Patch clamp optagelser i indre øre-hårceller isoleret fra zebrafisk

Summary

Formålet med denne video er at demonstrere procedurer til opnåelse af raske, intakte hårceller fra det indre øre organer voksne zebrafisk og derefter bruge dem til patch clamp-forsøg med henblik på at karakterisere de biofysiske egenskaber af de spændingsstyrede kanaler.

Abstract

Patch-clamp-analyser af de spændingsstyrede kanaler i sansehårceller isoleret fra en række arter er blevet beskrevet tidligere ^1-4, men denne video repræsenterer den første anvendelse af disse teknikker til hårceller fra zebrafisk. Her viser vi en metode til at isolere sunde, intakte hårceller fra alle de indre øre endelige organer: saccule, lagena, utricle og Buegangene. Yderligere, vi vise mangfoldigheden i håret celle størrelse og morfologi, og giver et eksempel på den slags patch clamp optagelser, der kan opnås. Fordelen ved anvendelsen af ​​denne zebrafisk modelsystem frem for andre stammer fra tilgængeligheden af ​​zebrafisk mutanter, der påvirker både hørelse og balance. I kombination med anvendelsen af ​​transgene linjer og andre teknikker, der udnytter genetisk analyse og manipulation, cellen isolation og elektrofysiologiske metoder introduceres her bør fremme større indsigt i de roller hårceller plå i mediering af disse sanser.

Protocol

1. Præeksperimentelle Præparater

1. Forbered seks opløsninger (se tabel 1 for sammensætninger): (a) 100 ml NZR (normal zebrafisk Ringers), (b) 50 ml NZR + Tricaine (MS222), (c) 10 ml NZR + BSA (d) 100 ml Locas (lavt ^{Ca2 +-opløsning),} (e) 10 ml Locas + papain, (f) 100 ml K ^+-intern opløsning. Opløsninger (a), (b), (d) og (f) kan opbevares i op til én måned ved 4 ° C. Solutions (c) og (e) bør udarbejdes dagen eksperimentering. Alle løsninger skal være ved stuetemperatur, før du begynder eksperimenter.
2. Label og fylde fire 35 mm petriskåle omtrent halvvejs med opløsninger (a), (c), (d) og (e).
3. Lav en dissekere skål ved at fylde en 60 mm petriskål med Sylgard (Dow Corning, Midland, MI) og derefter skære et hulrum ind i det, der vil tillade en fisk til at sidde op uden at vælte.
4. Der laves mindst to celleisolering værktøjer ved limning follicle ende af en hund hår til enden af ​​et glasPasteur-pipette med superlim, således at håret til at strække sig forbi enden af ​​pipetten med omtrent 0,5 cm. Hårene fra soft-behårede hunde som Labrador retriever og Weimaraners fungerer godt.

2. Isolering af auditiv og vestibulær Labyrinth

1. Ofre en voksen zebrafisk ved nedsænkning i et bægerglas indeholdende NZR + Tricaine. Visuelt overvåge gællerne indtil alle opercular bevægelser er ophørt. Vent yderligere ti minutter, før du fjerner fisk og skylning med frisk NZR. Disse procedurer er blevet godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) af Pepperdine University, men godkendelsen skal indhentes fra din egen institution.
2. Pin fisken til dissecting skålen dorsale side op ved indsætning af en standard syning nål (ca. 2,5 cm lang) gennem hver øjenhulen og et tredje ben gennem det dorsal-ventrale akse omkring en tredjedel til halvdelen af ​​afstanden fra hovedet til hale som illustreret iFigur 1A.
3. Under en zoom (0,62-5x) stereo dissektionsmikroskop udstyret med 10x okularer, bruge foråret saks (Fine Science Tools katalognummer 15.000-02) for at afdække hjernen og et kort segment af rygmarven ved at fjerne kraniet tag fra et punkt ca 0,5 cm kaudale til niveauet for gællerne frem til næsen af ​​fisken. Skær rygmarven og løft hjernen med fine tænger (Fine Science Tools katalognummer 11.251-30), mens der skæres rygmarvsnerverne og andre vedhæftede filer, fjerne hjernen og kassere (figur 1B).
4. Den ventrale halvdel af kraniet kapsel, der forbliver danner en "skål", der indeholder de indre øre organer. Observere fremtrædende, hvide, uigennemsigtige øresten i lagenas og sacculi placeret symmetrisk på den caudale ende af hvert indre øre, og de ​​lateralt placerede utricle øresten mere rostrally (fig. 1C og 4A).
5. Tag skålen af ​​knogle ved at skære alle ventrale og laterale attachments, mens du forsigtigt løfte det ud af hovedet med fine pincet. Sæt det ind i petriskål indeholdende Locas (figur 1D og 4B).
6. Ved hjælp af to par af fine tænger, knæk hinanden skålen ved sin midterlinie ved enten at gribe sidekanterne af knoglen og trække dem fra hinanden eller alternativt adskille de højre og venstre halvdele ved at indsætte de punkter i tangen i midten og nysgerrige halvdelene fra hinanden. Fjern de to labyrinter fra knoglen med fine tænger (figur 2).
7. Efterse labyrinter for at identificere de auditive og vestibulære endelige organer: de halvcirkelformede kanaler, utricles, sacculi og lagenas (figur 4C). De lyserøde områder under hver Otolith er maculae indeholder hårceller. Tilsvarende er en strimmel af pink inde i ampuller af Buegangene identificerer Cupula hvor hårceller er placeret.
8. Fjern forsigtigt øresten fra lagena og utricle ved hjælp af de fine tænger (

