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Bioengineering

Génie tissulaire de l'intestin dans un modèle murin

Published: December 1, 2012 doi: 10.3791/4279

Summary

Cet article et la vidéo qui l'accompagne présenter notre protocole pour générer génie tissulaire intestin chez la souris, en utilisant un organoïde unités-sur-échafaudage approche.

Abstract

Génie tissulaire intestin grêle (TESI) a été utilisée avec succès pour sauver des rats Lewis après une résection intestinale massive de petite, ce qui entraîne en retour de poids préopératoire dans les 40 jours 1. Chez l'homme, massif résection de l'intestin grêle peuvent entraîner un syndrome du grêle court, une malabsorption fonctionnelle Etat qui confère une importante morbidité, la mortalité et les coûts des soins de santé, y compris la dépendance nutrition parentérale, l'insuffisance hépatique et de la cirrhose, et la nécessité d'une transplantation d'organe multiviscérale. 2 Dans cet article, nous décrivons et documenter notre protocole pour la création par génie tissulaire intestin dans un modèle de souris avec un organoïde unités-sur-échafaudage approche multicellulaire. Unités sont organoïdes agrégats multicellulaires dérivées de l'intestin qui contiennent des éléments à la fois des muqueuses et mésenchymateuses, 3 la relation entre ce qui préserve la niche tige intestinale cellule. 4 Dans la recherche en cours et à venir, la transition de notre technique dans lesouris permettra d'enquête sur les processus impliqués lors de la formation TESI en utilisant les outils disponibles transgéniques chez cette espèce. 5 La disponibilité de souches de souris immunodéprimées nous permettra également d'appliquer la technique de tissu intestinal humain et optimiser la formation de TESI humain comme un xénogreffe de souris avant sa transition vers les humains. Notre méthode utilise bonnes pratiques de fabrication (BPF) des réactifs et des matériaux qui ont déjà été approuvés pour une utilisation chez des patients humains, et offre donc un avantage significatif par rapport aux approches qui reposent sur des tissus animaux décellularisé. Le but ultime de cette méthode est sa traduction à l'homme comme une stratégie thérapeutique pour la médecine régénérative syndrome de l'intestin court.

Protocol

1. Organoïde Préparation unités

  1. Instruments appropriés pour la dissection de la souris (ciseaux et des pinces) doivent être stérilisés par autoclave.
  2. Euthanasier sans douleur la souris donneuse selon les protocoles locaux IACUC. Assurez-vous que l'animal est mort avant de poursuivre.
  3. Faire une incision médiane pour accéder à la cavité péritonéale. Lambeaux cutanés peuvent être présentées comme nécessaires pour améliorer l'exposition.
  4. Eviscération l'intestin grêle et le diviser juste en aval du ligament de Treitz. Séparer l'intestin grêle de son mésentère utilisant nette et douce dissection. Identifier la jonction iléo-colique et de diviser l'intestin grêle proximal 5 mm à cela.
  5. Avec des ciseaux, ouvrez l'intestin sens de la longueur le long de la frontière antimésentérique dans une boîte de Pétri avec 10 ml 4 ° C, une solution saline tamponnée stérile de Hanks (HBSS, Invitrogen, Carlsbad CA) / 1X antibiotique antifongique-(Anti-Anti, Invitrogen) solution. Effacer les matières fécales dans l'intestin ouvert avecagitation douce puis de transférer l'intestin a ouvert un tube à centrifuger 15ml avec 10 ml de 4 ° C, HBSS stérile / 1X anti-anti.
  6. Laver l'intestin ouvert trois fois dans 10 ml de 4 ° C, HBSS stérile / 1X anti-anti-dans un tube à essai. Chaque lavage peut être effectué avec une agitation douce du tube de 15 ml pendant 30 sec. Après agitation, le tissu intestinal coule au fond du tube. Jeter les matériels flottants qui est des débris mésenchymateuse. Retirez soigneusement la solution de lavage avec une pipette.
  7. Hachez l'intestin lavé dans une boîte de Pétri avec 10 ml de 4 ° C, HBSS stérile / 1X anti-anti-moins de 1 mm morceaux carrés en utilisant une paire de ciseaux. Rassemblez le matériel hachée avec une pipette automatique et le placer dans un tube à essai.
  8. Centrifuger le tube à 500 tours par minute pendant 8 min. Jeter le surnageant, qui contient de la graisse et le mésenchyme.
  9. Digérer le hachée, matériau lavé avec 10 ml de HBSS stérile / 1X anti-anti majoré de 0,125 mg / ml dispase (Invitrogen) et 800 unités / ml collagénase de type 1 (Worthington, Lakewood NJ). Pour préparer 40 ml de la solution de digestion, peser 5 mg de dispase, 142 mg de collagénase, et ajouter HBSS stérile jusqu'à un volume de 40 ml. Préparer cette solution fraîchement chacune des unités organoïdes temps sont préparés, et conserve à 4 ° C jusqu'au moment de servir. Ajouter la solution de digestion directement à l'étape de 1,8 à granulés.
  10. Incuber le tube à essai contenant le hachée, la matière lavée avec la solution de digestion à 37 ° C pendant 20 min.
  11. Récupérer le tube à essai et perturber encore davantage le tissu digéré par trituration avec une pipette de 10 ml. Répéter entre 20 à 50 fois jusqu'à ce qu'une apparence uniforme.
  12. Centrifuger le tube à essai pendant 5 min à 800 rpm. Jeter le surnageant, qui contient des cellules individuelles.
  13. Arrêter la réaction de digestion avec 10 ml de 4 ° C, stérile Eagle modifié par Dulbecco (DMEM, Invitrogen) majoré de 10% v / v inactivé par la chaleur du sérum fœtal bovin (FBS-HI, Invitrogen). Reprendre le pellet et agiter le tube.
  14. Centrifuger le tube à essai pendant 5 min à 800 rpm. Retirez soigneusement le surnageant avec une pipette automatique jusqu'à ce que les dernières gouttes. Utiliser une pipette en plastique jetable pour les dernières gouttes d'éviter la remise en suspension du culot.

