Summary
والغرض من هذا الفيديو هو إظهار إجراءات الحصول على صحي، وخلايا الشعر سليمة من الأجهزة الأذن الداخلية من الزرد الكبار ومن ثم استخدامها للدراسات المشبك التصحيح تهدف إلى تحديد خواص الفيزيائية الحيوية من القنوات الجهد بوابات بهم.
Abstract
وقد وصفت التحليلات المشبك التصحيح من القنوات الجهد مسور في الخلايا الحسية الشعر معزولة عن مجموعة متنوعة من الأنواع سابقا 1-4 لكن هذا الفيديو يمثل أول تطبيق لتلك التقنيات إلى خلايا الشعر من الزرد. نحن هنا يبرهن على وجود طريقة لعزل صحي، وخلايا الشعر سليمة من جميع الأجهزة في نهاية الأذن الداخلية: كيس، والحوقلة، والقنوات الهلالية utricle. علاوة على ذلك، علينا أن نبرهن على التنوع في حجم خلية الشعر والصرف وإعطاء مثال لهذا النوع من التسجيلات المشبك التصحيح التي يمكن الحصول عليها. ميزة استخدام هذا النظام النموذجي الزرد على الآخرين نابع من توافر المسوخ الزرد أن تؤثر على كل من السمع والتوازن. في تركيبة مع استخدام خطوط المعدلة وراثيا وغيرها من التقنيات التي تستخدم التحليل الجيني والتلاعب، وعزل الخلايا الكهربية وطرق عرض هنا ينبغي تسهيل مزيد من التبصر في خلايا الشعر أدوار عيكمن في الوساطة هذه الطرائق الحسية.
Protocol
1. قبل التجريبية الاستعدادات
- إعداد ست حلول (انظر الجدول 1 للتركيبات): (أ) 100 مل NZR (عادي الزرد رينغر) و (ب) 50 مل NZR + Tricaine (MS222) و (ج) 10 مل NZR + BSA، (د) 100 لوكاس مل (الأقل كا حل + 2)، (ه) 10 مل + لوكاس غراء، (و) 100 مل +-K الداخلية حل. حلول (أ) و (ب) و (د) ويمكن (و) يتم تخزينها لمدة تصل إلى شهر واحد في C. ° 4 حلول (ج) و (ه) يعد اليوم من التجريب. يجب أن تكون جميع الحلول في درجة حرارة الغرفة قبل بدء التجارب.
- التسمية وملء أربع أطباق بتري 35 مم في منتصف المسافة تقريبا مع حلول (أ) و (ج) و (د) و (ه).
- تقديم طبق تشريح عن طريق ملء طبق بتري 60 مم مع Sylgard (داو كورنينج وميدلاند، MI) ومن ثم قطع تجويف فيه من شأنها أن تسمح لسمكة الجلوس في وضع مستقيم من دون أن يقلب.
- إعداد ما لا يقل عن اثنين من الأدوات العزلة الخلية في نهاية الإلتصاق جريب الشعر في لكلب إلى نهاية كأسماصة باستور مع superglue، والسماح للشعر لتمديد بعد نهاية ماصة بنحو 0.5 سم. الشعر من الكلاب لينة مفرى مثل لابرادور ريتريفر وWeimaraners تعمل بشكل جيد.
2. عزل السمعية والدهليزية المتاهة
- التضحية بأحد الزرد الكبار عن طريق الغمر في كوب يحتوي على NZR + Tricaine. رصد بصريا حتى الخياشيم جميع الحركات وصادي قد توقفت. الانتظار لعشر دقائق إضافية قبل إزالة الأسماك والشطف مع NZR الطازجة. وقد تمت الموافقة على هذه الإجراءات من قبل رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة (IACUC) من جامعة ببردين ولكن يجب الحصول على موافقة من مؤسسة الخاصة بك.
- دبوس الأسماك إلى جانب طبق تشريح الظهرية يصل عن طريق إدراج 1 دبوس الخياطة القياسية على التوالي (حوالي 2.5 سم طويلة) من خلال كل محجر العين ودبوس ثالث من خلال محور ظهري بطني، حوالي ثلث إلى نصف المسافة من الرأس الى الذيل كما هو موضح فيالرقم 1A.
