Summary
Este artigo eo vídeo que acompanha apresentar o nosso protocolo para gerar o tecido de intestino no mouse, utilizando uma abordagem de unidades-em-andaime organóide.
Abstract
O tecido de intestino delgado (TESI) tem sido usados com sucesso para resgatar ratos Lewis após a ressecção intestinal maciça pequeno, resultando em retorno aos pesos pré-operatórios dentro de 40 dias. 1 em humanos, a ressecção intestinal maciça pequeno pode resultar em síndrome do intestino curto, uma má absorção funcional Estado que confere significativa morbidade, mortalidade e custos de saúde, incluindo a dependência da nutrição parenteral, insuficiência hepática e cirrose, e da necessidade de transplante de órgãos multivisceral. 2 Neste trabalho, descrever e documentar o nosso protocolo para criar o tecido de intestino em um modelo de camundongo com um multicelular organóides abordagem unidades-em-andaime. Unidades organóides são agregados multicelulares derivadas do intestino que contêm elementos e mucosas mesenquimal, 3 a relação entre o que preserva o nicho de células-tronco intestinal. 4 Na investigação em curso e futuras, a transição da nossa técnica para orato irá permitir uma investigação dos processos envolvidos na formação TESI utilizando as ferramentas transgénicas disponíveis nesta espécie. 5 A disponibilidade de estirpes de ratos imunodeficientes também nos permite aplicar a técnica de tecido intestinal humano e optimizar a formação de TESI humano como um xenoenxerto mouse antes de sua transição para os seres humanos. Nosso método emprega boas práticas de fabricação (BPF) reagentes e materiais que já foram aprovadas para o uso em pacientes humanos, e, portanto, oferece uma vantagem significativa sobre as abordagens que dependem de tecidos animais descelularizados. O objetivo final deste método é a sua tradução para os seres humanos como uma estratégia de medicina regenerativa terapêutica para a síndrome do intestino curto.
Protocol
1. Preparação Unidades organóides
- Instrumentos adequados para dissecção mouse (tesouras e pinças) devem ser esterilizados por autoclave.
- Humanamente eutanásia do camundongo doador de acordo com os protocolos locais IACUC. Certifique-se que o animal está morto antes de prosseguir.
- Fazer uma incisão na linha média para obter acesso ao interior da cavidade peritoneal. Retalhos de pele pode ser refletido como necessário para melhorar a exposição.
- Estripar o intestino delgado e dividi-lo apenas distal do ligamento de Treitz. Separe o intestino delgado de seu mesentério usando afiada e dissecção romba suave. Identificar a junção ileocecal e dividir o intestino delgado 5 mm proximal ao presente.
- Com uma tesoura, abrir o intestino longitudinalmente ao longo da borda antimesentérica num prato de Petri com 10 ml de 4 ° C, a solução salina tamponada estéril de Hanks (HBSS, Invitrogen, Carlsbad CA) / 1X antibiótico-antifúngico (Anti-Anti, Invitrogen) de solução. Limpar a matéria fecal no intestino aberto comagitação suave, em seguida, transferir intestino aberto para um tubo de centrífuga de 15 ml com 10 ml de 4 ° C, HBSS estéril / 1X anti-anti.
- Lavar o intestino aberto três vezes em 10 ml de 4 ° C, HBSS estéril 1X / anti-anti num tubo de ensaio. Cada lavagem pode ser realizada com agitação suave do tubo de 15 mL durante 30 seg. Após agitação, o tecido intestinal afunda para o fundo do tubo. Descartar o material flutuante, a qual é detritos mesenquimal. Remover a solução de lavagem cuidadosamente com uma pipeta.
- Picar o intestino lavado numa placa de Petri com 10 mL de 4 ° C, HBSS estéril 1X / anti-anti-para menos do que 1 milímetro pedaços quadrados usando uma tesoura. Reúna o material picada com uma pipeta automática e colocá-lo em um tubo de ensaio.
- Centrifuga-se o tubo a 500 rpm durante 8 minutos. Rejeitar o sobrenadante, que contém a gordura e mesênquima.
