Summary
Эта статья и сопровождающие видео представляем наш протокол для создания тканевой инженерии кишечника у мышей, используя органоид единиц-на-эшафот подход.
Abstract
Тканевой инженерии тонкой кишки (ТЭСИ) был успешно использован, чтобы спасти Льюиса крыс после массивной резекции тонкой кишки, что приводит к возвращению в предоперационном веса в течение 40 дней. 1 В людях, массивные резекции тонкой кишки может привести синдром короткой кишки, функциональная malabsorptive состоянии, что дает значительную заболеваемость, смертность и расходы на здравоохранение в том числе парентерального питания зависимости, печеночная недостаточность и цирроз печени, и необходимость multivisceral трансплантации органов. 2 В этой статье мы описываем и документировать наш протокол для создания тканевой инженерии кишечника в мышиной модели с многоклеточных единиц органоид-на-эшафот подход. Органоид единиц многоклеточные агрегаты, полученные из кишечника, которые содержат оба слизистой оболочки и мезенхимальных элементов, 3 отношениях между которыми сохраняется кишечного ниша стволовых клеток. 4 в текущих и будущих исследований, переход нашей техники вмышь позволит исследование процессов при формировании TESI с использованием трансгенных инструменты, доступные в этом виде. 5 наличие иммунитета линий мышей также позволит нам применить этот метод для человеческой ткани кишечника и оптимизации формирования человека как TESI мышь ксенотрансплантата до его перехода в людях. Наш метод использует надлежащей производственной практики (GMP) реактивы и материалы, которые уже были одобрены для использования в человеческих пациентов, и поэтому предлагает значительные преимущества по сравнению с подходами, которые полагаются на decellularized тканях животных. Конечной целью этого метода является его перевод на людей, как регенеративная медицина терапевтические стратегии синдром короткой кишки.
Protocol
1. Органоид Подготовка единиц
- Приборы подходят для мыши рассечение (ножницы и щипцы) следует стерилизовать в автоклаве.
- Гуманно усыпить мышей-доноров в соответствии с местными IACUC протоколов. Убедитесь, что животное мертво, прежде чем приступить.
- Сделайте срединный разрез, чтобы получить доступ к брюшной полости. Кожных лоскутов может быть отражено, сколько необходимо для улучшения экспозиции.
- Потрошение тонкой кишки и разделить его просто дистальнее связки Treitz. Отделите тонкую кишку от брыжейки с помощью острых и нежный тупой диссекции. Определить илеоцекального соединения и разделить тонкой кишки 5 мм проксимальнее этого.
- Используя ножницы, открыть кишки продольно вдоль границы antimesenteric в чашку Петри с 10 мл 4 ° C, буферный раствор стерильно Хэнкса (HBSS, Invitrogen, Carlsbad CA) / 1X антибиотиками противогрибковых (анти-анти, Invitrogen) решение. Очистить фекалии из открытых кишки состорожном перемешивании затем передать открыл кишечника в 15 мл центрифужные пробирки с 10 мл 4 ° C, стерильные HBSS / 1X анти-анти.
- Вымойте открыл кишечника в три раза по 10 мл 4 ° C, стерильные HBSS / 1X анти-анти в пробирке. Каждое мытье может быть выполнен с мягкой встряхивания 15 мл трубки на 30 сек. После встряхивания ткани кишечника опускается на дно пробирки. Откажитесь плавучего материала, который является мезенхимальных мусора. Удалите моющий раствор тщательно с пипеткой.
- Фарш промытые кишки в чашку Петри с 10 мл 4 ° C, стерильные HBSS / 1X анти-анти менее 1 мм квадратной части, используя ножницы. Сбор фарш материала с автоматической пипеткой и поместите его в пробирку.
- Центрифуги трубы на 500 оборотов в минуту в течение 8 мин. Удалите супернатант, который содержит жиров и мезенхимы.