2. Chargement de l'acide polyglycolique échafaudage

  1. Formulaire de 2 mm de long, de 5 mm de diamètre échafaudages cylindriques extérieures de l'acide glycolique non-tissé (épaisseur de la tôle de 2 mm, 60 mg densité en vrac cm-3; porosité> 95%, Fibres Concordia, RI Coventry) tel que décrit dans la référence. 4.
  2. Coupez l'extrémité distale de 2 mm d'une pipette jetable 1000 microlitre pointe avec des ciseaux préparés avec de l'éthanol à 70% dans de l'eau distillée.
  3. Placez l'échafaud dans une plaque de culture de 4-bien. Chargez les unités organoïdes sur l'échafaud avec la pipette microlitre 1000, d'abord dans la lumière, puis sur la surface extérieure. Utiliser une pince pour assurer revêtement de la lumière. Ne pas perturber ou briser la forme cylindrique du polymère.

    3. Implantation dans la souris hôte

    1. Utiliser une souris hôte syngénique sur le fond même du donateur si disponible. Sinon, utiliser un diabétique non obèse immunodéprimés / grave déficit immunitaire combiné ou NOD / SCID animal (Jackson Laboratories, Sacramento CA).
    2. Induire une anesthésie générale à l'isoflurane. Shave, la préparation et le drapé abdomen de la souris.
    3. Faire une incision médiane de 5 mm pour pouvoir entrer dans la cavité péritonéale. Identifier et soigneusement vider le grand épiploon. Placer le polymère chargé sur l'épiploon et l'envelopper avec le tissu. Ne déchirez pas l'épiploon.
    4. Obtenir le polymère à l'épiploon avec une suture 5-0 monocryl. Replacez doucement l'épiploon avec le polymère enveloppé dans sa position anatomique.
    5. Fermer l'incision abdominale en couches en utilisant des sutures 4-0 vicryl. Exécutez la fermeture des muscles et prendre soin de ne pas blesser les viscères abdominaux dessous de l'incision. Utilisez des points séparés pour la peau.
    6. Administrer une analgésie postopératoire de 2 mg / kg de kétoprofène (Ketofen, Fort Dodge Animal Health) dans de l'eau stérile comme une papule cutanée à côté de l'incision. Les animaux doivent être évalués quotidiennement et si l'animal montre des signes de douleur ou de détresse, une dose supplémentaire de kétoprofène peut être administrée au jour post-opératoire 2. Le troisième jour postopératoire, l'animal doit être complètement récupéré sans signes de douleur ou de détresse. Si la douleur ou de la détresse continue le jour post-opératoire 3, ceci est considéré comme anormal et devrait être traitée en conformité avec les protocoles IACUC et de soins pour animaux.
    7. Laissez la souris pour récupérer et l'intestin par génie tissulaire à croître pendant quatre semaines. Offrir l'accès à volonté des animaux annonce à rongeur (Laboratoire Diet 5001, PMI Nutrition, St. Louis MO) et de l'eau avec Septra 200 mg / 40 mg pour 5 ml (Salut-Tech Pharmacal, Amityville NY) à 1:100 dilution.