- تحت التكبير (0.62-5X) ستيريو المجهر تشريح مزودة العدسات 10X، استخدم مقص الربيع (الجميلة كتالوج أدوات العلوم 15000-02 عدد) لفضح الدماغ وقطعة صغيرة من الحبل الشوكي عن طريق إزالة سقف الجمجمة من نقطة تقريبا 0.5 سم الذيلية إلى مستوى الخياشيم إلى الأمام إلى الأنف من الأسماك. قطع الحبل الشوكي والدماغ مع رفع غرامة ملقط (الجميلة كتالوج أدوات العلوم 11251-30 عدد)، في حين قطع الأعصاب في العمود الفقري والمرفقات الأخرى، وإزالة الدماغ وتجاهل (1B الشكل).
- النصف البطنية من الكبسولة الجمجمة التي لا تزال تشكل "وعاء" الذي يحتوي على أجهزة الأذن الداخلية. مراقبة والأبيض البارز، otoliths مبهمة في lagenas والكييس بشكل متناظر في نهاية كل الذيلية الأذن الداخلية وotoliths utricle وضع أفقيا أكثر rostrally (1C وأرقام 4A).
- إزالة وعاء من العظام عن طريق قطع جميع attachmen بطني والجانبيةTS في حين رفع برفق خارج الرأس مع ملقط الغرامة. وضعه في طبق بتري تحتوي على لوكاس (1D أرقام و4B).
- باستخدام اثنين من أزواج من ملقط غرامة، وبصرف النظر الكراك وعاء في خط الوسط عن طريق الاستيلاء على حواف إما الوحشي للعظم ومنهم الى جانب سحب أو بدلا من ذلك، فصل نصفين الأيمن والأيسر عن طريق إدراج النقاط للملقط في الوسط والتحديق في نصفي وبصرف النظر. إزالة متاهات اثنين من العظام باستخدام ملقط غرامة (الشكل 2).
- تفقد متاهات لتحديد السمعية والدهليزية نهاية الأجهزة: القنوات الهلالية، utricles، والكييس lagenas (الشكل 4C). المناطق ردي تحت كل otolith هي بقع تحتوي على خلايا الشعر. وبالمثل، شريط من اللون الوردي داخل الأمبولات من القنوات الهلالية يحدد قبيبة حيث توجد خلايا الشعر.
- إزالة بعناية otoliths من الحوقلة وباستخدام ملقط utricle الجميلة (
3. الشعر زنزانة انفرادية
- باستخدام ماصة نقل البلاستيك (فيشر العلمية رقم الكتالوج 13-711-9:00)، نقل إلى نهاية الأجهزة التي تحتوي على طبق لوكاس + غراء التقليل من حجم السوائل المنقولة.
- احتضان هذه الهياكل في هذا الحل لمدة ثلاثين دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- في نهاية فترة الحضانة، حرك الهياكل إلى الطبق يحتوي على NZR + BSA واحتضان في هذا الحل للا يقل عن ثلاثين دقيقة. وخلايا الشعر البقاء بصحة جيدة في هذا الحل لمدة تصل إلى أربع ساعات ولكن سوف تتدهور بعد 1-2 ساعات بعد العزلة (انظر الخطوات التالية).
- تمهيدا لعزل الخلايا، نقل أحد الأجهزة نهاية إلى الطبق يحتوي على NZR.
- لlagenas وutricles، استخدم الشعر الكلب لرفع بلطف الأوراق بقع-TI الظهارية من رديssue التي تحتوي على خلايا الشعر (الشكل 3A). يمكن للبقع مغروف (باستخدام شعرة الكلب) من تحت otoliths من الكييس، وقبيبات من مواقعها داخل الأمبولات من القنوات الهلالية.
- باستخدام اثنين من الأدوات العزلة الخلية أعدت في الخطوة 1.4، يسحن على البقعة أو قبيبة لتوليد حقل الحطام الذي يحتوي على خلايا الشعر (الشكل 3B). السماح للخلايا على الأقل خمس دقائق لتترسب على قاع الطبق قبل نقله.