- Digerir o material, picada lavada com 10 ml de HBSS estéril 1X / anti-anti mais 0,125 mg / ml de dispase (Invitrogen) e 800 unidades / ml colagenase tipo 1 (Worthington, Lakewood NJ). Para preparar 40 ml da solução de digestão, pesam-se 5 mg de dispase, 142 mg de colagenase, e adicione HBSS estéril até um volume de 40 ml. Preparar esta solução recentemente cada unidade de tempo organóides são preparados, e manter a 4 ° C até estar pronto para usar. Adicionar a solução de digestão directamente para a pellet a partir do passo 1.8.
- Incubar o tubo do teste contendo o material, picada lavado com a solução de digestão a 37 ° C durante 20 min.
- Recuperar o tubo de ensaio e perturbar ainda mais o tecido digerido através de trituração com uma pipeta de 10 ml. Repita entre 20 a 50 vezes, até que uma aparência uniforme é obtido.
- Centrifuga-se o tubo de ensaio durante 5 minutos a 800 rpm. Rejeitar o sobrenadante, que contém uma única célula.
- Parar a reacção de digestão com 10 ml de 4 ° C, Modificado de Dulbecco estéril Eagle Médium (DMEM, Invitrogen) mais 10% v / v inactivado pelo calor de soro fetal bovino (HI-FBS, Invitrogen). Ressuspender o pellet e agitar o tubo.
- Centrifuga-se o tubo de ensaio durante 5 minutos a 800 rpm. Remover o sobrenadante cuidadosamente com uma pipeta automática, até as últimas gotas. Usar uma pipeta de plástico descartável para as últimas gotas, para evitar de ressuspender o pellet.
2. Carregamento de ácido poliglicólico Andaime
- Forma de 2 mm de comprimento, 5 mm de diâmetro exterior andaimes cilíndricos de ácido poliglicólico não tecido (2 mm de espessura da folha, a densidade de 60 mg cm-3; porosidade%> 95, Fibras Concordia, RI Coventry), como descrito na ref. 4.
- Aparar a 2 mm distal de uma pipeta de microlitro descartável 1000 ponta com uma tesoura preparadas com 70% de etanol em água destilada.
- Coloque o andaime em uma placa de cultura de quatro poços. Carregar as unidades organóides sobre o andaime com a pipeta de microlitro 1000, em primeiro lugar para dentro do lúmen e, em seguida, sobre a superfície exterior. Use uma pinça para assegurar o revestimento do lúmen. Não perturbem ou romper a forma cilíndrica do polímero.
3. Implantação em Rato Anfitrião
- Utilizar um rato hospedeiro singeneico no fundo mesmo que o doador se disponível. Caso contrário, empregam um diabético não obesos imunocomprometidos / grave imunodeficiência combinada ou NOD / SCID animal (Jackson Laboratories, Sacramento CA).
- Induzir a anestesia geral com isoflurano. Barbear, preparação e armar o abdômen do rato.
- Fazer uma incisão na linha média 5 milímetros para ganhar entrada para a cavidade peritoneal. Identificar e cuidadosamente estripar o omento maior. Coloque o polímero carregado no omento e envolvê-la com o tecido. Não rasgue o omento.
- Fixar o polímero para o omento, com uma sutura monocryl 5-0. Suavemente o omento com o polímero enrolado na sua posição anatómica.
- Feche a incisão abdominal em camadas usando suturas vicryl 4-0. Executar o fechamento muscular e tomar cuidado para não ferir as vísceras abdominais abaixo da incisão. Use suturas interrompidas para a pele.
- Administrar analgesia pós-operatória, com 2 mg / kg de cetoprofeno (Ketofen, Fort Dodge Animal Health) em água estéril como uma pápula subcutânea adjacente à incisão. Os animais devem ser avaliados diariamente e se o animal está a demonstrar sinais de dor ou desconforto, uma dose adicional de cetoprofeno pode ser administrada no dia 2 pós-operatórios. No terceiro dia pós-operatório, o animal deve ser totalmente recuperado, sem evidência de dor ou sofrimento. Se a dor ou sofrimento continua no dia pós-operatório 3, este é considerado anormal e deve ser tratado de acordo com os protocolos de instalação IACUC e animal de cuidados.