3. Hår celleisolering

1. Ved hjælp af en plastik overførselspipetten (Fisher Scientific katalog nummer 13-711-09:00), flytte de endelige organer til den skål, der indeholder Locas + papain minimere mængden af ​​væske overføres.
2. Inkubér disse strukturer i denne opløsning i 30 minutter ved stuetemperatur.
3. Ved slutningen af ​​inkubationsperioden, flyttes de strukturer til skålen, der indeholder NZR + BSA og inkuberes i denne opløsning i mindst 30 minutter. Hårceller vil forblive sund i denne opløsning i op til fire timer, men vil blive forringet efter 1-2 timer efter isolation (se næste trin).
4. Som forberedelse til celleisolering, flytte en af ​​de ende-organer til den skål, der indeholder NZR.
5. For lagenas og utricles, skal du bruge en hund hår til forsigtigt løfte de maculae-ark rødlig epitelial tissue, der indeholder hårceller (figur 3A). The maculae kan skovlede ud (ved anvendelse af en hund hår) fra under øresten af ​​sacculi, og cupulae fra deres placering inde i ampuller af halvcirkulære kanaler.
6. Under anvendelse af to celleisolering værktøjer fremstillet i trin 1.4 en macula eller Cupula at generere et snavs, der indeholder de hårceller (figur 3B) tritureres. Lad cellerne mindst fem minutter til at sætte sig på bunden af ​​skålen, før du flytter den.
7. Flyt skålen til trin af et omvendt mikroskop forsynet med fasekontrastoptik. Overhold celler under 40X forstørrelse og notér mangfoldighed i morfologi. Mange celler er avocado-formede mens andre er lange og tynde. Tilstedeværelsen af ​​apikale hår bundter identificerer dem som hårceller og fase-lysstyrke sikrer deres sundhed. Mikrofotografier af isolerede hårceller er vist i fig. 5.

4. Patch Fastspænding zebrafisk hårceller

1. Som forberedelse til Perfonominel patch optagelser ^5,6, forberede amphotericin-holdig intern løsning som følger: place 5 mg amphotericin B (Sigma A4888) i et 1,5 ml mikrocentrifugerør og fyldes med 100 ul DMSO. Umiddelbart vortex denne opløsning i 10-20 sekunder indtil alt amphotericin opløses. Derefter afpipetteres 625 pi K ^+-intern opløsning i et andet mikrocentrifugerør. Der tilsættes 10 ul af amphotericin løsning på K ^+-intern løsning og vortex som ovenfor. Bestanden amphotericin løsning vil vare flere timer, men kasseres den endelige opløsning efter én time.
2. Fremstil patch pipetter fra BF 150-86-10 borosilikatglas (Sutter Instruments) ved hjælp af en multi-trins aftrækker (Sutter P-1000). Pipetter skal have tip diametre på omkring 2 um og har modstande på 1-3 MQ med opløsningerne i tabel 1. Indstillingerne på aftrækker, som fungerer godt, er som følger: Heat = Rampe minus10, Pull = 0, Velocity = 18, Delay = 1, Pressure = 600. Formen afspidsen af ​​en god pipette det fremgår af fotografiet i den indsatte c i figur 5. Blunt "bullet-formede" pipetter foretrækkes, da de tilbyder den mindste adgang modstand under elektrofysiologiske optagelser.
3. Brug en 28 gauge Microfil sprøjtenål ​​(MF28G-5; Verden Precision Instruments) til at fylde en optagelse elektrode halvvejs med amphotericin-holdige K ^+-intern løsning.
4. Anbringe elektroden til hovedtrin af et patch clamp-forstærker. Anvendelse -10 mV, 10 ms spændingstrin ved 10 Hz og opretholde et positivt tryk i elektroden, som det er manøvreres gennem luften / opløsning-grænsefladen og ned til bunden af ​​optagelsen skålen i nærheden af ​​cellerne.
5. Placer elektroden vinkelret på en sundt udseende celle. Når elektroden er nær nok til cellen, således at den begynder bevæge sig væk fra den ud-strømmende opløsning, hurtigt vende trykket, påføring af et svagt vakuum til elektroden indtil celle "springer" på den. Straks ophøre sugning på the elektrode og anvende et holdepotentiale på -70 mV til indersiden af ​​elektroden. Inden for et par sekunder en gigaohm sæl vil danne.
6. Overhold de kapacitive strømtransienter ved debut og opsigelse af spændingen trin, der vises hurtigt efter sæl dannelse. Fortsat overvåge perforeringen af ​​membranen under elektroden af ​​amphotericin ved at se de transienter vokser i størrelse til deres maksimale størrelse (i omkring ti minutter).
7. For at bekræfte etableringen af helcelle-(perforeret)-konfiguration i en sund celle, fremkalder udadgående K ^+-strømme ved at anvende hyperpolarisering og depolariserende trin spænding. De fleste hårceller har fremstående ydre strømme (se figur 6).