- الانتقال الطبق إلى مرحلة مجهر مقلوب مجهزة البصريات النقيض المرحلة. مراقبة الخلايا تحت التكبير 40X ونلاحظ التنوع في التشكل. العديد من الخلايا هي الأفوكادو على شكل والبعض الآخر تكون طويلة ورقيقة. وجود حزم قمية الشعر يحدد لهم كما خلايا الشعر والتخلص سطوع يؤكد صحتها. وتظهر Photomicrographs من خلايا الشعر معزولة في الشكل 5.
4. التصحيح المشبك خلايا الشعر اسماك الزرد
- استعدادا لperfoتصنيف التسجيلات التصحيح 5،6، وإعداد الأمفوتريسين المحتوية على الحل الداخلي على النحو التالي: 5 ملغ مكان الأمفوتريسين B (سيغما A4888) في أنبوب مل 1.5 و ميكروسنتريفوج ملء مع 100 ميكرولتر DMSO. دوامة الفور هذا الحل لمدة 10-20 ثانية حتى يذوب كل من الأمفوتريسين. ثم، ماصة 625 ميكرولتر K +-الداخلية إلى حل أنبوب microcentrifuge الثاني. إضافة 10 ميكرولتر من محلول الأمفوتريسين إلى K +-الداخلي ودوامة الحل على النحو الوارد أعلاه. والحل الأمفوتريسين السهم آخر عدة ساعات ولكن تجاهل الحل النهائي بعد ساعة واحدة.
- افتعال ماصات التصحيح من البورسليكات الزجاج BF 150-86-10 (سوتر الآلات) باستخدام مجتذب متعددة المراحل (سوتر P-1000). يجب أن تقلب ماصات بأقطار من حوالي 2 ميكرومتر وسيكون لها المقاومة. 1-3 MΩ مع الحلول في الجدول 1. الإعدادات على مجتذب التي تعمل بشكل جيد على النحو التالي: الحرارة = منحدر minus10، سحب = 0، السرعة = 18، والتأخر = 1، الضغط = 600. شكلغيض من ماصة جيدة هو واضح من الصورة في ج أقحم من الشكل 5. ويفضل فظة "على شكل رصاصة" ماصات لأنها توفر المقاومة الأقل الوصول خلال التسجيلات الكهربية.
- استخدام المحاقن في 28 Microfil إبرة قياس (MF28G-5؛ أدوات دقيقة العالمي) لملء القطب تسجيل في منتصف الطريق مع الأمفوتريسين K +-المحتوية على حل داخلي.
- يضعوا القطب إلى headstage من مكبر للصوت التصحيح المشبك. تطبيق -10 بالسيارات، 10 مللي الخطوات الجهد في 10 هرتز والحفاظ على الضغط الإيجابي في القطب كما هو بالمناورة من خلال واجهة الهواء / الحل وصولا الى الجزء السفلي من الطبق تسجيل بالقرب من الخلايا.
- وضع القطب الكهربائي orthogonally إلى خلية سليمة يبحث. عندما القطب بالقرب كافية إلى الخلية بحيث يبدأ الابتعاد عن الحل خارج المتدفقة، عكس الضغط بسرعة، وتطبيق فراغ خفيف إلى القطب حتى الخلية "يقفز" على ذلك. توقف فورا على شفط الالقطب الإلكتروني وتطبيق المحتملة عقد -70 بالسيارات إلى داخل القطب. في غضون ثوان قليلة سوف تشكل ختم gigaohm.
- مراقبة العابرين بالسعة الحالية في بداية وإنهاء الخطوات التي تظهر الجهد قريبا بعد تشكيل الختم. يواصل رصد ثقب في الغشاء تحت القطب من خلال مشاهدة الأمفوتريسين كما العابرين يتنامى حجمها إلى حجمها الأقصى (في حوالي عشر دقائق).
- لتأكيد إنشاء التكوين (مثقب) خلية كاملة في زنزانة صحية، تثير الخارج K + التيارات من خلال تطبيق hyperpolarizing وإزالة إستقطاب الخطوات من الجهد. معظم الخلايا الشعر لديك تيارات بارزة إلى الخارج (انظر الشكل 6).
