Patch-Clamp-Aufnahmen im inneren Haarsinneszellen Isoliert von Zebrafisch

Summary

Der Zweck dieses Videos ist es, Verfahren zur Gewinnung von gesunden, intakten Haarzellen aus den Innenohr Organe ausgewachsener Zebrafisch und dann mit ihnen für Patch-Clamp-Untersuchungen zur Charakterisierung der biophysikalischen Eigenschaften ihrer spannungsabhängigen Kanälen ausgerichtet demonstrieren.

Abstract

Patch-Clamp-Analyse der spannungsabhängigen Kanälen in sensorischer Haarzellen aus einer Vielzahl von Arten isoliert wurden zuvor beschrieben ^1-4 aber das Video stellt die erste Anwendung dieser Techniken Haarzellen von Zebrafisch. Hier zeigen wir, ein Verfahren auf gesunder, intakter Haarzellen aus allen Innenohr Endorganen isolieren: Sacculus, Lagena, Utriculus und Bogengänge. Darüber hinaus zeigen wir die Vielfalt im Haar Zellgröße und Morphologie und geben Sie ein Beispiel für die Art von Patch-Clamp-Aufnahmen, die erhalten werden können. Der Vorteil der Verwendung dieser Zebrafischmodell Systems gegenüber anderen resultiert aus der Verfügbarkeit von Zebrafisch-Mutanten, die sowohl Gehör und Gleichgewicht beeinflussen. In Kombination mit dem Einsatz von transgenen Linien und andere Techniken, die genetische Analyse und Manipulation der Zelle isoliert und elektrophysiologische Methoden nutzen hier vorgestellten sollten einen besseren Einblick in die Rollen Haarzellen p erleichternlag in der Vermittlung dieser sensorischen Modalitäten.

Protocol

Ein. Pre-experimentelle Vorbereitungen

1. Planen sechs Lösungen (siehe Tabelle 1 für Zusammensetzungen): (a) 100 ml NZR (normal Zebrafisch Ringerlösung), (b) 50 ml NZR + Tricaine (MS222), (c) 10 ml NZR + BSA, (d) 100 ml Locas (niedrig Ca ^{2 +-Lösung),} (e) 10 ml Locas + Papain, (f) 100 ml K ^+-interne Lösung. Lösungen (a), (b), (d) und (f) für bis zu einem Monat bei 4 ° C gelagert werden Lösungen (c) und (e) sollte der Tag des Experiments hergestellt werden. Alle Lösungen sollten bei Raumtemperatur, bevor Experimente sein.
2. Etikett und füllen vier 35 mm Petrischalen etwa zur Hälfte mit Lösungen (a), (c), (d) und (e).
3. Einen Sezieren Schale durch Füllen einer 60 mm Petrischale mit Sylgard (Dow Corning, Midland, MI) und dann Schneiden einen Hohlraum hinein, durch die ein Fisch aufrecht sitzen, ohne umzukippen wird.
4. Bereiten zumindest zwei Zellisolation Werkzeugen durch Verkleben des Follikels Ende eines Hundehaare an das Ende eines GlasesPasteurpipette mit Sekundenkleber, so dass die Haare nach dem Ende der Pipette um etwa 0,5 cm erstrecken. Die Haare von Soft-Fell Hunde wie Labrador Retriever und Weimaraner gut funktionieren.

2. Isolierung von auditorischen und vestibulären Labyrinth

1. Opfert einen Erwachsenen Zebrafisch durch Eintauchen in ein Becherglas mit NZR + Tricaine. Visuell überwachen die Kiemen bis alle Kiemendeckel Bewegungen aufgehört haben. Warten weitere zehn Minuten, bevor Sie Fische und Spülen mit frischem NZR. Diese Verfahren wurden von der Institutional Animal Care genehmigt und Verwenden Committee (IACUC) der Pepperdine Universität, sondern Zulassung sollte von Ihrem eigenen Institution gewonnen werden.
2. Merken der Fisch das Sezieren Schale dorsal durch Einführen eines Standard Nähen Zylinderstift (etwa 2,5 cm lang) durch jede Augenhöhle und einen dritten Stift durch die dorsal-ventralen Achse etwa ein Drittel bis die Hälfte des Abstandes von Kopf bis zum Schwanz wie in dargestellt1A.
3. Unter einem Zoom (0,62-5x) Stereo Binokular mit 10x Okularen ausgestattet, verwenden Frühjahr Schere (Fine Science Tools Katalognummer 15000-02), um das Gehirn und ein kurzes Segment des Rückenmarks durch Entfernen des Schädels Dach von einem Punkt etwa aussetzen 0,5 cm kaudal des Niveaus der Kiemen vorn an der Nase des Fisches. Schneiden Sie das Rückenmark und heben das Gehirn mit feinen Pinzette (Fine Science Tools Katalognummer 11251-30) beim Schneiden der Spinalnerven und andere Anhänge, entfernen das Gehirn und entsorgen (Abbildung 1B).
4. Die ventrale Hälfte des Schädels Kapsel, bleibt bildet eine "Schüssel", die Innenohr Organe enthält. Beachten Sie die prominenten, weiße, undurchsichtige Otolithen in den lagenas und Sacculi symmetrisch am caudalen Ende jedes Innenohr und die seitlich angebrachten Utriculus Otolithen mehr rostral (1C und 4A) befindet.
5. Entfernen Sie die Schale des Knochens durch Schneiden aller ventralen und seitlichen attachments unter leichtem Anheben aus dem Kopf mit feinen Pinzetten. Legen Sie sie in die Petrischale mit Locas (Abb. 1D und 4B).
6. Die Verwendung von zwei Paaren von feinen Pinzette, auseinander reißen die Schale an ihrem Mittellinie entweder durch Greifen der Seitenkanten des Knochens und Auseinanderziehen oder alternativ Trennen der rechten und linken Hälften, indem die Punkte der Zange in der Mitte und die Hälften neugierigen auseinander. Entfernen Sie die beiden Labyrinthe aus dem Knochen mit feinen Pinzette (Abbildung 2).
7. Überprüfen Sie die Labyrinthe der auditorischen und vestibulären Endorgane identifizieren: die Bogengänge, Primordialschläuche, sacculi und lagenas (4C). Die rosafarbenen Bereiche unter jedem otolith sind die Maculae mit den Haarzellen. Ebenso kennzeichnet ein Streifen von rosa in der Ampullen der Bogengänge die Cupula, wo die Haarzellen befinden.
8. Entfernen Sie vorsichtig die Otolithen aus der Lagena und Utriculus mit den feinen Pinzette (

