Summary
이 문서와 함께 비디오 organoid 단위 온 발판 접근법을 사용하여 마우스에 조직 - 엔지니어링 소장을 생성하기 위해 우리의 프로토콜을 제시한다.
Abstract
조직 - 엔지니어링 소장 (TESI)가 성공적으로 40일 이내에 수술 전 근력로 돌아 발생, 거대한 작은 창자 절제술 후 루이스의 쥐를 구출하는 데 사용되었습니다. 인간 1, 대규모 작은 창자 절제술 짧은 창자 증후군, 기능 malabsorptive이 발생할 수 있습니다 중요한 병적 상태, 사망률, 그리고 비경 영양 의존도, 간 장애 및 간경변, 그리고 multivisceral 장기 이식의 필요성 2.이 문서에 포함 의료 비용을 수여 국가는, 우리는 마우스 모델에서 조직 - 엔지니어링 소장을 만들기위한 우리의 프로토콜을 설명하고 문서화 다세포 organoid 단위 온 발판 방식으로. Organoid 단위는 점막과 중간 엽 모두 요소를 포함하는 장에서 파생 다세포 집계, 3 장 줄기 세포 틈새 시장을 유지하는 사이의 관계입니다. 지속적인와 미래의 연구에서 4로 우리 기술의 전환마우스는이 종에서 사용할 수있는 유전자 변형 도구를 이용하여 TESI 형성하는 동안 관련된 프로세스의 조사를 허용합니다. 면역 저하 마우스 종자의 5 가용성도 우리 인간의 장 조직에 기술을 적용하고 같은 인간 TESI의 형성을 최적화 할 수 있도록 허용합니다 인간에의 전환하기 전에 마우스 이종 이식. 우리의 방법은 좋은 제조 연습 (GMP) 시약 및 이미 인간의 환자에 사용하기 위해 승인, 따라서 decellularized 동물의 조직에 의존 접근 방식에 비해 상당한 장점을 제공 한 자료를 사용하고 있습니다. 이 방법의 궁극적 인 목표는 짧은 창자 증후군의 재생 의료 치료 전략으로 인간의 번역입니다.
Protocol
1. Organoid 단위 준비
- 마우스 해부 (가위와 집게)에 적합한 악기 압력솥의 소독을해야합니다.
- 편안하게 지역 IACUC 프로토콜에 따라 기증자 마우스를 안락사시켜야. 동물이하기 전에 죽은 있는지 확인합니다.
- 복막 캐비티에 액세스 할 수있는 중간 선 절개를합니다. 노출을 개선하기 위해 필요에 따라 피부 플랩이 반영 될 수 있습니다.
- 작은 창자를 창자를 빼내다와 Treitz의 인대에 단지 말초을 나눕니다. 샤프하고 부드러운 무딘 절개를 사용하여 장간막에서 작은 창자를 분리합니다. ileocecal 접합을 파악하고 이에 대한 근위 작은 창자 5mm를 나눕니다.
- 가위를 사용하면 (Invitrogen, 안티 - 안티) 10 ML 4 ° C, 멸균 행크스 '버퍼 생리 (HBSS, Invitrogen, Carlsbad CA) / 1X 항생제 - 항 곰팡이를 배양 접시에있는 antimesenteric 국경을 따라 길이 솔루션을 장을 엽니 다. 로 연 장에서 대변을 해제합니다부드러운 교반 한 다음 10 4의 ML ° C, 멸균 HBSS / 1X 안티 - 안티을 15ml 원심 분리기 튜브로 열린 장을 전송하기 만하면됩니다.
- 4 10 ML에 열려있는 장을 세 번 씻어 ° C, 테스트 튜브에 안티 - 안티 살균 HBSS / 1X. 각 세척은 30 초에 15 ML 튜브의 약한 흔들림을 수행 할 수 있습니다. 진동 후, 장 조직은 관의 바닥에 가라. 중간 엽 파편이 부동 물질을 폐기하십시오. pipet을주의 깊게 세척 솔루션을 제거합니다.
