Summary
מאמר זה ולהציג את הווידאו הנלווה הפרוטוקול שלנו ליצירת רקמות מהונדסות מעי בעכבר, באמצעות גישת organoid יחידות על פיגום.
Abstract
מעי דק רקמה מהונדסת (Tesi) בהצלחה שמש כדי להציל את לואיס חולדות לאחר כריתת מעי דק מסיבית, וכתוצאה מכך חזר למשקלים לפני ניתוח תוך 40 יום. 1 בבני אדם, כריתת מעי דק מסיבית יכולה לגרום לתסמונת מעי קצרה, malabsorptive פונקציונלי המדינה שמעניקה תחלואה משמעותית, תמותה ועלויות שירותי בריאות, כולל תלות Parenteral תזונה, אי ספיקת כבד ושחמת כבד, ואת הצורך בהשתלת איברי multivisceral. 2 במאמר זה, אנו מתארים ולתעד בפרוטוקול שלנו ליצירת רקמות מהונדסות מעי במודל של עכברים עם גישה רבה תאית organoid יחידות על פיגום. יחידות Organoid הן אגרגטים תאיים הנגזרים מהמעי המכילים אלמנטים הן ריריים וmesenchymal, 3 קשר בין המשמר את הנישה של תאי גזע במעי. 4 במחקר מתמשך ובעתיד, את המעבר שלנו לטכניקההעכבר יאפשר חקירה של התהליכים המעורבים בהיווצרות Tesi על ידי ניצול הכלים המהונדסים הזמינים במין זה. 5 הזמינות של זני עכברי מדוכאי חיסון גם תאפשר לנו ליישם את הטכניקה לרקמת מעי אנושית ולייעל את היווצרות Tesi האנושי xenograft עכבר לפני המעבר שלו לבני אדם. השיטה שלנו מעסיקה (GMP) ריאגנטים וחומרים שכבר אושרו לשימוש בחולים אנושיים, ולכן מציעים יתרון משמעותי על פני גישות המסתמכות על רקמות חי decellularized ייצור נאות. המטרה הסופית של שיטה זו היא התרגום שלה לבני אדם כאסטרטגיה טיפולית רפואת רגנרטיבית לתסמונת מעי קצרה.
Protocol
1. הכנת יחידות Organoid
- המכשירים מתאימים לנתיחת עכבר (מספריים ומלקחיים) צריכים להיות מעוקרים על ידי חיטוי.
- הומני להרדים את עכבר התורם על פי פרוטוקולי IACUC מקומיים. ודא כי בעל החיים מתים לפני שימשיכו.
- לעשות חתך קו אמצע כדי לקבל גישה לחלל הצפק. שולי עור יכולים להשתקף כנדרשים כדי לשפר את החשיפה.
- כסח את המעי הדק ומחלק אותו רק דיסטלי לרצועות של Treitz. הפרד את המעי הדק מלפדרו באמצעות נתיחה בוטה חדה ועדינה. זהה את צומת ileocecal ולחלק את 5 מ"מ המעי הדק הפרוקסימלי לזה.
- בעזרת מספריים, פתח את מעי אורכו לאורך גבול antimesenteric בצלחת פטרי עם 10 מ"ל 4 מעלות צלזיוס, מלוח "סטרילי הנקס נאגר (HBSS, Invitrogen, Carlsbad CA) / 1X אנטיביוטיקה נגד פטריות (אנטי אנטי, Invitrogen) פתרון. נקה את הצואה מהמעי פתח עםתסיסה עדינה לאחר מכן להעביר מעי נפתח לצינור צנטריפוגה 15 מ"ל עם 10 מ"ל של 4 מעלות צלזיוס, HBSS סטריליים / 1X אנטי אנטי.
- שטוף את המעי נפתח שלוש פעמים ב10 מ"ל של 4 מעלות צלזיוס, HBSS / 1X סטריליים אנטי אנטי במבחנה. כל שטיפה ניתן לבצע עם רעד קל של צינור המ"ל 15 למשך 30 שניות. אחרי שלחץ, רקמת המעי שוקע לתחתית של התחתית. השלך חומרים צפים, שהיא פסולת mesenchymal. הסר את פתרון הכביסה בזהירות עם pipet.
- ברר במעי השטוף בצלחת פטרי עם 10 מ"ל של 4 מעלות צלזיוס, HBSS סטריליים / 1X אנטי אנטי פחות מ 1 מ"מ ריבועים באמצעות מספריים. אסוף את החומר הטחון עם pipet אוטומטי ולמקם אותו לתוך מבחנה.