- Permitir o mouse para recuperar e no intestino o tecido de crescer por quatro semanas. Dar ao animal o acesso ad libitum a roedores (Lab Diet 5001, PMI Nutrition, St. Louis MO) e água com Septra mg a 200 mg / 5 ml 40 (Hi-Tech Pharmacal, Amityville NY) a uma diluição de 1:100.
4. Colheita
- Humanely eutanásia do animal hospedeiro quatro semanas após a implantação.
- Reabrir a incisão inicial e reflectem a pele cefálica para facilitar o acesso à cavidade peritoneal.
- Abrir a camada muscular e identificar a construção de tecido de engenharia como um globo de tecido.
- Tome a aderência à construção a partir de vísceras intra-abdominal utilizando dissecção aguda.
- Fixar o construto em formalina para posterior montagem de parafina, ou usar o tecido fresco para os ensaios bioquímicos, tais como PCR em tempo real ou de isolamento de proteínas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A Figura 1 mostra um esquema geral para o protocolo aqui documentado. O resultado final deste protocolo é uma estrutura globo esférico ou de intestino de engenharia de tecidos de murino com um lúmen, mucosa, submucosa, e rodeando 2A. Muscularis Figura mostra um globo típica em comparação com o polímero de partida de um andaime. Figura 2B mostra a mesma construção acentuadamente bivalvadas para revelar seu lúmen. Figura 3 demonstra um hematoxilina / eosina manchado de parafina montado secção transversal de uma construção típica de sucesso após 4 semanas de incubação. Na Ref. 4, que foram capazes de produzir o tecido de intestino com sucesso 89% do tempo (39 de 44 implantes).
Uma construção vencida uma em que há formas de mucosa. É impossível julgar com base na aparência bruta no momento da colheita se o mundo terão mucosa na análise histológica final. Portanto, se os ensaios bioquímicos são performed no tecido fresco construto, metade de cada globo deve ser fixada e montada parafina para análise histológica para confirmar que a mucosa está presente em cada amostra. Uma construção vencida demonstrará estroma só e fibrose em hematoxilina / eosina.
Figura 1. Esquema para a produção de tecido de engenharia intestino em ratos. Em resumo, o tecido do dador é colhida e processada em unidades organóide. As unidades organóides sejam carregados num poroso ácido poliglicólico andaime, o qual é, em seguida, implantada num hospedeiro e deixou-se incubar durante 4 semanas. A construção de engenharia é então recuperado e pode ser caracterizado por meio de histologia ou ensaios bioquímicos.
Figura 2. Exemplo de o tecido de intestino construto colhidas em 4 semanas. A: Construir em compaRison de iniciar polímero andaime. B: A mesma construção, bivalvadas para revelar seu lúmen.
Figura 3. Baixa potência hematoxilina / eosina micrografia de uma construção bem sucedida intestino típico tecido de engenharia. As etiquetas e as setas indicam o lúmen com mucosa intestinal e pâncreas hospedeiro aderente.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nós apresentamos um protocolo para a produção de tecidos de engenharia intestino no rato usando um organóides abordagem unidades-em-andaime. Os passos mais críticos são os da preparação de unidades organóide. Cuidados devem ser tomados para limpar adequadamente e mecanicamente processar o tecido, mas o mesmo cuidado deve ser tomado para não overdigest ou overtriturate as unidades organóides após a digestão é realizada (passo 1.11). Se isto é feito, as unidades organóides pode ser reduzida a uma única célula, que pode ser perdido no sobrenadante do passo de 1,12, e não são susceptíveis de sobreviver para produzir o tecido de intestino, como o nicho intestinal células estaminais não iria ser preservada neste caso.
