Summary
Bu makalede ve beraberindeki video bir organoid üniteleri-on-iskele yaklaşımı kullanarak, fare doku mühendisliği bağırsak üretmek için bizim protokol sunuyoruz.
Abstract
Doku mühendisliği ince bağırsak (TESI) başarıyla 40 gün içinde ameliyat öncesi ağırlıklarına dönmek sonuçlanan masif ince barsak rezeksiyonu sonrası Lewis fareleri kurtarmak için kullanılır olmuştur. İnsanlarda 1, masif ince barsak rezeksiyonu kısa barsak sendromu, fonksiyonel malabsorbtif neden olabilir önemli morbidite, mortalite ve parenteral beslenme bağımlılığı, karaciğer yetmezliği ve siroz ve multivisceral organ nakli ihtiyacı. 2 Bu yazıda da dahil olmak üzere sağlık giderleri bahşeder devlet, bir fare modelinde doku mühendisliği bağırsak oluşturmak için bizim protokol tanımlamak ve belgelemek çok hücreli organoid üniteleri-on-iskele yaklaşım. Organoid adet mukozal ve mezenkimal hem elementleri içeren bağırsak türetilen çokhücreli agrega, 3 intestinal kök hücre niş korur aralarında ilişki vardır. Süregelen ve gelecekteki araştırmalarda 4, içine bizim tekniği geçişiFare bu türün mevcut transgenik araçları kullanarak TESI oluşumu sırasında söz süreçlerin incelenmesi için izin verecektir. immünkompromize fare suşları 5 durumu da bize insan intestinal doku tekniği uygulamak ve bir insan TESI oluşumunu optimize etmek için izin verir insanlar içine onun geçiş öncesi fare ksenogreft. Bizim metodumuz iyi üretim uygulamaları (GMP) reaktifleri ve zaten insan hastalarda kullanım için onaylanmıştır ve bu nedenle decellularized hayvansal dokular güvenmemeniz yaklaşımlar üzerinde önemli bir avantaj sunuyor oylandı malzemeler kullanmaktadır. Bu yöntemin nihai hedefi kısa barsak sendromu için bir rejeneratif tıp tedavi stratejisi olarak insanlar onun çevirisidir.
Protocol
1. Organoid Üniteleri Hazırlık
- Fare diseksiyon (makas ve forseps) için uygun Araçlar otoklav ile sterilize edilmelidir.
- Insanca yerel IACUC protokollere göre donör fare ötenazi. Hayvan geçmeden önce ölü olduğundan emin olun.
- Periton boşluğuna erişmek için bir orta hat kesi olun. Pozlama geliştirmek için gerektiği gibi cilt flepleri yansıtılabilir.
- Ince bağırsak canı çıksın ve Treitz ligamanı hemen distalinde bölün. Keskin ve yumuşak künt diseksiyon kullanarak mezenterden ince bağırsak ayırın. Ileoçekal bileşke belirlemek ve bu proksimal ince barsak 5 mm bölün.
- Makas kullanılarak, (Invitrogen, anti-anti) 10 ml 4 ° C, steril Hanks 'tamponlu salin (HBSS, Invitrogen, Carlsbad, CA) / 1X-antifungal antibiyotik olan bir Petri tabağına antimezenterik sınır boyunca uzunlamasına çözelti bağırsak açın. Ile açılmış bağırsak dışkı TemizleYumuşak ajitasyon sonra, 10 ml 4 ° C, steril HBSS / 1X anti-anti ile bir 15 ml santrifüj tüpüne açılmış bağırsak aktarın.
- 4 10 ml açılmış bağırsak üç kez yıkayın ° C arasında, bir test tüpü içinde anti-anti steril HBSS / 1X. Her yıkama 30 sn için 15 ml tüp hafif sallama ile gerçekleştirilebilir. Çalkaladıktan sonra, bağırsak doku tüpün altına düşer. Mezenkimal debris yüzen madde, atın. Bir pipet yardımıyla dikkatlice yıkanması çözüm çıkarın.
- 4 10 ml bir Petri kabındaki yıkanmış bağırsak Kıyma ° C, steril HBSS / makas kullanılarak en az 1 mm kare parçalara 1X anti-anti. Otomatik bir pipet yardımıyla kıyma malzeme toplamak ve bir test tüpüne yerleştirin.
- 8 dakika boyunca 500 rpm'de tüp santrifüjleyin. Yağ ve mezenşimi içeren süpernatant, atın.