- צנטריפוגה הצינור ב 500 סל"ד לדקות 8. בטל supernatant, המכיל שומן וmesenchyme.
- לעכל את החומר טחון, שטוף עם 10 מ"ל של HBSS סטריליים / תוספת אנטי אנטי 1X 0.125 מ"ג / המ"ל dispase (Invitrogen) ו800 יחידות / מ 'סוג l collagenase 1 (וורטינגטון, לייקווד ניו ג'רזי). כדי להכין 40 מ"ל של תמיסת העיכול, לשקול את 5 מ"ג dispase, 142 מ"ג של collagenase, ולהוסיף עד HBSS סטריליים לנפח של 40 מ"ל. הכן את הפתרון זה עתה את כל יחידות דיור organoid זמן מוכנות, ולשמור ב 4 ° C עד מוכן לשימוש. הוסף פתרון העיכול ישירות לגלולה מצעד 1.8.
- דגירת מבחנה המכילה את החומר טחון, שטוף עם פתרון העיכול על 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
- תחזר את המבחנה ועוד לשבש את רקמת עיכול על ידי טחינה דקה עם pipet מ"ל 10. חזור על בין 20 ל 50 פעמים עד שמראה אחיד מתקבל.
- צנטריפוגה המבחנה למשך 5 דקות ב 800 סל"ד. בטל supernatant, המכיל תאים בודדים.
- עצור את תגובת העיכול עם 10 מ"ל של 4 מעלות צלזיוס שינוי הנשר הבינוני של סטרילי Dulbecco (DMEM, Invitrogen) בתוספת 10% בסרום, v / v חום מומת עוברי שור (HI-FBS, Invitrogen). Resuspend פלהt ולנער את הצינור.
- צנטריפוגה המבחנה למשך 5 דקות ב 800 סל"ד. הסר את supernatant זהירות עם pipet אוטומטי עד הטיפין האחרונות. השתמש pipet פלסטיק חד פעמי לטיפין האחרונות, כדי למנוע resuspending הגלולה.
2. טעינה של Polyglycolic חומצת הפיגום
- טופס, פיגומי 2-מ"מ ארוך 5-מ"מ קוטר חיצוני גליליים מחומצת polyglycolic הארוגה (עובי 2-מ"מ גיליון, 60 מ"ג צפיפות סנטימטר-3 בתפזורת; נקבוביים%> 95, סיבי קונקורדיה, RI קובנטרי) כפי שמתוארת במס. 4.
- לקצץ 2 מ"מ הדיסטלי של pipet microliter הפנוי 1000 קצה עם מספריים מוכנים עם אתנול 70% במים מזוקקים.
- הנח את הפיגום לתוך צלחת תרבות 4-כן. טען את יחידות organoid גבי הפיגום עם pipet microliter 1000, קודם ללום ואז על פני השטח החיצוניים. השתמש במלקחיים כדי להבטיח ציפוי של לומן. אל תפגעו או לפרוץ צורה הגלילית של הפולימר.
3. השתלה לעכבר מארח
- השתמש בעכבר המארח syngeneic באותו הרקע כתורם אם הוא זמין. אחרת, להעסיק סוכרתי nonobese immunocompromised / חמור בשילוב בעלי חי immunodeficient או NOD / SCID (ג'קסון מעבדות, סקרמנטו קליפורניה).
- לגרום להרדמה כללית עם isoflurane. גילוח, הכנה ולעטוף בבטנו של העכבר.
- לעשות חתך קו אמצע 5 מ"מ כדי לזכות בכניסה לחלל הצפק. זיהוי וכסח omentum יותר בזהירות. הנח את הפולימר הטעון על גבי omentum ולעטוף אותו ברקמות. אל תקרע omentum.
- אבטח את הפולימר לomentum עם תפר 5-0 monocryl. מחזיר בעדינות את omentum עם הפולימר העטוף בתנוחה אנטומית שלה.
- סגור את החתך בבטן בשכבות באמצעות תפרי vicryl 4-0. הפעל את סגירת השרירים ולדאוג שלא לפגוע באיברים הפנימיים בבטן מתחת לחתך. השתמש תפרים לעור.
- כאבים לאחר ניתוח לנהל עם 2 מ"ג / קילו ketoprofen (Ketofen, בריאות בעלי חי Fort Dodge) במים סטריליים כwheal סמוך לחתך תת עורי. בעלי חיים צריכים להיות מוערכים מדי יום ואם בעל החיים הוא מפגינים סימנים של כאב או מצוקה, מנה נוספת של ketoprofen יכולה להינתן ביום ניתוח לאחר 2. ביום שלאחר הניתוח השלישי, בעלי החיים צריכים להיות התאוששו לחלוטין ללא עדות לכאב או מצוקה. אם כאב או מצוקה ממשיך ביום ניתוח לאחר 3, זה נחשב נורמלי ויש להתייחס בהתאם לפרוטוקולי מתקן טיפול IACUC ובעלי חיים.