- 4 10 ML과 배양 접시에있는 세탁 장을 이기다 ° C, 멸균 HBSS / 가위를 사용하여보다 1mm 제곱 조각에 1X 안티 - 안티. 자동 pipet으로 다진 자료를 수집하고 테스트 튜브에 넣습니다.
- 8 분 500 rpm으로 튜브를 원심 분리기. 뚱뚱하고 mesenchyme 포함되어있는 표면에 뜨는을 폐기하십시오.
- 멸균 HBSS / 1X 안티 - 안티 플러스 0.125 MG / ML dispase (Invitrogen) 및 800 단위 / m의 10 ML과 다진, 씻은 자료를 소화리터 collagenase 타입 1 (워싱턴, 레이크 우드 NJ). 소화 솔루션의 40 ML를 준비하려면 dispase, collagenase의 142 밀리그램의 5 밀리그램을 무게, 40 ML의 볼륨으로 살균 HBSS를 추가 할 수 있습니다. 갓 때마다 organoid 단위 준비가되어이 솔루션을 준비하고, 사용하기 4에 ° C까지 준비해 놓아요. 단계 1.8에서 직접 펠릿으로 소화 솔루션을 추가합니다.
- 20 분에 37 ° C에서 소화 솔루션과 다진, 씻은 재료를 포함하는 테스트 튜브를 품다.
- 테스트 튜브를 검색하여 추가로 10 ML의 pipet으로 분쇄하여 소화 조직을 중단. 균일 한 모양을 얻을 때까지 20-50 시간 사이에 반복합니다.
- 800 rpm으로 5 분 동안 테스트 튜브를 원심 분리기. 하나의 셀을 포함하는 표면에 뜨는을 폐기하십시오.
- 4 ° C, 멸균 Dulbecco의 수정 된 이글 중간 (DMEM, Invitrogen) 플러스 10% 브이 / v 열 inactivated 태아 소 혈청 (HI-FBS, Invitrogen)의 10 ML과 소화 반응을 중지합니다. pelle을 Resuspendt와 튜브를 흔들.
- 800 rpm으로 5 분 동안 테스트 튜브를 원심 분리기. 마지막 몇 방울까지 자동 pipet으로 조심스럽게 표면에 뜨는을 제거합니다. 펠렛을 resuspending 방지하기 위해 지난 몇 방울을위한 일회용 플라스틱 pipet을 사용합니다.
2. Polyglycolic 산성 발판으로로드
- 로 참조에 설명, nonwoven polyglycolic 산 (다공성> 95 %, Concordia는 섬유, 코번 트리의 RI 2 mm 시트의 두께, 60 MG cm-3 벌크 밀도)에서 양식 2 mm 길이 5 mm 외경 원통 공사장 공중 발판. 4.
- 증류수에 70 % 에탄올로 만든 가위로 팁을 일회용 1000 마이크로 리터의 pipet의 말초 2mm를 잘라.
- 4 잘 문화 판에 비계를 놓으십시오. 처음 루멘으로하고 바깥 쪽 표면에, 1000 마이크로 리터의 pipet으로 발판 위에 organoid 단위를로드합니다. 루멘의 코팅을 보장하기 위해 집게를 사용하십시오. 중단 또는 폴리머의 원통형 모양을 깨뜨하지 마십시오.
3. 호스트 마우스에 주입
- 기증자 가능한 경우와 같은 배경 syngeneic 호스트 마우스를 사용합니다. 그렇지 않으면, 면역 저하 nonobese의 당뇨병 환자 (잭슨 연구소, 새크라멘토 CA) 동물 / 심한 결합 immunodeficient 또는 NOD / SCID를 사용합니다.
- isoflurane과 전신 마취를 유도. , 사립를 면도하고 마우스의 복부를 내리면 t.