- Дайджест фарш, промытый материал с 10 мл стерильного HBSS / 1X анти-анти плюс 0,125 мг / мл диспазы (Invitrogen) и 800 единиц / мл коллагеназы типа 1 (Worthington, Lakewood Нью-Джерси). Для подготовки 40 мл пищеварения решение, взвесить 5 мг диспазы, 142 мг коллагеназы, а также добавить стерильную HBSS до объема 40 мл. Подготовка этого решения недавно каждого единиц времени органоид готовы, и хранить при температуре 4 ° С до готовности к использованию. Добавить пищеварения решение непосредственно в гранулах, начиная с шага 1.8.
- Инкубируйте пробирку с фаршем, промытого материала с пищеварением раствора при 37 ° С в течение 20 мин.
- Получить пробирку и дальше нарушать переваривается ткани растиранием с 10 мл пипетки. Повторить от 20 до 50 раз, пока не однородный вид получается.
- Центрифуга пробирку в течение 5 мин при 800 оборотах в минуту. Удалите супернатант, содержащий отдельные клетки.
- Остановить пищеварения реакции с 10 мл 4 ° C, стерильные Дульбекко изменения Eagle Medium (DMEM, Invitrogen) плюс 10% об / об инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (HI-FBS, Invitrogen). Ресуспендируют Pelleт и встряхните пробирку.
- Центрифуга пробирку в течение 5 мин при 800 оборотах в минуту. Удалить супернатант тщательно с автоматической пипеткой до последних нескольких капель. Используйте одноразовые пластиковые пипетки в течение последних нескольких капель, чтобы избежать ресуспендированием гранул.
2. Загрузка полигликолевой кислоты Эшафот
- Форму 2-мм, 5-мм наружный диаметр цилиндрической леса из нетканых полигликолевой кислоты (2-мм толщины листа, 60 мг см-3 объемная плотность, пористость> 95%, Concordia волокна, Ковентри, Род-Айленд), как описано в работе. 4.
- Обрежьте дистальных 2 мм одноразовых 1000 мкл пипетки наконечник с ножницами подготовлены с 70% этанола в дистиллированной воде.
- Поместите на эшафот в 4-культуры и пластины. Загрузите органоид единиц на эшафот с 1000 мкл пипетки, сначала в просвет, а затем на внешней поверхности. Используйте пинцет, чтобы обеспечить покрытие просвета. Не нарушать или взломать цилиндрической формы полимера.
3. Имплантация в хост мышь
- Используйте сингенных мышей хозяин на том же фоне, как донор, если доступно. В противном случае, используется ослабленным иммунитетом ожирения диабетической / тяжелым комбинированным иммунодефицитом или NOD / SCID животных (Jackson Laboratories, Sacramento, CA).
- Вызвать общей анестезии с изофлурана. Бритье, подготовки и драп живота мыши.
- Сделайте 5 мм срединный разрез, чтобы получить вход в брюшную полость. Выявление и тщательно потрошить большого сальника. Поместите загруженный полимера на сальника и заверните его в ткань. Не рвите сальника.
- Закрепить полимера сальника с 5-0 шва Monocryl. Аккуратно поставьте сальник с обернутые полимера в свое анатомическое положение.
- Закройте разрез брюшной стенки в 4-0 слоев с помощью Викрил швов. Запустите мышцы закрытия и заботиться, чтобы не травмировать брюшной полости ниже разреза. Используйте узловыми швами для кожи.
- Администрирование послеоперационного обезболивания с 2 мг / кг кетопрофен (Ketofen, Fort Dodge Animal Health) в стерильной воде, как волдырь подкожной рядом с разрезом. Животные должны быть оценены ежедневно, и если животное демонстрирует признаки боли или страдания, дополнительные дозы кетопрофена могут быть введены на пост операционного дня 2. На третий день после операции животное должно быть полностью выздоровели без признаков боли или страданий. Если боль или страдание продолжается послеоперационный 3-й день, это считается ненормальным и должны быть рассмотрены в соответствии с IACUC и животных протоколов учреждение.