- אפשר העכבר כדי להתאושש ומעי רקמה המהונדס לגדול במשך ארבעה שבועות. תן גישה כרצונך חיה למכרסם צ'או (המעבדה דיאט 5001, מדד מנהלי רכש תזונה, סנט לואיס מיזורי) ומים עם מ"ג Septra 200 מ"ג / 5 מ"ל לכל 40 (היי טק Pharmacal, Amityville ניו יורק) בשעת 1:100 דילול.
4. קציר
- הומאנלי להרדימו מארח ארבעה שבועות לאחר השתלה.
- פתח מחדש את החתך המקורי ומשקף את עור cephalad כדי להקל על גישה לחלל הצפק.
- פתח את שכבת השריר ולזהות את מבנה רקמות המהונדסות כעולם של רקמה.
- קח את ההידבקויות למבנה מהקרביים intraabdominal באמצעות נתיחה חדה.
- תקן ההבניה בפורמלין לפרפין מאוחר הרכבה, או להשתמש ברקמה הטריה למבחנים ביוכימיים כגון PCR בזמן אמת או בידוד חלבון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1 מציג סכמה כללית לפרוטוקול המתועד כאן. התוצאה הסופית של פרוטוקול זה היא מבנה כדורי של גלובוס או מעי עכברי רקמות מהונדס עם לומן, ריריות, submucosa, ומקיף 2A muscularis. איור מראה גלובוס אופייני בהשוואה לפיגום פולימרים. 2B איור התחלה מציגה אותו המבנה bivalved חריפות לחשוף לומה. איור 3 מדגים קטע מוכתם eosin hematoxylin / פרפין רכוב צולב של מבנה מוצלח אופייני לאחר 4 שבועות של דגירה. במס. 4, שהיינו מסוגל לייצר רקמות מהונדס מעי בהצלחה 89% מהזמן (39 מתוך 44 שתלים).
מבנה הוא אחד מוצלח שבשום צורת רירית. אי אפשר לשפוט על סמך מראה גולמי בקציר אם העולם יהיה רירית על ניתוח היסטולוגית סופי. לכן אם מבחנים ביוכימיים הם performeד במבנה הרקמה הטריה, חצי מכל עולם צריך להיות קבוע ופרפין רכוב לניתוח היסטולוגית כדי לאשר שרירית נמצאת בכל דגימה. מבנה כושל ידגים סטרומה וסיסטיק רק בצביעת hematoxylin / eosin.
איור 1. סכמה לייצור רקמת המעי מהונדס בעכבר. בקיצור, רקמות תורמות שנקטפו ומעובד ליחידות organoid. יחידות organoid מועמסות על polyglycolic נקבובי חומצת פיגום, אשר לאחר מכן הוא מושתל לתוך מארח ואפשר לדגירה במשך 4 שבועות. אז המבנה המהונדס אחזור וניתן לאפיין באמצעות היסטולוגיה או מבחנים ביוכימיים.
איור 2. דוגמה למעי מהונדס רקמות לבנות נקטף ב4 שבועות. : Construct בcompaRison למתחיל פולימר פיגום. ב ': אותו המבנה, bivalved לחשוף לומה.
איור 3. נמוך הכח hematoxylin / eosin מיקרוסקופ של מבנה מעי טיפוסי מוצלח רקמות מהונדסת. התוויות והחצים מצביעים לום עם רירית מעי, לבלב ומארח חסיד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אנו מציגים פרוטוקול לייצור רקמת מעי מהונדס בעכבר באמצעות organoid גישת יחידות על פיגום. השלבים הקריטיים ביותר הם אלה של הכנת יחידות organoid. יש להקפיד לנקות כראוי ומכאני לעבד את הרקמה, אבל טיפול שווה יש להקפיד שלא לoverdigest או overtriturate יחידות organoid לאחר העיכול מתבצע (שלב 1.11). אם זה נעשה, יחידות organoid יכולות להיות מופחתות לתאים בודדים, אשר יכולה להיות שאבדו בsupernatant של 1.12 צעד, ולא סביר שישרוד כדי לייצר רקמת מעי מהונדס, כנישת תאי גזע מעיים לא יישמר בזה מקרה.