- 복막 캐비티에 입학을 얻기 위해 5mm 중간 선 절개를합니다. 확인하고 조심스럽게 큰 omentum을 골자를 빼 버리다. omentum로로드 된 폴리머를 배치하고 조직과 함께 포장. omentum을 찢어하지 마십시오.
- 5-0 monocryl의 봉합과 함께 omentum에 폴리머를 고정합니다. 부드럽게의 해부학 위치로 포장 폴리머로 omentum를 교체하십시오.
- 4-0 vicryl 봉합을 사용하여 레이어의 복부 절개를 닫습니다. 근육 폐쇄를 실행하고 절개 아래 복부 내장을 손상하지 돌. 피부 중단 봉합을 사용하여.
- 절개에 인접 피하 wheal으로 멸균 물에 2 밀리그램 / kg 케토 프로 펜 (Ketofen, 포트 닷지 동물 건강)와 수술 후 진통제를 관리 할 수 있습니다. 동물은 매일 평가해야하고 동물이 통증이나 고통의 흔적을 보여주는 경우 케토 프로 펜의 추가 투여는 수술 후 2 일에 실시 될 수 있습니다. 세 번째 수술 일까지, 동물 완전히 통증이나 고통의 증거도없이 복구 할 수 있어야합니다. 통증이나 고통이 포스트 수술 일 3 지속되면, 이것은 비정상적인 것으로 간주되고 IACUC과 동물 보호 시설 프로토콜에 따라 해결해야합니다.
- 회복 할 수있는 마우스와 조직 - 엔지니어링 소장은 4 주 동안 성장 할 수 있습니다. 쥐 수유 (랩 다이어트 5001, PMI 영양, 세인트 루이스 MO) 5 ML (하이테크 Pharmacal, Amityville NY)에 1:100 희석 당 Septra 200 밀리그램 / 40 MG와 물 동물 광고 libitum 액세스를 제공합니다.
4. 수확
- Humanely 사주 주입 한 후 호스트 동물을 안락사시켜야.
- 원래 절개을 열고 피부를 반영는 복막 캐비티에 대한 액세스를 용이하게 cephalad.
- 근육 레이어를 열고 조직의 세계로 조직 - 엔지니어링 구조를 확인합니다.
- 날카로운 해부를 사용하여 intraabdominal 내장의 구조에 adhesions을보십시오.
- 설치하기 파라핀을위한 포르말린에 구조를 수정, 또는 실시간 PCR 또는 단백질 분리와 같은 생화학 assays에 대한 새로운 조직을 사용합니다.
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Representative Results
그림 1은 여기에 설명 된 프로토콜에 대한 전반적인 스키마를 보여줍니다. 이 프로토콜의 최종 결과는 동일한 구조를 표시하는 루멘, 점막, submucosa, 그리고 muscularis. 그림 2A를 둘러싼 것은 시작 폴리머 비계. 그림 2B에 비해 전형적인 세계를 보여줍니다과 조직 - 엔지니어링 손쥐 소장의 세계 또는 구형 구조입니다 급의 루멘을 나타 내기 위해 bivalved. 그림 3은 부화 후 4 주 후 전형적인 성공적인 구조의 hematoxylin / eosin-스테인드 파라핀 장착 단면을 보여줍니다. 참조합니다. 4, 우리는 (44 임플란트 39 개) 시간의 조직 - 엔지니어링 소장 성공적으로 89 % 생산 할 수 있었다.
실패 구조는 진행하지 점막 양식입니다. 그것은 전 세계 최종 histologic 분석 점막을해야합니다 여부를 수확에서 총 모양에 따라 판단하는 것이 불가능합니다. 생화학 assays는 performe 아르 따라서 경우d는 신선한 구조 조직에서 각 세계의 절반은 고정되어야하며 파라핀은 점막 각 샘플에 존재 확인 histologic 분석에 장착. 실패 구조는 hematoxylin / eosin 염색에서만 기질과 섬유증을 보여줍니다.