- Steril HBSS / 1X anti-anti artı 0.125 mg / ml dispase (Invitrogen) ve 800 birim / m ile 10 ml kıyılmış ve yıkanmış malzeme, Digestl kollajenaz tip 1 (Worthington, Lakewood NJ). Sindirim çözelti, 40 ml hazırlamak için, dispase, kollajenaz 142 mg 5 mg tartmak, ve 40 ml bir hacme kadar steril HBSS kadar ekleyin. Her defasında taze organoid birimleri hazırlanan bu çözüm hazırlayın ve kullanmak için 4 ° C kadar hazır tutun. Adım 1.8 'den direkt olarak pelet sindirim solüsyonu eklenir.
- 20 dk için 37 ° C 'de sindirim çözelti ile kıyılmış ve yıkanmış malzeme içeren test tüpü inkübe edin.
- Test tüpü ayrıca alma ve 10 ml lik bir pipet ile tritürasyon ile sindirilmiş doku bozar. Düzgün bir görüntü elde edilinceye kadar 20 ila 50 kez arasında tekrarlayın.
- 800 rpm'de 5 dakika süreyle test tüpü santrifüjleyin. Tek hücre içeren süpernatant, atın.
- 4 ° C, steril Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı (DMEM, Invitrogen) artı% 10 v / v ısı ile inaktive edilmiş fetal bovin serumu (HI-FBS, Invitrogen) 10 ml sindirim reaksiyonu durdurun. Pelle süspanset ve tüp sallayın.
- 800 rpm'de 5 dakika süreyle test tüpü santrifüjleyin. Son birkaç damla kadar otomatik bir pipet yardımıyla dikkatlice Süpernatantı. Pelet resuspending önlemek için son birkaç damla için tek kullanımlık plastik pipet kullanın.
2. Poliglikolik Asit İskele yüklenmesi
- Gibi Ref tarif; nonwoven poliglikolik asit (porozite>% 95, Concordia Elyaf, Coventry RI 2 mm sac kalınlığı, 60 mg cm-3 yığın yoğunluğu) gelen Form 2-mm uzunluğunda, 5 mm dış çaplı silindirik iskelelerinin. 4.
- Distile su içinde% 70 etanol ile hazırlanmış makasla Öneri atılabilir 1.000 mikrolitre pipeti distal 2 mm kesin.
- 4 kuyu kültür plaka içine iskele yerleştirin. Birinci lümen içine ve daha sonra dış yüzey üzerine, 1.000 mikrolitre pipeti ile iskele üzerine organoid birimleri yerleştirin. Lümeninin kaplama sağlamak için bir forseps kullanın. Bozabilir veya polimer silindir şeklinde açık bozmayın.
3. Makine Fare içine İmplantasyonu
- Donör varsa aynı arka plan üzerine bir singenik ana farenizi kullanın. Aksi takdirde, bir immün obez olmayan diyabetik (Jackson Laboratuvarları, Sacramento CA) hayvan / ağır kombine immün yetmezliği veya NOD / SCID kullanır.
- Izofluran ile genel anestezi øndükle. , Hazırlık Tıraş ve fare karın asmak.
- Periton boşluğuna giriş kazanmak için 5 mm'lik bir orta hat kesi olun. Belirleyin ve dikkatlice omentum bağırsaklarını. Omentum üzerine yüklenen polimer yerleştirin ve doku ile sarın. Omentum yırtmayın.
- 5-0 monocryl sütür ile omentuma polimer sabitleyin. Yavaşça kendi anatomik pozisyonuna sarılmış polimer ile omentum değiştirin.
- 4-0 vikril sütür kullanarak kat insizyon kapatın. Kas kapatma çalıştırın ve kesi altında abdominal organları kesmemeye dikkat edin. Cilt için suturlarla kullanın.
- Kesi bitişik bir subkutan kabarıklık olarak steril su içinde 2 mg / kg ketoprofen (Ketofen, Fort Dodge Hayvan Sağlığı) ile postoperatif analjezi Yönet. Hayvanlar günlük olarak değerlendirilmelidir ve hayvan ağrı veya acı belirtileri gösteren ise, ketoprofen, ek bir doz ameliyat sonrası 2. günde tatbik edilebilir. Ameliyat sonrası üçüncü gününde, hayvan tam ağrı veya sıkıntı olmaksızın iyileşti edilmelidir. Ağrı veya sıkıntı post operatif 3. gün devam ederse, bu anormal kabul edilir ve IACUC ve hayvan bakım tesisi protokoller çerçevesinde ele alınmalıdır.