גדליו הקטנים של העכבר עושה את זה מאתגר ישירות לanastomose מבנה רקמה המהונדסת למעי של החיה המארחת כדי לבחון את תפקודו בגוף חי. לחלופין, העכברוש מייצג מודל גדול יותר לצמיחת Tesi שמקל בהשקת vivo וכבר בוצע מסיבה זו 1. עם זאת, גודלו של העכבר אינו מכשול בלתי עביר, כפי שאחרים היו מסוגלים לבצע כריתת מעי קטנה והשקה, 6 או ניתוח anorectal, 7 בבעלי חיים אלה. כדי לטפל בבעיות, ניסויים אלה כדי לאפיין את התפקוד של מבני מעי רקמות המהונדסות באופנה במבחנה הם מתמשכים. מגבלות נוספות לטכניקה זו כוללות 89% הצלחה בדור של Tesi 4. כלומר, 89% מפיגומי OU טעון יפיקו הצלחה Tesi. היישום של טכניקה זו על ידי אחרים עשוי לעזור לחדד ולשפר את הטכניקה הזו מגדילה את התשואה הכוללת ל100%. בנוסף, טכניקה זו יכולה להיות שיפור אם מסת הרקמה הכולל שנוצרה יכולה להיות מוגברת. נכון לעכשיו, cytometry הזרימה הוכיח כי המספר הכולל של תאים המצויים בנקטף Tesi המבנה הוא 3-גבוה פי יותר מהווה המספר בהשתלה(3.07 x 10 6 ± 0.5 x 10 6) 4. שיפור בנפח ייצור Tesi הוא צעד חשוב לקראת תרגום לטיפול.
נציין גם שמעי העכבר, להיות מאוד דק דופן ושל קליבר קטן, קל במיוחד לעיבוד בהשוואה לזה של מינים אחרים כגון חזירים או עכברים. בבני אדם, אנו צופים כי חלק מהפרטים של שלבי הכנת יחידות organoid היה צריך להיות שונה לשניהם כראוי לעכל את הרקמה ולהימנע overdigestion לתאים בודדים, במיוחד בריכוזים של dispase וcollagenase בפתרון העיכול ואת הזמן של עיכול ב 37 ° C.
המטרה הסופית של טכניקה זו היא מעבר לטיפול אנושי. הנדסת רקמות של מעי אדם מרקמות של החולה עצמו עלולה להציע תרופה עמידה, לטווח ארוך לתסמונת מעי קצרה (SBS) עם אף אחד מהחסרונות של טיפולים קיימים. מעי קצר synשדה התעופה הוא מצב חולני שנגרם על ידי כריתה של חלק משמעותי של האורך הכולל של המעי הדק, בדרך כלל יותר מ 50-75 אחוזים, כך שיכולת הספיגה שלו מצטמצמת מאוד והמטופל אינו יכול להשיג מזון מספיק מתזונת Enteral. 2 ב ילדים, הגורמים השכיחים ביותר של SBS הם כריתת מעי קטנה מסיבית משנית לenterocolitis או malrotation necrotizing עם midgut התפתלות מעיים. 8,9 כמו כן, אם כי פחות נפוץ, SBS יכול להתרחש אצל מבוגרים בגלל הכריתה מרובה בהגדרה של מחלת קרוהן, או עם איסכמיה mesenteric המשנית למחלת כלי דם. 10,11 כי חולי SBS לא יכולים לשמור על תזונה מספקת בצריכת Enteral, הם עשויים לדרוש תזונה ארוכת טווח כוללת Parenteral, שעצמו יכול להיות מסובך בילדים על ידי אי ספיקת כבד ושחמת כבד. -12 חולי SBS לכן לסבול משמעותיים עלויות שירותי בריאות, העריכה לאחרונה להיות על הסדר של 1.6 מיליון דולרים לחולהמעל 5 שנים. 13 הסטנדרט הנוכחי של טיפול לכישלון משני לSBS מעיים הוא מעי, כבד / מעיים, או אחר השתלת multivisceral, אבל זה מקנה רק 60% הישרדות לאחר 5 שנים וconsigns המטופל כמובן לכל חיים מטיפול לדיכוי חיסוני 14. יתר על כן, תוצאות מוגבלות תורם איברים זמינים בחוסר התאמה בלתי נמנע בביקוש והיצע וזמני המתנה ארוכות. 15 לכן, הנדסת רקמות מרקמות העצמיות של המטופל תהיינה חלופה אטרקטיבית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
טרייסי ג Grikscheit, אריק ר Barthel, ופרדריק ג'סאלה נתמכת על ידי המכון בקליפורניה הרגנרציה רפואה (CIRM), מספרי המענק RN2-00946-1 (TCG) וTG2-01168 (ארב, מדרשה). אליסון ל שפר הוא חברה של אוניברסיטת מנתחי Ethicon חוקר. Yashuhiro Torashima ממומן על ידי המלגה של בית החולים לילדים בלוס אנג'לס סבן מכון מחקר פיתוח הקריירה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS | Gibco | 114170-112 | |
| Antibiotic-Antimycotic 100X | Invitrogen | 15240-062 | |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | |
