviscerate den større omentum. Placer den fyldte polymer på omentum og pak det med vævet. Må ikke rive omentum.
   4. Fastgør polymeren til omentum med 5-0 monocryl sutur. Forsigtigt erstatte omentum med den omviklede polymer i sin anatomiske placering.
   5. Lukke abdominal incision i lag med 4-0 Vicryl suturer. Kør muskel lukning og sørge for ikke at skade den indvolde fra bughulen under snittet. Brug afbrudte suturer til huden.
   6. Administrere postoperativ analgesi med 2 mg / kg ketoprofen (Ketofen, Fort Dodge Animal Health) i sterilt vand som en subkutan vabler støder op til incisionen. Dyr bør evalueres dagligt, og hvis dyret viser tegn på smerte eller lidelse, kan en yderligere dosis ketoprofen gives på postoperativ dag 2. Ved den tredje postoperative dag, bør dyret fuldstændigt dækket uden tegn på smerte og angst. Hvis smerte eller lidelse fortsætter på postoperativ dag 3, anses dette unormal og bør behandles i overensstemmelse med de IACUC og dyrs pleje facilitet protokoller.
   7. Tillad musen at komme sig og vævet-manipuleret tarmen til at vokse i fire uger. Give dyret ad libitum adgang til gnaverfoder (Lab Diet 5001, PMI Nutrition, St. Louis MO) og vand med Septra 200 mg / 40 mg per 5 ml (Hi-Tech Pharmacal, Amityville NY) ved 1:100 fortynding.

   4. Harvest

   1. Humanely aflive værtsdyret fire uger efter implantation.
   2. Genåbne den oprindelige snit, og afspejler huden cephalad at lette adgangen til bughulen.
   3. Åbn muskel lag og identificere væv-manipuleret konstruktion som en globus af væv.
   4. Tag ned adhærencer til konstruktionen fra intraabdominale indvolde hjælp skarp dissektion.
   5. Fastgør konstruktionen i formalin til senere paraffin montering eller bruge væv frisk til biokemiske assays, såsom real-time PCR eller protein isolation.

Representative Results

Figur 1 viser et samlet skema for protokollen dokumenteret her. Slutresultatet af denne protokol er en globus eller sfærisk struktur af vævs-engineering murint tarmen med et lumen, slimhinder, submucosa, og omgivende muscularis. Figur 2A viser en typisk globus i forhold til et udgangspunkt polymerskelet. Figur 2B viser den samme konstruktion kraftigt bivalved at afsløre dets lumen. Figur 3 viser et hematoxylin / eosin-stained paraffin-monteret tværsnit af en typisk vellykket konstruktion efter 4 ugers inkubation. I ref. 4, var vi i stand til at producere vævs-manipuleret tarmen held 89% af tiden (39 ud af 44 implantater).

En mislykket konstruktion er én, hvor ingen mucosa former. Det er umuligt at bedømme baseret på brutto udseende ved høst, om verden vil have slimhinde på den endelige histologisk analyse. Derfor, hvis biokemiske assays er performed på den friske konstruktion væv, bør halvdel af hver kloden fastsættes og paraffin monteret til histologisk analyse for at bekræfte, at slimhinden er til stede i hver prøve. Et mislykket konstruktion vil vise kun stroma og fibrose på hematoxylin / eosin-farvning.

Fig. 1. Skema til fremstilling af tissue-engineered tarmen hos mus. Kort fortalt er donorvæv høstes og forarbejdes til organoid enheder. De organoid enheder er sat på en porøs polyglycolsyre stillads, som derefter implanteres i en vært og inkuberet i 4 uger. Den konstruerede konstruktionen derefter hentes og kan karakteriseres ved hjælp af histologi eller biokemiske assays.

Figur 2. Eksempel på vævs-manipuleret tarmen konstruktion høstet efter 4 uger. A: Byg i virksomRison at starte polymerskelet. B: Det samme konstrukt, bivalved at afsløre dets lumen.

Figur 3. Energibesparende hematoxylin / eosin mikrofotografi af en typisk vellykket tissue-engineered tarm-konstruktionen. Etiketterne og pile viser lumen med tarmslimhinden og adhærerende host pancreas.

Discussion

Vi præsenterer en protokol til fremstilling af vævs-manipuleret tarmen hos mus ved hjælp af en organoid enheder-on-stillads tilgang. De mest kritiske trin er sådanne med organoid enheder præparatet. Der skal udvises forsigtighed for tilstrækkeligt rene og mekanisk behandle væv, men lige man skal passe på ikke at overdigest eller overtriturate de organoid enheder efter fordøjelsen udføres (trin 1,11). Hvis dette sker, kan de organoid enheder reduceres til enkelte celler, som kan gå tabt i supernatanten af ​​trin 1,12, og det er usandsynligt at overleve til at fremstille væv-manipuleret tarmen, ville da tarmens stamceller niche ikke bevares i dette tilfælde.