5. ممثل النتائج
ويبين الشكل 4 الصور الملتقطة خلال الخطوات من العزلة الخلية. في لوحة A، ويمكن أن ينظر إلى otoliths المرتبطة saccluli، وlagenas وutricles throuغ طبقة رقيقة من العظم الذي يعتلي لهم. هذه الهياكل مبهمة المعالم توفير مريحة للمساعدة في إزالة آمنة من الأجهزة نهاية من الحيوان أثناء الخطوات اللاحقة للتشريح. لوحة B يظهر "صحن" من العظم الذي يحتوي على المتاهات سليمة وotoliths بارزة في lagenas، utricles والكييس. لوحة C يظهر متاهة التي تم إزالتها من العظام. لاحظ otolith كبيرة مع حافة صدفي في الحوقلة، وجليد على شكل otolith في الكييس وotolith على شكل حبة في utricle. ويتضح من بعض التنوع في الحجم والتشكل ينظر في الخلايا معزولة عن الحوقلة في الشكل 5. يتم التعرف بسهولة خلية صحية باعتبارها مرحلة مشرقة مع محيط حادة. يمكن الأشكال خلية تنقسم إلى فئتين: الأفوكادو على شكل (الشرطة السرية) وطويلة ورقيقة (THN) على الرغم من أن أحجام الخلايا داخل كل مجموعة يمكن أن تختلف بشكل ملحوظ (قارن على سبيل المثال AVO 1 و AVO 3). أقحم أظهرت مجموعة منوليس ثلاثة الخلايا التي معزولة تماما عن بعضها البعض. اللون الأسود وظهور حبيبات من الخلية في ب أقحم يحدد بسهولة هذه الخلية في عداد الموتى. ج أقحم يبين غيض من ماصة التصحيح يوضح الشكل والأبعاد المناسبة لتسجيل من هذه الخلايا.
تم الحصول على آثار الحالية هو موضح في الشكل 6 ردا على hyperpolarizing وإزالة إستقطاب الخطوات المحتملة المفروضة على خلية مشابهة لالحوقلة الشرطة السرية هو موضح في الشكل 2 5. يمكن الاستجابات الحالية في الخلايا من مختلف الأحجام والأشكال تختلف على نطاق واسع يشير إلى التنوع في تكملة الجهد بوابات قنوات.
1-3 الأرقام: توضح الخطوات الكرتون في عزل خلايا الشعر.
الشكل 1. إزالة من capsu الجمجمةجنيه تحتوي على متاهات الأذن الداخلية من الزرد. A. PIN ضحى الجانب الظهري الزرد تصل إلى تشريح الطبق. B. الجمجمة مفتوحة، لإزالة والتخلص من الدماغ. C. مراقبة otoliths في lagenas، وutricles D الكييس. إزالة جزء من بطني كبسولة تحتوي على الجمجمة المتاهات.
الشكل 2. إزالة متاهات من كبسولة الجمجمة. A. وبصرف النظر الكراك كبسولة الجمجمة في خط الوسط والخمسين. B. إزالة متاهات من العظام. C. إزالة otoliths من lagenas وutricles باستخدام ملقط.
الشكل 3. عزل خلايا الشعر من المتاهات. A. رفع بلطف أماهculae مع الشعر الكلب. B. يسحن بقع مع الشعر الكلب اثنين. C. استخدام خلايا الشعر معزولة عن المشبك التصحيح.
الشكل 4. الصور الملتقطة خلال الخطوات في عزل الخلايا الفردية. A. بعد إزالة الدماغ، وotoliths المرتبطة lagenas اثنين والكييس (الأسهم) وutricles (النصال) يمكن تصور. B. بعد إزالة بطني جزء من الكبسولة الجمجمة الذي يحتوي على أجهزة الأذن الداخلية من الحيوان. الرسوم المتحركة في النصف الأيمن من B يحدد مواقع utricle اليسار، والحوقلة الكييس. خط متقطع يدل على موقف تقريبي من المتاهة اليسار. C. متاهة اليمين (عرض وسطي) D: رسم الكارتون توضح أجزاء أساسية من المتاهة في C. ج: شبه الأماميقناة دائرية، ب: القناة الأفقية، ج: القناة الخلفية، د: القريبي otolith، E: الكييس otolith، و: lagenal otolith. شريط النطاق في D يمثل 1 ملم لA و B، C 0.5 مم لوD.