그림 1. 마우스 조직 - 엔지니어링 대장의 생산에 대한 스키마. 간단히 말하자면, 기증자 조직은 organoid 단위로 수확과 처리됩니다. organoid 단위는 다음 호스트에 이식하고 4 주 동안 배양 할 수 있습니다 다공성 polyglycolic 산 발판,에로드됩니다. 엔지니어링 구조는 다음 검색되어 조직학 또는 생화학 assays을 통해 특성화 할 수 있습니다.
그림 2. 조직 - 엔지니어링 소장의 예는 사주에 수확 구성합니다. A는 : 안돼요에 건립폴리머 비계를 시작하기 rison. B : 그 내강을 나타 내기 위해 bivalved 같은 구조.
그림 3. 전형적인 성공적인 조직 - 엔지니어링 소장의 구조의 저전력 hematoxylin / eosin 현미경. 라벨과 화살표는 장 점막과 루멘과 점착성의 호스트이자를 나타냅니다.
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Discussion
우리는 organoid 단위 온 발판 접근 방식을 사용하여 마우스에 조직 - 엔지니어링 소장을 생성하기위한 프로토콜을 제시한다. 가장 중요한 단계는 organoid 단위의 준비가 일반적입니다. 주의 적절하게 청소하고 기계적으로 조직을 처리하는 이동해야하지만 소화를 수행 한 후에 동일한주의 (단계 1.11) organoid 단위를 overdigest 또는 overtriturate하지 않도록해야합니다. 이 작업을 수행하는 경우, organoid 단위 단계 1.12의 표면에 뜨는에서 손실 될 수 단일 세포로 감소하고, 조직 - 엔지니어링 소장을 생산 살아남을 가능성이 될 수 장 줄기 세포 틈새로 보존되지 않을 케이스.
마우스의 작은 사이즈는 직접 생체에 그 기능을 테스트하기 위해 호스트 동물의 창자에 조직 - 엔지니어링 구조를 합한다 어렵습니다. 또는 쥐가 생체 문합에 용이하게 TESI의 성장을 위해 더 큰 모델을 대표하고이미 이런 이유로 1 수행되었습니다. 다른 사람들이이 동물에 작은 대장 절제술 및 문합, 6 anorectal 수술, 7을 수행 할 수 있었던 것처럼 그럼에도 불구하고, 마우스의 크기는 이겨내 기 어려운 장애되지 않습니다. 체외 패션에서 우리의 조직 - 엔지니어링 장 구조의 기능을 특성화 이러한 문제를 해결하기 위해 실험은 계속됩니다. 이 기법에 대한 추가 제한 TESI 4 세대에서 89 % 성공률이 포함되어 있습니다. 즉, OU로드의 공사장 공중 발판의 89 %가 성공적으로 TESI를 생성합니다. 다른 사람에 의해이 기법의 응용 프로그램은 100 %로 전체 생산량을 증가이 기술을 보완하고 개선하는 데 도움이 될 수 있습니다. 생성 된 총 조직 질량이 증가 될 수있는 경우 또한,이 기술은 향상 될 수 있습니다. 현재 유동 세포 계측법은 수확 TESI 구조에 존재하는 세포의 총 숫자가 주입의 번호를 현재보다 3 배 더 큰 것을 보여 주었다(3.07 × 10 6 ± 0.5 × 10 6) 4. TESI 생산의 볼륨을 개선하는 치료 번역 향한 중요한 단계입니다.
우리는 마우스 소장은 매우 얇은 벽과 작은 구경의되는 등 돼지 나 쥐와 같은 다른 종의 비교에 처리 할 특히 쉬운 것을 또한 유의하십시오. 인간에서, 우리는 organoid 단위 준비 단계의 세부 사항의 일부가 수정해야한다고 기대 모두 적절하게 조직을 소화하고, 특히 하나의 셀에 overdigestion을 피하기 소화 솔루션 dispase과 collagenase의 농도 및 시간 37 번 소화 ° C.