    4. Récolte

    1. Humanely euthanasier l'animal hôte quatre semaines après l'implantation.
    2. Rouvrir l'incision initiale et refléter la peau céphalique pour faciliter l'accès à la cavité péritonéale.
    3. Ouvrez la couche musculaire et d'identifier la construction par génie tissulaire comme un globe de tissu.
    4. Prenez les adhérences à la construction de viscères intra-abdominale à l'aide dissection.
    5. Fixer la construction dans le formol pour le montage ultérieur de paraffine, ou d'utiliser le tissu frais pour les tests biochimiques tels que PCR en temps réel ou l'isolement des protéines.

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Representative Results

La figure 1 montre un schéma d'ensemble pour le protocole documenté ici. Le résultat final de ce protocole est une structure sphérique de globe ou par génie tissulaire intestin murin avec une lumière, muqueuse, la sous-muqueuse, musculeuse et ses environs. Figure 2A montre un globe typique par rapport à un polymère de départ échafaud. Figure 2B montre la même construction fortement bivalve de révéler sa lumière. Figure 3 montre un hématoxyline / éosine teinté de paraffine monté coupe transversale d'une construction typique de succès après 4 semaines d'incubation. Dans Réf. 4, nous avons été en mesure de produire par génie tissulaire intestin avec succès 89% du temps (39 sur 44 implants).

Une construction qui succombe est celui dans lequel aucune forme muqueuse. Il est impossible de juger sur la base de l'aspect brut à la récolte si le monde aura la muqueuse de l'analyse histologique définitive. Par conséquent, si des dosages biochimiques sont Performed sur le tissu construction nouvelle, chaque moitié de globe doit être fixé et monté de paraffine pour analyse histologique de confirmer que la muqueuse est présent dans chaque échantillon. Une construction qui aura échoué démontrer que stroma et la fibrose sur hématoxyline / éosine.

Figure 1
Figure 1. Schéma pour la production de génie tissulaire intestin chez la souris. En bref, tissu du donneur est récolté et transformé en unités organoïdes. Les unités organoïdes sont chargés sur un échafaudage poreux acide polyglycolique, qui est ensuite implanté dans un hôte et on laisse incuber pendant 4 semaines. La construction d'ingénierie sont ensuite récupérées et peuvent être caractérisées par histologie ou des dosages biochimiques.

Figure 2
Figure 2. Exemple de génie tissulaire intestin construction d'récolté à 4 semaines. R: Construire des sociétés enRison au polymère de départ échafaud. B: La même construction, bivalve de révéler sa lumière.

Figure 3
Figure 3. Faible puissance hématoxyline / éosine micrographie d'une construction typique de l'intestin avec succès par génie tissulaire. Les étiquettes et les flèches indiquent la lumière avec la muqueuse intestinale, et du pancréas hôte adhérent.

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Discussion

Nous présentons un protocole pour la production par génie tissulaire intestin chez la souris en utilisant un organoïde unités-sur-échafaudage approche. Les étapes les plus importantes sont celles de la préparation organoïde unités. Il faut prendre soin de bien nettoyer et traiter mécaniquement le tissu, mais le même soin doit être pris pour ne pas overdigest ou overtriturate les unités organoïdes après la digestion est effectuée (étape 1.11). Si cela est fait, les unités organoïdes peut être réduit à des cellules individuelles, qui peuvent être perdus dans le surnageant de l'étape 1.12, et sont peu susceptibles de survivre à produire par génie tissulaire intestin, comme la niche de cellules souches intestinales ne seraient pas conservées dans ce cas.

La petite taille de la souris, il est difficile de s'anastomoser directement la construction par génie tissulaire à l'intestin de l'animal hôte pour tester sa fonction in vivo. Alternativement, le rat représente un plus grand modèle de croissance TESI qui facilite en anastomose vivo eta déjà été effectuée pour cette raison 1. Néanmoins, la taille de la souris n'est pas un obstacle insurmontable, comme d'autres l'ont été en mesure d'effectuer une résection de l'intestin grêle et une anastomose, 6 ou chirurgie anorectale, 7 chez ces animaux. Pour répondre à ces questions, les expériences visant à caractériser la fonction de nos constructions du génie tissulaire intestinale dans une façon vitro sont en cours. D'autres limitations de cette technique comprennent un taux de réussite de 89% dans la génération de TESI 4. Autrement dit, 89% des échafaudages chargés OU réussira à générer TESI. L'application de cette technique par les autres peut aider à affiner et améliorer cette technique augmente le rendement global de 100%. En outre, cette technique pourrait être améliorée si la masse de tissu total généré pourrait être augmenté. Actuellement, la cytométrie en flux a démontré que le nombre total de cellules présentes dans la construction récolté TESI est 3 fois plus élevée que le nombre des présents lors de l'implantation(3,07 x 10 6 ± 0,5 x 10 6) 4. Améliorer le volume de la production TESI est une étape importante vers la traduction à la thérapie.