- Разрешить мыши, чтобы восстановиться и тканевой инженерии кишечника расти в течение четырех недель. Дайте животным без ограничений объявление доступ к грызунов (лабораторных Диета 5001, PMI питания, Сент-Луис MO) и воды с Septra 200 мг / 40 мг в 5 мл (Привет-Tech Pharmacal, Amityville Нью-Йорк) в разведении 1:100.
4. Урожай
- HumaНели усыпить животное-хозяина через четыре недели после имплантации.
- Вновь оригинальный разрез и отражают кожи краниально для облегчения доступа к брюшной полости.
- Откройте мышечного слоя и определить тканевой инженерии конструкции, как шар ткани.
- Снимать спаек в конструкцию, внутрибрюшное внутренностей с помощью острых рассечение.
- Закрепить конструкцию в формалине для последующего монтажа парафин, или использовать ткани свежей для биохимических анализов, таких как ПЦР в реальном времени или белки изоляции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 1 показана общая схема для протокола описана здесь. В результате этого протокола является миру или сферическую структуру тканевой инженерии мышиного кишечника с просветом, слизистой оболочки, подслизистой, мышечной и окружающих. Рисунок 2А показывает типичную мире по сравнению с исходного полимера эшафот. 2B рисунок отображает ту же конструкцию Резко двустворчатых выявить его просвет. рисунке 3 показана гематоксилином / эозином окрашенного парафина монтажа сечение типичный успешный конструкции через 4 недели инкубации. В Ref. 4, мы были в состоянии производить тканевой инженерии кишечника успешно 89% случаев (39 из 44 имплантатов).
Неудачная конструкция, в которой нет формы слизистой оболочки. Нельзя судить основе валовой внешний вид во время сбора урожая ли миру придется слизистой оболочки на конечный гистологического анализа. Поэтому, если биохимические анализы performeD на свежем ткани конструкции, половина каждого миру должны быть закреплены и парафина установлены для гистологического анализа, чтобы убедиться, что слизистая оболочка присутствует в каждом образце. Неудачная конструкция будет демонстрировать только стромы и фиброзом на гематоксилином / эозином.
Рисунок 1. Схемы для производства тканевой инженерии кишечника мыши. Короче говоря, донорские ткани собирают и перерабатывают в органоид единиц. Органоид единиц загружены на пористых полигликолевой кислоты леса, который затем имплантируется в хозяина и инкубируют в течение 4 недель. Инженерные конструкции, затем извлекается и может быть охарактеризован с помощью гистологического или биохимических анализов.
Рисунок 2. Пример тканевой инженерии кишечника конструкцию собирают в 4 недели. A: Построить в комRison для исходного полимера эшафот. В: То же конструкцию, двустворчатые выявить его просвет.
Рисунок 3. Низкое энергопотребление гематоксилином / эозином микрофотография типичный успешный тканевой инженерии кишечника конструкции. Метки и стрелки указывают просвета слизистой оболочки кишечника, поджелудочной железы и приверженцем хозяина.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы представляем протокола для производства тканевой инженерии в кишечнике мыши, используя органоид единиц-на-эшафот подход. Наиболее важные шаги, принадлежат органоид подготовки единиц. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы адекватно очистки и механической обработки ткани, но равные необходимо соблюдать осторожность, чтобы не overdigest или overtriturate органоид единиц после переваривания выполняется (шаг 1,11). Если этого не будет сделано, органоид единиц можно свести к одной клетки, которые могут быть потеряны в супернатант шагом 1,12, и вряд ли смогут выжить для производства тканевой инженерии кишечника, как кишечная ниши стволовых клеток, не будут сохранены в этом случае.