- Iyileşmek için fare ve doku mühendisliği bağırsak dört hafta boyunca büyümeye izin verin. Kemirgen chow (Lab Diyet 5001, PMI Beslenme, St Louis MO) ve 5 ml (Hi-Tech Pharmacol, Amityville NY) 1:100 dilüsyon başına Septra 200 mg / 40 mg ile su hayvan ad libitum erişimi verin.
4. Hasat
- Humanely dört hafta implantasyonu sonrası ana hayvan ötenazi.
- Orijinal kesi yeniden açın ve cilt yansıtan periton boşluğuna ulaşımı kolaylaştırmak için sefalad.
- Kas tabakası açın ve doku bir küre olarak doku mühendisliği yapı tanımlar.
- Keskin diseksiyon kullanarak intraabdominal organlar gelen yapı yapıştıkları aşağı atın.
- Montaj sonra parafin için formalin yapı Fix, ya da real-time PCR veya protein izolasyonu gibi biyokimyasal testler için taze doku kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1 burada belgelenen protokolü için genel bir şema göstermektedir. Bu protokolün sonuç aynı yapı görüntüleyen bir lümen, mukoza, submukoza ve muskularis. Şekil 2A çevreleyen bir başlangıç polimer iskele. Şekil 2B karşılaştırıldığında tipik bir dünya gösterir ile doku mühendisliği murin bağırsağın bir dünya veya küresel bir yapıdır keskin onun lümen ortaya bivalved. Şekil 3 inkübasyondan 4 hafta sonra tipik başarılı yapı bir Hematoksilen / eozin boyalı parafin monte kesiti göstermektedir. Ref. 4, biz (44 implantlar 39 üzerinden) zaman doku mühendisliği bağırsak başarıyla% 89 üretmek başardık.
Bir başarısız yapı içinde herhangi bir mukoza formları biridir. Bu dünyanın sonu histolojik analiz mukoza olup olmayacağını hasat brüt görünümü dayalı yargılamak imkansızdır. Biyokimyasal testler performe vardır Bu nedenle eğerd taze doku yapısı üzerinde, her bir yarım küre sabit olmalıdır ve parafin olduğu mukoza her bir numune içinde mevcut olduğunu teyit etmek için histolojik analiz için monte edilmiştir. Başarısız bir yapı Hematoksilen / eozin boyama sadece stroma ve fibrozis gösterecektir.
Şekil 1. Fare doku mühendisliği bağırsak üretimi için Şema. Kısaca, donör doku organoid birimler halinde hasat ve işlenir. Organoid birimleri daha sonra bir dizi içine implante edilerek 4 hafta süreyle inkübe izin gözenekli poliglikolik asit iskele, yüklenir. Üretimli yapı daha sonra alınır ve histoloji veya biyokimyasal testler ile karakterize edilebilir.
Şekil 2. Doku mühendisliği bağırsak Örnek 4 hafta hasat yapıtaşıdır. A: iştigal ConstructPolimer iskele başlamadan Rison. B: onun lümen ortaya bivalved aynı yapı.
Şekil 3. Tipik başarılı doku mühendisliği bağırsak yapı Düşük güç Hematoksilen / eozin mikrografı. Etiketler ve oklar mukozanın lümen ve yapışık ana pankreas göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz bir organoid üniteleri-on-iskele yaklaşım kullanarak fare doku mühendisliği bağırsak üretmek için bir protokol mevcut. En kritik adımlar organoid birimlerin hazırlanması olanlardır. Bakım yeterince temiz ve mekanik doku işleme alınmalıdır, ancak sindirim gerçekleştirildikten sonra eşit bakım (adım 1.11) organoid birimleri overdigest ya overtriturate için değil alınmalıdır. Eğer bu yapılırsa, organoid birimleri adım 1.12 süpernatant içinde kaybolmuş olabilir tek hücreler, azaltılmış, ve doku mühendisliği bağırsak üretmek için hayatta kalmak için olası olabilir, bağırsak kök hücre niş olarak bu korunmuş olmaz durumda.