이 기술의 궁극적 인 목표는 인간의 치료에 전환됩니다. 환자 자신의 조직에서 인간의 창자의 조직 공학은 잠재적으로 기존 요법의 단점 없음과 짧은 창자 증후군 (SBS)에 대한 내구성, 장기 치료를 제공합니다 수 있습니다. 짧은 창자 SYNdrome은 흡수 용량이 심각하게 감소되고 환자가 enteral 영양에서 충분한 영양을 얻을 수 있도록 작은 창자의 총 길이, 보통보다 큰 50-75%의 상당한 분수의 절제로 인한 병적 인 상태입니다. 2에서 어린이 SBS의 가장 일반적인 원인은 많이 있지만 8,9은 또한, SBS 때문에 Crohn의 질병의 설정에서 여러 resections의 성인에서 발생할 수 있습니다. midgut volvulus과 괴사 enterocolitis 또는 malrotation에 보조 대규모의 작은 대장 절제술, 또는와 혈관 질환에 보조 창 자간 막 국소 빈혈. 10,11 SBS의 환자 enteral 섭취와 충분한 영양을 유지할 수 있기 때문에, 그들은 자체가 간 오류 및 간경변에 의한 어린이 복잡 할 수 장기적으로 총 비경 영양을 필요로 할 수 있습니다. 12 SBS 환자 그러므로 중요한 견뎌야 의료 비용은 최근 환자 당 1,600,000달러의 순서에있을 것으로 추정SBS에 보조 장 실패에 대한 관리 5 년 이상 13. 현재 표준은 장, 간 / 장, 또는 다른 multivisceral 이식이지만,이 밖에 60 % 5 년 생존을 수여하고 면역 치료의 평생 과정에 환자를 consigns . 14 또한, 수요와 공급과 긴 대기 시간에 피할 수없는 불일치에 제한 기증 된 장기 가능한 결과. 15 따라서, 환자의 autologous 조직에서 조직 공학은 매력적인 대안이 될 것입니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
트레이시 C. Grikscheit, 에릭 R. Barthel, 그리고 글쓴이 G. 살라은 캘리포니아 재생 의료 연구소 (CIRM), 교부금 번호 RN2 - 00946-1 (TCG)과 TG2-01168 (ERB, FGS)에 의해 지원됩니다. 앨리슨 L. Speer은 대학 외과 전문의 Ethicon 학자의 사회입니다. Yashuhiro Torashima는 어린이 병원 로스 앤젤레스 Saban 연구소 연구 경력 개발 친목으로 운용되고 있습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS | Gibco | 114170-112 | |
| Antibiotic-Antimycotic 100X | Invitrogen | 15240-062 | |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | |
| Collagenase Type 1 | Worthington | LS004194 | |
| DMEM High Glucose 1X | Gibco | 11995-065 | |
| Heat inactivated FBS | Invitrogen | 16140-071 | |
| Biofelt 100% PGA | Concordia Medical | FELT01-1005 | For polymer preparation as in Ref. 4 |
| Poly-L-lactic acid | Durect | B6002-1 | For polymer preparation as in Ref. 4 |
| Type I Collagen, rat tail | Sigma-Aldrich | C3867-1VL | For polymer preparation as in Ref. 4 |
| Ketoprofen 100 mg/ml | Fort Dodge Animal Health | 71-KETOI-100-50 | |
| LabDiet 5001 rodent chow | LabDiet | 5001 | |
| Septra 200 mg / 40 mg per 5 ml, USP | Hi-Tech Pharmacal | 50383-824-16 | |
| Isoflurane, USP | Phoenix Pharmaceuticals | 57319-507-06 |
References
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