Nous notons également que l'intestin de la souris, qui est très à paroi mince et de petit calibre, est particulièrement facile à traiter par rapport à celle d'autres espèces comme le porc ou le rat. Chez l'homme, nous nous attendons à ce que quelques-uns des détails sur les mesures organoïdes unités de préparation devrait être modifiée de manière adéquate à la fois digérer les tissus et éviter digestion excessive de cellules individuelles, en particulier les concentrations de dispase et de la collagénase dans la solution de digestion et le temps de digestion à 37 ° C.

Le but ultime de cette technique est le passage à la thérapeutique humaine. L'ingénierie tissulaire de l'intestin humain à partir de tissus de la patiente pourrait offrir une solution durable, à long terme remède pour le syndrome de l'intestin court (SBS) avec aucun des inconvénients des thérapies existantes. L'intestin court syndrome est un état ​​morbide causé par la résection d'une fraction significative de la longueur totale de l'intestin grêle, généralement supérieure à 50-75 pour cent, de sorte que sa capacité d'absorption est fortement réduite et le patient ne peut pas obtenir suffisamment de nourriture à partir de la nutrition entérale. 2 Dans les enfants, les causes les plus courantes de SBS sont massives résection de l'intestin grêle secondaire à entérocolite nécrosante ou malrotation avec l'intestin moyen volvulus 8,9. Aussi, bien que moins fréquents, SBS peut survenir chez les adultes en raison de résections multiples dans le cadre de la maladie de Crohn, ou avec ischémie mésentérique consécutive à une maladie vasculaire. 10,11 Parce que les patients SBS ne peut pas maintenir une nutrition entérale avec un apport suffisant, ils pourraient avoir besoin à long terme de nutrition parentérale totale, qui lui-même peut être compliqué chez les enfants par l'insuffisance hépatique et de la cirrhose. 12 patients SBS donc supporter significative coûts de la santé, a récemment estimé à l'ordre de 1,6 million de dollars par patientsur 5 ans. 13 La norme actuelle de soins pour insuffisance intestinale secondaire à SBS est intestinale, du foie / intestin, ou une autre transplantation multiviscérale, mais cela ne confère qu'un 60% survie à 5 ans et relègue le patient à un cours tout au long de la thérapie immunosuppressive 14. Par ailleurs, les résultats limités de donneurs d'organes disponibilité à un décalage inévitable de la demande et de l'offre et de longs délais d'attente. 15 C'est pourquoi, l'ingénierie tissulaire de tissus autologues du patient serait une alternative intéressante.

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Disclosures

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Acknowledgments

Tracy C. Grikscheit, Erik R. Barthel, et Frédéric G. Sala sont pris en charge par le California Institute for Regenerative Medicine (CIRM), numéros de subvention RN2-00946-1 (TCG) et TG2-01168 (ERB, FGS). Allison L. Speer est une Société de l'Université chirurgiens savant Ethicon. Yashuhiro Torashima est financé par un Hôpital pour enfants de Los Angeles Saban Bourse de recherche Institut de développement de carrière.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HBSS Gibco 114170-112
Antibiotic-Antimycotic 100X Invitrogen 15240-062
Dispase Gibco 17105-041
Collagenase Type 1 Worthington LS004194
DMEM High Glucose 1X Gibco 11995-065
Heat inactivated FBS Invitrogen 16140-071
Biofelt 100% PGA Concordia Medical FELT01-1005 For polymer preparation as in Ref. 4
Poly-L-lactic acid Durect B6002-1 For polymer preparation as in Ref. 4
Type I Collagen, rat tail Sigma-Aldrich C3867-1VL For polymer preparation as in Ref. 4
Ketoprofen 100 mg/ml Fort Dodge Animal Health 71-KETOI-100-50
LabDiet 5001 rodent chow LabDiet 5001
Septra 200 mg / 40 mg per 5 ml, USP Hi-Tech Pharmacal 50383-824-16
Isoflurane, USP Phoenix Pharmaceuticals 57319-507-06

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References

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Bioingénierie Numéro 70 génie tissulaire génie biomédical de médecine d'anatomie de physiologie l'intestin grêle la chirurgie pédiatrique le syndrome de l'intestin court modèle animal la souris
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Barthel, E. R., Speer, A. L., Levin, More

Barthel, E. R., Speer, A. L., Levin, D. E., Sala, F. G., Hou, X., Torashima, Y., Wigfall, C. M., Grikscheit, T. C. Tissue Engineering of the Intestine in a Murine Model. J. Vis. Exp. (70), e4279, doi:10.3791/4279 (2012).

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