5. Repræsentative resultater

Figur 4 viser billeder taget i trinnene celleisolering. I panel A, kan de øresten forbundet med lagenas, saccluli og utricles ses through det tynde lag af knogle, der ligger over dem. Disse uigennemsigtige strukturer giver bekvemme vartegn for at hjælpe med sikker fjernelse af de endelige organer fra dyret under de efterfølgende trin i dissektion. Panel B viser "skål" af knogle, som indeholder de intakte labyrinter og de fremtrædende øresten i utricles, lagenas og sacculi. Panel C viser en labyrint, der er blevet fjernet fra knoglen. Bemærk den store Otolith med flosset kant i lagena, den istap-formede Otolith i saccule og bønne-formede Otolith i utricle. Nogle af de forskelligartede i størrelse og morfologi set i celler isoleret fra lagena er illustreret i figur 5. En sund celle let identificeres som værende fase lyse med en skarp perimeter. Celle-former kan groft inddeles i to klasser, avocado-formede (Avo) og lange og tynde (THN) selv om størrelsen af ​​cellerne inden for hver gruppe kan variere markant (sammenlign f.eks Avo 1 og Avo 3). Inset a viser en klynge aftre celler, der ikke var fuldstændigt isoleret fra hinanden. Den sorte farve og kornet udseende af cellen i indsatte b let identificerer denne celle som død. Inset c viser spidsen af en patch-pipette illustrerer form og dimensioner egnede til optagelse af disse celler.

De nuværende spor vist i figur 6 blev opnået som svar på hyperpolarisering og depolariserende trin potentiale pålægges en lagena celle ligner den Avo 2 vist i figur 5. Aktuelle reaktioner i celler af forskellig størrelse og form kan variere meget antyder diversitet i komplementet af spændingsstyrede kanaler.

Figur 1-3: Tegnefilm illustrerer trin i isoleringen af hårceller.

Fig. 1. Fjernelse af kraniet capsule indeholdende de indre øre labyrinter fra zebrafisk. A. Pin ofrede zebrafisk dorsalsiden op til dissekere fad. B. Open kranium, fjerne og kassere hjerne. C. Overhold øresten i utricles, lagenas og sacculi. D. Fjern ventrale del af kraniet kapsel indeholdende labyrinter.

Figur 2. Fjernelse af labyrinter fra kraniet kapsel. A. Knække hinanden skull kapsel ved sin midterlinie. B. Fjern labyrinter fra knoglerne. C. Fjern øresten fra lagenas og utricles hjælp pincet.

Figur 3. Isolering af hårceller fra labyrinter. A. Løft forsigtigt off maculae med en hund hår. B. Tritureres maculae med to hund hår. C. Brug isolerede hårceller til patch clamp.

Figur 4. Billeder taget under trin i isoleringen af individuelle celler. A. Efter fjernelse af hjernen, kan de øresten forbundet med de to lagenas og sacculi (pile) og utricles (pilespidser) visualiseres. B. Efter fjernelse af den ventrale del af kraniet kapsel, der indeholder de indre øre organer fra dyret. Tegneserien i højre halvdel af B identificerer placeringen af den venstre utricle, lagena og saccule. Den stiplede linje angiver den omtrentlige position af den venstre labyrint. C. Højre labyrint (mediale view) D: Cartoon tegning illustrerer centrale dele af labyrint i C. a: anterior semicirkulær kanal, b: vandret canal, c: posterior kanalen, d: utriculare Otolith, e: saccular Otolith, f: lagenal Otolith. Scale bar in D betegner 1 mm for A og B, 0,5 mm for C og D.