الشكل 5 المعزولة، الخلايا السليمة من الحوقلة توضح تنوع التشكل؛ AVO: الخلايا على شكل الأفوكادو؛ THN: طويلة، رقيقة الخلايا. أقحم ج: مجموعة من ثلاث خلايا معزولة بشكل غير كامل؛ أقحم ب: خلية ميتة؛ ج أقحم: غيض من القطب التصحيح المستخدمة في التسجيلات الكهربية من خلايا الشعر الزرد. شريط النطاق = 20 ميكرومتر ينطبق على الرقم الرئيسي وجميع تدرجا.
فرضت الشكل 6. التيارات سجلت في رقعة خلية الشعر. متوسط استجابات في خلية (ر مماثلةس 2 في AVO الشكل 5) لثلاثة عروض من الخطوات الجهد تطبيق الزيادات في 10 من -140 بالسيارات بالسيارات إلى +70 بالسيارات من المحتمل عقد -70 بالسيارات. لاحظ الحالي الذي يظهر في تعطيل إمكانيات أكثر استقطابها. وتظهر مقادير الجهد الخطوة التالية لبعض من آثار.
Discussion
تشريح دقيق للأجهزة والعلاج لطيف نهاية الخلايا أمر بالغ الأهمية لنجاح العزلة صحية، سليمة وخلايا الشعر بالموقع الناحية الفسيولوجية. والانضمام إلى النصائح التالية ضمان النجاح:
- فمن الأسهل للحصول على الخلايا السليمة من الأسماك الصغيرة (2-2.5 سم في الطول). أكبر الأسماك والعديد من قطرات الدهون التي تصور أكثر غامضة أثناء عملية التشريح.
- يجب توخي الحذر عند إزالة otoliths، الذي علا في خلايا الشعر. تجنب لمس الخلايا عند الاستيلاء على otoliths بالملقط.
- ويتم الحصول على أفضل النتائج عندما يتم رفع وبقع قبيبات قبالة كما صفائح وخلايا ظهارة من triturated.
- نجد استخدام الشعر الكلب ليسحن الخلايا لتكون متفوقة على غيرها من الطرق، بما في ذلك استخدام الرموش الإنسان 7 التي ليست مدبب كما وأقل مرونة.
- خلال التصحيح تحامل، وتطبيق الضغط الايجابي لرانه الكهربائي لأنها تمر من خلال واجهة الهواء / الحل هو المهم للحفاظ على تلميح نظيفة. الافراج عن الضغط الايجابي لتمكين الخلية إلى "القفز" على القطب مهم أيضا. هذا الأسلوب مسح وحدة تخزين صغيرة من الأمفوتريسين المحتوية على الحل بعيدا عن الحافة، مما يزيد من احتمال تشكيل ختم gigaohm مع الخلية. في تجاربنا نحن نستخدم تقنية تسجيل التصحيح ثقب بدلا من تكوين خلية كاملة التقليدية بسبب هشاشة الخلايا. محاولة "الذهاب خلية كاملة" كثيرا ما يؤدي إلى فقدان ختم gigaohm.