O pequeno tamanho do rato torna difícil a anastomose directamente a construção de tecido de engenharia para o intestino do animal hospedeiro para testar a sua função in vivo. Alternativamente, o rato representa um modelo maior para o crescimento TESI que facilita na anastomose e in vivojá foi realizado, por essa razão 1. No entanto, o tamanho do rato não é um obstáculo insuperável, como outros têm sido capazes de executar a ressecção do intestino delgado e anastomose, 6 ou cirurgia anorretal, 7 nesses animais. Para responder a estas questões, experimentos para caracterizar a função de nossos tecidos de engenharia construções intestinais em um de forma vitro estão em andamento. Limitações adicionais a esta técnica incluem uma taxa de sucesso de 89% da geração de TESI 4. Ou seja, 89% dos andaimes OU carregados com sucesso gerar TESI. A aplicação desta técnica por outros podem ajudar a refinar e melhorar esta técnica o aumento do rendimento global de 100%. Além disso, esta técnica pode ser melhorada se a massa de tecido total gerada pode ser aumentada. Actualmente, a citometria de fluxo mostrou que o número total de células presentes no constructo TESI colhida é 3 vezes maior do que o número presente no implante(3,07 x 10 6 ± 0,5 x 10 6) 4. Melhorar o volume de produção TESI é um passo importante em direção a tradução para a terapia.
Observamos também que o intestino do rato, sendo de paredes finas e de pequeno calibre, é particularmente fácil de processar em comparação com a de outras espécies, tais como o porco ou rato. Nos seres humanos, espera-se que alguns dos detalhes dos passos organóides unidades de preparação teria de ser modificado para ambos adequadamente digerir o tecido e evitar overdigestion para células individuais, em particular as concentrações de dispase e colagenase na solução de digestão e tempo de digestão a 37 ° C.
O objectivo final desta técnica é uma transição para a terapia humana. A engenharia de tecidos do intestino humano a partir de tecido do próprio paciente poderia oferecer um bem durável, cura a longo prazo para a síndrome do intestino curto (SIC) com nenhum dos inconvenientes das terapias existentes. Intestino curto syndrome é uma condição mórbida causada por ressecção de uma fracção significativa do comprimento total do intestino delgado, geralmente maior do que 50-75 por cento, de tal modo que a sua capacidade de absorção é muito reduzida e o paciente não pode obter alimento suficiente de nutrição entérica. 2 Em crianças, as causas mais comuns de SBS são ressecção intestinal maciça pequeno secundária à enterocolite necrosante ou má rotação com intestino volvulus. 8,9 Além disso, embora menos comum, SBS pode ocorrer em adultos por causa de ressecções múltiplas na definição da doença de Crohn, ou com isquemia mesentérica secundária a doença vascular. 10,11 Como os pacientes SBS não pode manter a nutrição suficiente com a ingestão enteral, podem exigir a longo prazo de nutrição parenteral total, o que em si pode ser complicado em crianças por insuficiência hepática e cirrose. SBS 12 pacientes, portanto, suportar significativa custos de saúde, recentemente estimou a ser da ordem de US $ 1,6 milhões por pacientemais de 5 anos. 13 O padrão actual de cuidados para a insuficiência intestinal secundária a SBS é fígado, intestino / intestinal, ou outro transplante multivisceral, mas isto confere apenas uma sobrevivência de 60% em 5 anos e consigna o paciente a um curso ao longo da vida da terapia imunossupressora 14. Além disso, limitados doadores de órgãos resultados de disponibilidade em um desfasamento inevitável da demanda e oferta e longos tempos de espera. 15 Portanto, a engenharia de tecidos a partir de tecido autólogo, o paciente seria uma alternativa atraente.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Tracy C. Grikscheit, Erik R. Barthel, e Frédéric G. Sala são suportados pelo Instituto de Medicina Regenerativa da Califórnia (CIRM), números de subsídios RN2-00946-1 (TCG) e TG2-01168 (ERB, FGS). Allison L. Speer é uma Sociedade de Cirurgiões Universidade Ethicon estudioso. Yashuhiro Torashima é financiado pelo Los Angeles de Crianças Hospital Saban Research Institute Fellowship Desenvolvimento de Carreira.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS | Gibco | 114170-112 | |