Небольшой размер мыши делает ее сложной непосредственно анастомозируют тканевой инженерии конструкции в кишечник животного-хозяина, чтобы проверить его функции в живом организме. Кроме того, крысы представляют большую модель роста, которая облегчает TESI в естественных условиях анастомоза иуже было выполнено по этой причине 1. Тем не менее, размер мыши не является непреодолимым препятствием, а другие были в состоянии выполнять резекции тонкой кишки и анастомоза, 6 или аноректальной хирургии, 7 у этих животных. Для решения этих вопросов, экспериментов, чтобы охарактеризовать функции нашего тканевой инженерии кишечного конструкций в моде в пробирке продолжается. Дополнительные ограничения этого метода включают 89% успеха в поколение TESI 4. То есть, 89% OU леса загруженных будет успешно генерировать TESI. Применение этой техники другим может помочь уточнить и усовершенствовать эту методику повышения общей доходности к 100%. Кроме того, этот метод может быть улучшен, если общая масса ткани генерируются может быть увеличена. В настоящее время, проточной цитометрии показал, что общее число клеток, присутствующих в заготовленный TESI конструкция 3-раза больше, чем число присутствующих на имплантацию(3,07 х 10 6 ± 0,5 х 10 6) 4. Улучшение объем производства ТЭСИ является важным шагом на пути перевода на терапию.
Отметим также, что мышь кишечника, будучи очень тонкими стенками и малого калибра, особенно легко обрабатывать в сравнении с показателями других видов, таких как свиньи или крысы. У людей, мы ожидаем, что некоторые детали органоид подготовки единиц шаги должны быть изменены, чтобы как адекватно переваривать ткань и избежать overdigestion в одиночных камерах, в частности, концентрации диспазы и коллагеназы в пищеварении раствора и время пищеварения при 37 ° C.
Конечная цель этого метода состоит в переходе к терапии человека. Тканевая инженерия в кишечнике человека из собственной ткани пациента потенциально может предложить прочные, долгосрочные лекарства синдром короткой кишки (SBS) ни с одним из недостатков существующих методов лечения. Короткие кишечника синДром это болезненное состояние, вызванное резекцией значительную часть от общей длины тонкой кишки, как правило, превышает 50-75 процентов, такой, что его поглощающей способностью сильно уменьшается, и пациент не может получить достаточное питание от энтерального питания. 2 В детей, наиболее распространенными причинами SBS массивные резекции тонкой кишки вторичной по отношению к некротического энтероколита или мальротация с кишкой заворот кишок. 8,9 Кроме того, хотя реже, SBS может возникнуть у взрослых, потому что несколько резекций в условиях болезни Крона, или с брыжеечной ишемии вторичных сосудистых заболеваний. 10,11 Потому что SBS пациенты не могут поддерживать достаточное питание с энтерального потребления, они могут потребовать долгосрочной парентерального питания, которое само по себе может быть сложным у детей печеночная недостаточность и цирроз печени. SBS 12 пациентов Поэтому переносить значительные расходы на здравоохранение, в последнее время оценивается в порядка 1,6 млн. долл. США на одного пациентав течение 5 лет 13. текущий стандарт лечения кишечной недостаточностью средней SBS является кишечника, печени / кишечника или других multivisceral трансплантации, но это дает только 60% 5-летней выживаемости и отправляет пациента к пожизненному курс иммуносупрессивной терапии 14. Кроме того, ограниченная доступность донорского органа приводит к неизбежным несоответствием спроса и предложения и длительное время ожидания 15. Таким образом, тканевая инженерия из аутологичных тканей пациента была бы привлекательной альтернативы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Трейси C. Grikscheit, Эрик Р. Бартель, и Фредерик Г. Sala поддерживаются Калифорнийского института регенеративной медицины (CIRM), номера грантов RN2-00946-1 (TCG) и TG2-01168 (ERB, ФГС). Allison L. Speer является Общество Университет хирургов Ethicon ученый. Yashuhiro Torashima финансируется за счет Детской больницы Лос-Анджелеса Сабан-исследовательский институт стипендий развития карьеры.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS | Gibco | 114170-112 | |
| Antibiotic-Antimycotic 100X | Invitrogen | 15240-062 | |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | |
| Collagenase Type 1 | Worthington | LS004194 | |
| DMEM High Glucose 1X | Gibco | 11995-065 | |
| Heat inactivated FBS | Invitrogen | 16140-071 | |
| Biofelt 100% PGA | Concordia Medical | FELT01-1005 | For polymer preparation as in Ref. 4 |
| Poly-L-lactic acid | Durect | B6002-1 | For polymer preparation as in Ref. 4 |
| Type I Collagen, rat tail | Sigma-Aldrich | C3867-1VL | For polymer preparation as in Ref. 4 |
| Ketoprofen 100 mg/ml | Fort Dodge Animal Health | 71-KETOI-100-50 | |
| LabDiet 5001 rodent chow | LabDiet | 5001 | |
| Septra 200 mg / 40 mg per 5 ml, USP | Hi-Tech Pharmacal | 50383-824-16 | |
| Isoflurane, USP | Phoenix Pharmaceuticals | 57319-507-06 |
References
- Grikscheit, T. C., Siddique, A., Ochoa, E. R., et al. Tissue-engineered small intestine improves recovery after massive small bowel resection. Ann. Surg. 240, 748-754 (2004).