Den lille størrelse af muse gør det udfordrende at direkte anastomose af vævs-manipuleret konstruktion til værten dyrets tarme at teste dens funktion in vivo. Alternativt rotten repræsenterer en større model for Tesi vækst, der letter in vivo anastomose ogallerede er udført af denne grund ^1. Ikke desto mindre er størrelsen af musen er ikke en uoverstigelig hindring, som andre har været i stand til at udføre resektion af tyndtarmen og anastomose, ⁶ eller anorektal kirurgi, ⁷ i disse dyr. At løse disse problemer, eksperimenter at karakterisere funktionen af vores væv-manipuleret intestinale konstruktioner i en in vitro mode er i gang. Yderligere begrænsninger af denne teknik omfatter en 89% succes i dannelsen af Tesi ^4. Det vil sige, 89% af OU loaded scaffolds held generere Tesi. Anvendelsen af ​​denne teknik i andre kan hjælpe forfine og forbedre denne teknik øger det samlede udbytte på 100%. Desuden kan denne teknik kan forbedres, hvis det samlede væv genereret masse kan øges. I øjeblikket har flowcytometri viste, at det totale antal celler til stede i det høstede Tesi konstruktionen er 3 gange større end antallet til stede ved implantation(3,07 x 10 ⁶ ± 0,5 x 10 ^{6) 4.} Forbedring mængden af ​​Tesi produktion er et vigtigt skridt i retning af oversættelsen til terapi.

Vi bemærker ligeledes, at musen tarmen, bliver meget tyndvægget og af lille kaliber, er særlig let at forarbejde i sammenligning med den for andre arter såsom svin eller rotte. Hos mennesker, forventer vi, at nogle af detaljerne i de organoid enheder fremstillingstrin skulle modificeres til både tilstrækkeligt fordøje vævet og undgå overdigestion til enkelte celler, især koncentrationen af ​​dispase og collagenase i fordøjelsen løsning, og den tid af fordøjelse ved 37 ° C.

Det endelige mål med denne teknik er en overgang til human terapi. Vævsmanipulering af human tarm fra patientens eget væv potentielt kunne give en holdbar, langsigtet helbredelse for korttarmssyndrom (SBS) med ingen af ​​ulemperne ved eksisterende behandlinger. Kort tarm synsyndrom er en morbid tilstand forårsaget af resektion af en betydelig brøkdel af den samlede længde af tyndtarmen, sædvanligvis større end 50 til 75 procent, således at dens absorptionskapacitet er alvorligt nedsat og patienten kan ikke opnå tilstrækkelig næring fra enteral ernæring. ² I børn, de mest almindelige årsager til SBS er massiv resektion af tyndtarmen sekundært til nekrotiserende enterocolitis eller malrotation med midgut tarmslyng. ^8,9 Også, selv om mindre almindeligt, kan SBS forekomme hos voksne på grund af flere resektioner i fastsættelsen af Crohns sygdom, eller med mesenterisk iskæmi sekundært til vaskulær sygdom. ^10,11 Fordi SBS patienter ikke kan opretholde tilstrækkelig ernæring med enteral indtagelse, kan de kræve et langsigtet total parenteral ernæring, som i sig selv kan være kompliceret i børn ved leversvigt og skrumpelever. ¹² SBS patienter derfor udholde signifikant udgifter til sundhedsvæsenet, for nylig anslået, at være i størrelsesordenen af ​​1,6 millioner dollars per patientover 5 år. ¹³ Den nuværende standard for pleje af intestinal fiasko sekundært til SBS er tarm, lever / tarm, eller anden multivicerale transplantation, men det giver kun en 60% 5-års overlevelse og afsender patienten til en livslang kursus af immunosuppressiv behandling . ¹⁴ Endvidere begrænsede organdonor tilgængelighed resulterer i en uundgåelig mismatch i udbud og efterspørgsel og lange ventetider. ¹⁵ Derfor ville tissue engineering fra patientens autologt væv være et attraktivt alternativ.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
HBSS	Gibco	114170-112
Antibiotic-Antimycotic 100X	Invitrogen	15240-062
Dispase	Gibco	17105-041
Collagenase Type 1	Worthington	LS004194
DMEM High Glucose 1X	Gibco	11995-065
Heat inactivated FBS	Invitrogen	16140-071
Biofelt 100% PGA	Concordia Medical	FELT01-1005	For polymer preparation as in Ref. 4
Poly-L-lactic acid	Durect	B6002-1	For polymer preparation as in Ref. 4
Type I Collagen, rat tail	Sigma-Aldrich	C3867-1VL	For polymer preparation as in Ref. 4
Ketoprofen 100 mg/ml	Fort Dodge Animal Health	71-KETOI-100-50
LabDiet 5001 rodent chow	LabDiet	5001
Septra 200 mg / 40 mg per 5 ml, USP	Hi-Tech Pharmacal	50383-824-16
Isoflurane, USP	Phoenix Pharmaceuticals	57319-507-06