Figur 5 Isolerede, sunde celler fra lagena illustrerer mangfoldigheden af morfologi; Avo:. Avocado formede celler, THN: lange, tynde celler. Nedfældning a: klynge af tre ufuldstændigt isolerede celler, inset b: døde celler, inset c: spidsen af patch-elektrode, der anvendes i elektrofysiologiske optagelser fra zebrafisk hårceller. Scale bar = 20 um gælder for de vigtigste tal og alle indsatse.

Figur 6. Strømme registreres i et plaster fastspændt hårcelle. Gennemsnitlige svar i en celle (lignende to Avo 2 i figur 5) til tre præsentationer af spændingstrin anvendt i 10 mV trin fra -140 mV til +70 mV fra et holdepotentiale på -70 mV. Bemærk inaktiverende strøm, der vises på mere depolariserede potentialer. Spændingstrin størrelser er vist ved siden af ​​nogle af sporene.

Discussion

Omhyggelig dissektion af udgangen organer og skånsom behandling af cellerne er kritisk for den vellykkede isolering af sunde, intakte og fysiologisk aktive hårceller. Fastholdelsen af ​​de følgende tips vil sikre succes:

1. Det er lettere at opnå raske celler fra mindre fisk (2-2,5 cm i længde). Større fisk har mange flere fede dråber, obskure visualisering under dissektion processen.
2. Der skal udvises forsigtighed når du fjerner øresten, der ligge over hårceller. Undgå at røre ved cellerne, når sensationsprægede øresten med pincet.
3. De bedste resultater opnås, når maculae og cupulae løftes ud som ark, og cellerne tritureret fra epithelet.
4. Vi finder anvendelsen af en hund hår til tritureres celler at være bedre end andre metoder, herunder anvendelse af humane øjenvipper ^7, som ikke er så tilspidset og mindre fleksibel.
5. Under patch fastspænding, påføring af overtryk til tHan elektrode, idet den passerer gennem luften / opløsning-grænsefladen er vigtigt at holde spidsen ren. Frigivelsen af ​​det positive tryk til at aktivere cellen til at "springe" på elektroden er også vigtig. Denne fremgangsmåde fjerner en lille mængde amphotericin-holdig opløsning væk fra spidsen, hvilket øger sandsynligheden for dannelse af en gigaohm forsegling med cellen. I vores eksperimenter anvender vi den perforerede patch optagelsesteknik stedet for de mere traditionelle helcelle-konfiguration på grund af skrøbelighed af cellerne. Forsøg på at "gå hele celle" resulterer ofte i tabet af gigaohm segl.

Den her beskrevne fremgangsmåde vil give hundredvis af sundt hår celler pr dyr. Teknikken kan udføres ved stuetemperatur og kræver ikke særligt udstyr ud over et dissektionsmikroskop. En tidligere rapport i Jove beskriver dissektion af det indre øre i zebrafisk med en ventral tilgang ^8. Disse forfattere demonstrere thesektion af hele, paraformaldehyd-fikserede indre øre organer. Vi opfordrer læseren til at se denne video for sammenligning med vores metoder. En fordel ved de metoder, der præsenteres her er opnåelse af levende celler er nyttige til fysiologiske undersøgelser. Udover deres anvendelse i patch-clamp-forsøg for at studere de spændingsstyrede kanaler (som vist her) anvendelsen af disse celler kan udvides til at studere celle-resonans ^9,10, monitor neurotransmitterfrigivelse ved at kapacitans målinger ^11,12, undersøge neuromodulation induceret af aktiveringen af ligand gatede kanaler ¹³ samt indpasses i den rigdom af oplysninger, der kan udledes ved hjælp af mutanter, der påvirker både hørelse og balance ^14.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
(a) NZR (Normal Zebrafish Ringer's) (in mM)	116 NaCl, 2 KCl, 2 CaCl2, 3 Glucose, 5 Na+-HEPES, pH 7.35.
(b) NZR + Tricaine	NZR + 0.02% 3-aminobenzoic acid ethyl ester methane sulfonate (Sigma A5040).
(c) NZR + BSA	NZR + 0.4% Bovine Serum Albumin (Sigma A2153).
(d) LoCaS (Low Ca2+ Solution) (in mM)	100 NaCl, 2 KCl, 0.05 CaCl2, 0.05 MgCl2, 3 Glucose, 30 Na+-HEPES, pH 7.35.
(e) LoCaS + papain	LoCaS + 0.05% L-cysteine (Sigma C1276) + 0.2% papain (Sigma P3375).
(f) K+-internal solution (in mM)	52 K2SO4, 38 KCl, 1 K+-EGTA, 5 K+-HEPES, pH 7.3.
Table 1. Solutions.