- Wales, P. W., Christison-Lagay, E. R. Short bowel syndrome: epidemiology and etiology. Sem. Ped. Surg. 19, 3-9 (2010).
- Evans, G. S., Flint, N., Somers, A. S., et al. The development of a method for the preparation of rat intestinal epithelial cell primary cultures. J. Cell Sci. 101, 219-231 (1992).
- Sala, F. G., Matthews, J. A., Speer, A. L., et al. A multicellular approach forms a significant amount of tissue-engineered small intestine in the mouse. Tiss. Eng. Part A. 17, 1841-1850 (2011).
- Speer, A. L., Sala, F. G., Matthews, J. A., Grikscheit, T. C. Murine tissue-engineered stomach demonstrates epithelial differentiation. J. Surg. Res. 171, 6-14 (2011).
- Haxhija, E. Q., Yang, H., Spencer, A. U., et al. Intestinal epithelial cell proliferation is dependent on the site of massive small bowel resection. Pediatr. Surg. Int. 23, 379-390 (2007).
- Zhao, L., Cheng, Z., Dhall, D., et al. A novel corrective pullthrough surgery in a mouse model of Hirschsprung's disease. J. Pediatr. Surg. 44, 759-766 (2009).
- Petrosyan, M., Guner, Y. S., Williams, M., et al. Current concepts regarding the pathogenesis of necrotizing enterocolitis. Ped. Surg. Int. 25, 309-318 (2009).
- Shew, S. B. Surgical concerns in malrotation and midgut volvulus. Ped. Radiol. 39, S167-S171 (2009).
- Sampietro, G. M., Corsi, F., Maconi, G., et al. Prospective study of long-term results and prognostic factors after conservative surgery for small bowel Crohn's disease. Clin. Gastroenterol. Hepatol. 7, 183-191 (2009).
- Klempnauer, J., Grothues, F., Bektas, H., Pichlmayr, R. Long-term results after surgery for acute mesenteric ischemia. Surgery. , 121-239 (1997).
- Fitzgibbons, S. C., Jones, B. A., Hull, M. A., et al. Relationship between biopsy-proven parenteral nutrition-associated liver fibrosis and biochemical cholestasis in children with short bowel syndrome. J. Ped. Surg. 45, 95-99 (2010).
- Spencer, A. U., Kovacevich, D., McKinney-Barnett, M., et al. Pediatric short bowel syndrome: the cost of comprehensive care. Am. J. Clin. Nutr. 88, 1552-1559 (2008).
- Kato, T., Tzakis, A. G., Selvaggi, G., et al. Intestinal and multivisceral transplantation in children. Ann. Surg. 243, 756-766 (2006).
- Reyes, J., Bueno, J., Kocoshis, S., et al. Current status of intestinal transplantation in children. J. Ped. Surg. 33, 243-254 (1998).