Farenin küçük boyutu doğrudan in vivo işlevi sınamak için ana hayvanın bağırsak doku mühendisliği yapı anastomoze zorlaştırır. Alternatif olarak, sıçan vivo anastomoz kolaylaştırır TESI büyüme için daha büyük bir model temsil eder veZaten bu nedenle 1 için yapılmıştır. Başkaları bu hayvanlarda ince barsak rezeksiyonu ve anastomoz, 6 veya anorektal cerrahi, 7 gerçekleştirmek mümkün olmuştur gibi Yine, fare boyutu, bir aşılmaz engel değildir. Vitro moda bir bizim doku mühendisliği intestinal yapıların işlevini karakterize etmek için bu konuları, deneyler çözmek için devam etmektedir. Bu tekniğe ek sınırlamalar TESI 4 nesil bir% 89 başarı oranı vardır. Yani, OU yüklenen iskelelerinin% 89 başarıyla TESI üretecektir. Başkaları tarafından bu tekniğin uygulama% 100 toplam verimi artırarak bu tekniği geliştirme ve iyileştirmeye yardımcı olabilir. Oluşturulan toplam doku kitlesi artırılabilir Buna ek olarak, bu teknik geliştirilebilir. Şu anda, akış sitometrisi hasat TESI yapıda mevcut hücrelerin toplam sayısını implantasyon sayı mevcut göre, 3 kat daha fazla olduğunu ortaya koymuştur(3.07 x 10 6 ± 0,5 x 10 6) 4. TESI üretim hacmi artırma tedaviye çeviri yönünde önemli bir adımdır.
Bu fare bağırsak, çok ince çeperli ve küçük çapta olan, örneğin domuz veya fare gibi diğer türlerin bu göre işlemek için özellikle kolay olduğu da not edin. İnsanlarda, bu organoid birimlerinin hazırlanmasında adımların bazı ayrıntıları ile modifiye edilmesi gerekir ki beklemek her ikisi de yeterli doku sindirimi ve özellikle de, tek bir hücre için overdigestion önlemek sindirim çözelti içinde dispase ve kollajenaz konsantrasyonları ve bir saat 37 sindirim ° C
Bu tekniğin asıl amacının insan tedavisi için bir geçiştir. Hastanın kendi dokusundan insan bağırsağında Doku mühendisliği potansiyel mevcut tedavilerin sakıncaları hiçbiri ile kısa barsak sendromu (SBS) için dayanıklı, uzun süreli tedavi sunabilir. Kısa barsak sendromusendromu olan hazmetme kapasitesi ciddi azalır ve hasta enteral beslenme yeterli besin alamıyor böyle ince barsağın toplam uzunluğu, genellikle büyüktür 50-75 oranında, önemli bir fraksiyonun rezeksiyon neden marazi bir durumdur. 2'de Çocukların, SBS en sık nedenleri daha az yaygın olsa da 8,9 Ayrıca, SBS nedeniyle Crohn hastalığının ortamda birden rezeksiyon yetişkinlerde de görülebilir. ortabağırsak volvulusla nekrotizan enterokolit veya malrotasyon sekonder masif ince barsak rezeksiyonu, ya da birlikte damar hastalığına sekonder mezenterik iskemi. 10,11 SBS hastalarda enteral alımı ile yeterli besin muhafaza edemez, çünkü onlar kendisinin karaciğer yetmezliği ve siroz ile çocuklarda karmaşık olabilir uzun süreli total parenteral beslenme, gerektirebilir. 12. SBS hastaların nedenle önemlidir tahammül sağlık masrafları, son zamanlarda hasta başına $ 1,6 milyon sipariş üzerine olduğu tahminSBS sekonder intestinal yetmezlik için bakım 5 yıldır. 13. geçerli standart bağırsak, karaciğer / bağırsak veya diğer multivisceral nakli, ama bu sadece 60% 5-yıllık sağkalım bahşeder ve immünsüpresif tedavi ömür boyu ders hastanın consigns . 14. Ayrıca, talep ve arz ve uzun bekleme süreleri kaçınılmaz bir uyuşmazlıkla sınırlı bir donör organ miktarı sonuçlar. 15. Bu nedenle, hastanın otolog doku doku mühendisliği çekici bir alternatif olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Tracy C. Grikscheit, Erik R. Barthel ve Frédéric G. Sala California Rejeneratif Tıp Enstitüsü (CIRM), hibe numaraları RN2-00946-1 (TCG) ve TG2-01168 (ERB, FSG) tarafından desteklenmektedir. Allison L. Speer Üniversitesi Cerrahlar Ethicon bilgin bir Derneği'dir. Yashuhiro Torashima Bir Çocuk Hastanesi Los Angeles Saban Enstitüsü Araştırma Kariyer Geliştirme Bursu tarafından finanse edilmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS | Gibco | 114170-112 | |