إن أسلوب الموصوفة هنا تسفر مئات من الخلايا شعر صحي لكل حيوان. لا يمكن أن يؤديها تقنية في درجة حرارة الغرفة ويتطلب أي معدات خاصة بعد تشريح المجهر. وكان تقرير سابق إن الرب في وصف تشريح الأذن الداخلية في الزرد باستخدام نهج بطني 8. هؤلاء المؤلفين تبين dissection من كله، بارافورمالدهيد الثابتة أجهزة الأذن الداخلية. نحن نشجع القارئ لمشاهدة هذا الفيديو للمقارنة بين الطرق التي نستخدمها. ميزة واحدة من الأساليب المقدمة هنا هو الحصول على الخلايا الحية المفيدة للتحقيقات الفسيولوجية. إلى جانب استخدامها في تجارب المشبك التصحيح لدراسة قنوات الجهد بوابات (كما هو موضح هنا) ويمكن تمديد استخدام هذه الخلايا لدراسة الرنين الخلية 9،10، ورصد إطلاق الناقل العصبي من خلال جعل القياسات السعة 11،12 والتحقيق تعديل العمليات العصبية الناجمة عن تفعيل قنوات بوابات يجند 13 وكذلك الاستفادة من ثروة من المعلومات التي يمكن استخلاصها من استخدام المسوخ التي تؤثر على كل من السمع والتوازن 14.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
بتمويل من NSF (0854551).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (a) NZR (Normal Zebrafish Ringer's) (in mM) | 116 NaCl, 2 KCl, 2 CaCl2, 3 Glucose, 5 Na+-HEPES, pH 7.35. | ||
| (b) NZR + Tricaine | NZR + 0.02% 3-aminobenzoic acid ethyl ester methane sulfonate (Sigma A5040). | ||
| (c) NZR + BSA | NZR + 0.4% Bovine Serum Albumin (Sigma A2153). | ||
| (d) LoCaS (Low Ca2+ Solution) (in mM) | 100 NaCl, 2 KCl, 0.05 CaCl2, 0.05 MgCl2, 3 Glucose, 30 Na+-HEPES, pH 7.35. | ||
| (e) LoCaS + papain | LoCaS + 0.05% L-cysteine (Sigma C1276) + 0.2% papain (Sigma P3375). | ||
| (f) K+-internal solution (in mM) | 52 K2SO4, 38 KCl, 1 K+-EGTA, 5 K+-HEPES, pH 7.3. | ||
Table 1. Solutions. |
|||
References
- Lewis, R. S., Hudspeth, A. J. Voltage- and ion-dependent conductances in solitary vertebrate hair cells. Nature. 304, 538-5341 (1983).
- Art, J. J., Fettiplace, R. Variation of membrane properties in hair cells isolated from the turtle cochlea. J. Physiol. 385, 207-242 (1987).
- Sugihara, I., Furukawa, T. Morphological and functional aspects of two different types of hair cells in the goldfish sacculus. J. Neurophysiol. 62, 1330-1343 (1989).
- Lee, S., Briklin, O., Hiel, H., Fuchs, P. Calcium-dependent inactivation of calcium channels in cochlear hair cells of the chicken. J. Physiol. 583, 909-922 (2007).
- Horn, R., Marty, A. Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method. J. Gen. Physiol. 92, 145-159 (1988).
- Rae, J. R., Cooper, K., Gates, P., Watsky, M. Low access perforated patch recordings using amphotericin B. J. Neurosci. Meth. 37, 15-26 (1991).
- Lumpkin, E. A., Hudspeth, A. J. Detection of Ca2+ entry through mechanosensitive channels localizes the site of mechanoelectrical transduction in hair cells. Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 92, 10297-10301 (1995).
- Liang, J., Burgess, S. M. Gross and fine dissection of inner ear sensory epithelia in adult zebrafish (Danio rerio). J. Vis Exp. 27, e1211 (2009).
- Hudspeth, A. J., Lewis, R. S. Kinetic analysis of voltage- and ion-dependent conductances in saccular hair cells of the bull-frog, Rana catesbeiana. J. Physiol. 400, 237-274 (1988).
- Hudspeth, A. J., Lewis, R. S. A model for electrical resonance and frequency tuning in saccular hair cells of the bull-frog, Rana catesbeiana. J. Physiol. 400, 275-297 (1988).
- Parsons, T. D., Lenzi, D., Almer, W., Roberts, W. M. Calcium-triggered exocytosis in an isolated presynaptic cell: capacitance measurements in saccular hair cells. Neuron. 13, 875-883 (1994).
- Kim, M. -H., Vickers, E., von Gersdorff, H. Patch-clamp capacitance measurements and Ca2+ imaging at single nerve terminals in retinal slices. J. Vis Exp. 59, e3345 (2012).
- Housley, G. D., Ashmore, J. F. Direct measurement of the action of acetylcholine on isolated outer hair cells of the guinea pig cochlea. Proc. R. Soc. Lond. B. 244, 161-167 (1991).
- Nicolson, T. The genetics of hearing and balance in zebrafish. Ann. Rev. Genetics. 39, 9-22 (2005).