| Collagenase Type 1 | Worthington | LS004194 | |
| DMEM High Glucose 1X | Gibco | 11995-065 | |
| Heat inactivated FBS | Invitrogen | 16140-071 | |
| Biofelt 100% PGA | Concordia Medical | FELT01-1005 | For polymer preparation as in Ref. 4 |
| Poly-L-lactic acid | Durect | B6002-1 | For polymer preparation as in Ref. 4 |
| Type I Collagen, rat tail | Sigma-Aldrich | C3867-1VL | For polymer preparation as in Ref. 4 |
| Ketoprofen 100 mg/ml | Fort Dodge Animal Health | 71-KETOI-100-50 | |
| LabDiet 5001 rodent chow | LabDiet | 5001 | |
| Septra 200 mg / 40 mg per 5 ml, USP | Hi-Tech Pharmacal | 50383-824-16 | |
| Isoflurane, USP | Phoenix Pharmaceuticals | 57319-507-06 |
References
- Grikscheit, T. C., Siddique, A., Ochoa, E. R., et al. Tissue-engineered small intestine improves recovery after massive small bowel resection. Ann. Surg. 240, 748-754 (2004).
- Wales, P. W., Christison-Lagay, E. R. Short bowel syndrome: epidemiology and etiology. Sem. Ped. Surg. 19, 3-9 (2010).
- Evans, G. S., Flint, N., Somers, A. S., et al. The development of a method for the preparation of rat intestinal epithelial cell primary cultures. J. Cell Sci. 101, 219-231 (1992).
- Sala, F. G., Matthews, J. A., Speer, A. L., et al. A multicellular approach forms a significant amount of tissue-engineered small intestine in the mouse. Tiss. Eng. Part A. 17, 1841-1850 (2011).
- Speer, A. L., Sala, F. G., Matthews, J. A., Grikscheit, T. C. Murine tissue-engineered stomach demonstrates epithelial differentiation. J. Surg. Res. 171, 6-14 (2011).
- Haxhija, E. Q., Yang, H., Spencer, A. U., et al. Intestinal epithelial cell proliferation is dependent on the site of massive small bowel resection. Pediatr. Surg. Int. 23, 379-390 (2007).
- Zhao, L., Cheng, Z., Dhall, D., et al. A novel corrective pullthrough surgery in a mouse model of Hirschsprung's disease. J. Pediatr. Surg. 44, 759-766 (2009).
- Petrosyan, M., Guner, Y. S., Williams, M., et al. Current concepts regarding the pathogenesis of necrotizing enterocolitis. Ped. Surg. Int. 25, 309-318 (2009).
- Shew, S. B. Surgical concerns in malrotation and midgut volvulus. Ped. Radiol. 39, S167-S171 (2009).
- Sampietro, G. M., Corsi, F., Maconi, G., et al. Prospective study of long-term results and prognostic factors after conservative surgery for small bowel Crohn's disease. Clin. Gastroenterol. Hepatol. 7, 183-191 (2009).
- Klempnauer, J., Grothues, F., Bektas, H., Pichlmayr, R. Long-term results after surgery for acute mesenteric ischemia. Surgery. , 121-239 (1997).
- Fitzgibbons, S. C., Jones, B. A., Hull, M. A., et al. Relationship between biopsy-proven parenteral nutrition-associated liver fibrosis and biochemical cholestasis in children with short bowel syndrome. J. Ped. Surg. 45, 95-99 (2010).
- Spencer, A. U., Kovacevich, D., McKinney-Barnett, M., et al. Pediatric short bowel syndrome: the cost of comprehensive care. Am. J. Clin. Nutr. 88, 1552-1559 (2008).
- Kato, T., Tzakis, A. G., Selvaggi, G., et al. Intestinal and multivisceral transplantation in children. Ann. Surg. 243, 756-766 (2006).
- Reyes, J., Bueno, J., Kocoshis, S., et al. Current status of intestinal transplantation in children. J. Ped. Surg. 33, 243-254 (1998).