| Antibiotic-Antimycotic 100X | Invitrogen | 15240-062 | |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | |
| Collagenase Type 1 | Worthington | LS004194 | |
| DMEM High Glucose 1X | Gibco | 11995-065 | |
| Heat inactivated FBS | Invitrogen | 16140-071 | |
| Biofelt 100% PGA | Concordia Medical | FELT01-1005 | For polymer preparation as in Ref. 4 |
| Poly-L-lactic acid | Durect | B6002-1 | For polymer preparation as in Ref. 4 |
| Type I Collagen, rat tail | Sigma-Aldrich | C3867-1VL | For polymer preparation as in Ref. 4 |
| Ketoprofen 100 mg/ml | Fort Dodge Animal Health | 71-KETOI-100-50 | |
| LabDiet 5001 rodent chow | LabDiet | 5001 | |
| Septra 200 mg / 40 mg per 5 ml, USP | Hi-Tech Pharmacal | 50383-824-16 | |
| Isoflurane, USP | Phoenix Pharmaceuticals | 57319-507-06 |
References
- Grikscheit, T. C., Siddique, A., Ochoa, E. R., et al. Tissue-engineered small intestine improves recovery after massive small bowel resection. Ann. Surg. 240, 748-754 (2004).
- Wales, P. W., Christison-Lagay, E. R. Short bowel syndrome: epidemiology and etiology. Sem. Ped. Surg. 19, 3-9 (2010).
- Evans, G. S., Flint, N., Somers, A. S., et al. The development of a method for the preparation of rat intestinal epithelial cell primary cultures. J. Cell Sci. 101, 219-231 (1992).
- Sala, F. G., Matthews, J. A., Speer, A. L., et al. A multicellular approach forms a significant amount of tissue-engineered small intestine in the mouse. Tiss. Eng. Part A. 17, 1841-1850 (2011).
- Speer, A. L., Sala, F. G., Matthews, J. A., Grikscheit, T. C. Murine tissue-engineered stomach demonstrates epithelial differentiation. J. Surg. Res. 171, 6-14 (2011).
- Haxhija, E. Q., Yang, H., Spencer, A. U., et al. Intestinal epithelial cell proliferation is dependent on the site of massive small bowel resection. Pediatr. Surg. Int. 23, 379-390 (2007).
- Zhao, L., Cheng, Z., Dhall, D., et al. A novel corrective pullthrough surgery in a mouse model of Hirschsprung's disease. J. Pediatr. Surg. 44, 759-766 (2009).
- Petrosyan, M., Guner, Y. S., Williams, M., et al. Current concepts regarding the pathogenesis of necrotizing enterocolitis. Ped. Surg. Int. 25, 309-318 (2009).
- Shew, S. B. Surgical concerns in malrotation and midgut volvulus. Ped. Radiol. 39, S167-S171 (2009).
- Sampietro, G. M., Corsi, F., Maconi, G., et al. Prospective study of long-term results and prognostic factors after conservative surgery for small bowel Crohn's disease. Clin. Gastroenterol. Hepatol. 7, 183-191 (2009).
- Klempnauer, J., Grothues, F., Bektas, H., Pichlmayr, R. Long-term results after surgery for acute mesenteric ischemia. Surgery. , 121-239 (1997).
- Fitzgibbons, S. C., Jones, B. A., Hull, M. A., et al. Relationship between biopsy-proven parenteral nutrition-associated liver fibrosis and biochemical cholestasis in children with short bowel syndrome. J. Ped. Surg. 45, 95-99 (2010).
- Spencer, A. U., Kovacevich, D., McKinney-Barnett, M., et al. Pediatric short bowel syndrome: the cost of comprehensive care. Am. J. Clin. Nutr. 88, 1552-1559 (2008).
- Kato, T., Tzakis, A. G., Selvaggi, G., et al. Intestinal and multivisceral transplantation in children. Ann. Surg. 243, 756-766 (2006).
- Reyes, J., Bueno, J., Kocoshis, S., et al. Current status of intestinal transplantation in children. J. Ped. Surg. 33, 243-254 (1998).