| Antibiotic-Antimycotic 100X | Invitrogen | 15240-062 | |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | |
| Collagenase Type 1 | Worthington | LS004194 | |
| DMEM High Glucose 1X | Gibco | 11995-065 | |
| Heat inactivated FBS | Invitrogen | 16140-071 | |
| Biofelt 100% PGA | Concordia Medical | FELT01-1005 | For polymer preparation as in Ref. 4 |
| Poly-L-lactic acid | Durect | B6002-1 | For polymer preparation as in Ref. 4 |
| Type I Collagen, rat tail | Sigma-Aldrich | C3867-1VL | For polymer preparation as in Ref. 4 |
| Ketoprofen 100 mg/ml | Fort Dodge Animal Health | 71-KETOI-100-50 | |
| LabDiet 5001 rodent chow | LabDiet | 5001 | |
| Septra 200 mg / 40 mg per 5 ml, USP | Hi-Tech Pharmacal | 50383-824-16 | |
| Isoflurane, USP | Phoenix Pharmaceuticals | 57319-507-06 |
References
- Grikscheit, T. C., Siddique, A., Ochoa, E. R., et al. Tissue-engineered small intestine improves recovery after massive small bowel resection. Ann. Surg. 240, 748-754 (2004).
- Wales, P. W., Christison-Lagay, E. R. Short bowel syndrome: epidemiology and etiology. Sem. Ped. Surg. 19, 3-9 (2010).
- Evans, G. S., Flint, N., Somers, A. S., et al. The development of a method for the preparation of rat intestinal epithelial cell primary cultures. J. Cell Sci. 101, 219-231 (1992).
- Sala, F. G., Matthews, J. A., Speer, A. L., et al. A multicellular approach forms a significant amount of tissue-engineered small intestine in the mouse. Tiss. Eng. Part A. 17, 1841-1850 (2011).
- Speer, A. L., Sala, F. G., Matthews, J. A., Grikscheit, T. C. Murine tissue-engineered stomach demonstrates epithelial differentiation. J. Surg. Res. 171, 6-14 (2011).
- Haxhija, E. Q., Yang, H., Spencer, A. U., et al. Intestinal epithelial cell proliferation is dependent on the site of massive small bowel resection. Pediatr. Surg. Int. 23, 379-390 (2007).
- Zhao, L., Cheng, Z., Dhall, D., et al. A novel corrective pullthrough surgery in a mouse model of Hirschsprung's disease. J. Pediatr. Surg. 44, 759-766 (2009).
- Petrosyan, M., Guner, Y. S., Williams, M., et al. Current concepts regarding the pathogenesis of necrotizing enterocolitis. Ped. Surg. Int. 25, 309-318 (2009).
- Shew, S. B. Surgical concerns in malrotation and midgut volvulus. Ped. Radiol. 39, S167-S171 (2009).
- Sampietro, G. M., Corsi, F., Maconi, G., et al. Prospective study of long-term results and prognostic factors after conservative surgery for small bowel Crohn's disease. Clin. Gastroenterol. Hepatol. 7, 183-191 (2009).
- Klempnauer, J., Grothues, F., Bektas, H., Pichlmayr, R. Long-term results after surgery for acute mesenteric ischemia. Surgery. , 121-239 (1997).
- Fitzgibbons, S. C., Jones, B. A., Hull, M. A., et al. Relationship between biopsy-proven parenteral nutrition-associated liver fibrosis and biochemical cholestasis in children with short bowel syndrome. J. Ped. Surg. 45, 95-99 (2010).
- Spencer, A. U., Kovacevich, D., McKinney-Barnett, M., et al. Pediatric short bowel syndrome: the cost of comprehensive care. Am. J. Clin. Nutr. 88, 1552-1559 (2008).
- Kato, T., Tzakis, A. G., Selvaggi, G., et al. Intestinal and multivisceral transplantation in children. Ann. Surg. 243, 756-766 (2006).
- Reyes, J., Bueno, J., Kocoshis, S., et al. Current status of intestinal transplantation in children. J. Ped. Surg. 33, 243-254 (1998).