3. Haarzelle Isolation

1. Verwendung eines Kunststoff-Pipette (Fisher Scientific Katalog-Nummer 13-711-09.00), verschieben Sie die Endorgane der Schale mit Locas + Papain minimiert das Volumen der Flüssigkeit übertragen.
2. Inkubieren diese Strukturen in diese Lösung für dreißig Minuten bei Raumtemperatur.
3. Am Ende der Inkubationszeit, verschieben Sie die Strukturen an die Schale mit NZR + BSA und inkubieren bei dieser Lösung für mindestens 30 Minuten. Haarzellen bleiben bei dieser Lösung gesund für bis zu vier Stunden wird aber nach 1-2 Stunden nach der Isolierung verschlechtern (siehe nächste Schritte).
4. In Vorbereitung für Zellisolation, verschieben Sie eine der End-Organe auf die Schale mit NZR.
5. Für die lagenas und Primordialschläuche, verwenden Sie einen Hund Haare sanft abheben, Maculae-Blatt rosa epithelialen tissue die die Haarzellen (3A) enthalten. Die Maculae ueber ausgehöhlt (unter Verwendung eines Hundehaare) unter den Otolithen des Sacculi, und die von ihren cupulae Stellen im Inneren der Ampullen der Bogengänge.
6. Verwendung von zwei Zellisolation Werkzeuge Schritt 1.4 hergestellten verreiben eine Makula oder Cupula eine Trümmerfeld die die Haarzellen (3B) enthält erzeugen. Lassen Sie die Zellen mindestens fünf Minuten, um auf den Boden der Schale, bevor es zu begleichen.
7. Stellen Sie den Teller auf die Bühne eines inversen Mikroskops mit Phasenkontrast-Optik ausgestattet. Beachten Zellen unter 40-facher Vergrößerung und beachten Sie die Vielfalt in der Morphologie. Viele Zellen sind Avocado-förmigen während andere lang und dünn sind. Die Anwesenheit von apikalen Haarbündel identifiziert sie als Haarzellen und Phase-Brightness sichert ihre Gesundheit. Mikrophotographien von isolierten Haarzellen sind in 5 gezeigt.

4. Patch-Clamp Zebrafisch Haarzellen

1. In Vorbereitung für perforated patch Ableitungen ^5,6, bereiten Amphotericin-haltigen interne Lösung wie folgt: Platz 5 mg Amphotericin B (Sigma A4888) in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen füllen und mit 100 ul DMSO. Unmittelbar Wirbels diese Lösung für 10-20 Sekunden, bis das gesamte Amphotericin gelöst ist. Dann Pipette 625 ul K ^+-interne Lösung in eine zweite Mikrozentrifugenröhrchen. Fügen Sie 10 ul der Amphotericin Lösung des K ^+-interne Lösung und Vortex wie oben. Die Aktie Amphotericin Lösung wird mehrere Stunden dauern, aber verwerfen die endgültige Lösung nach einer Stunde.
2. Fabrizieren Patch-Pipetten von BF 150-86-10 Borosilikatglas (Sutter Instruments) unter Verwendung eines mehrstufigen Ziehvorrichtung (Sutter P-1000). Pipetten sollte Durchmessern von etwa 2 um kippen haben und Resistenzen von 1-3 MOhm haben mit den Lösungen in der Tabelle 1. Die Einstellungen auf dem Abzieher, dass die Arbeit gut sind wie folgt: Heat = Rampe minus10, Pull = 0, Velocity = 18, Delay = 1, Druck = 600. Die Formdie Spitze einer Pipette gut ersichtlich aus der Fotografie in der eingesetzten c aus 5. Blunt "bullet-shaped" Pipetten werden bevorzugt, da sie am wenigsten Zugang Widerstand während elektrophysiologischen Ableitungen bieten.
3. Verwenden Sie eine 28 Gauge Microfil Spritzennadel (MF28G-5; World Precision Instruments), ein Aufnahme-Elektrode zur Hälfte füllen mit der Amphotericin-haltigen K ^+-interne Lösung.
4. Anbringen der Elektrode an das Headstage eines Patch-Clamp Verstärkers. Anwenden -10 mV, 10 ms Spannungsstufen bei 10 Hz und aufrechtzuerhalten Überdruck in der Elektrode, wie sie durch die Luft / Lösungs-Grenzfläche manövriert wird und nach unten auf den Boden der Aufnahme in der Nähe der Schale Zellen.
5. Positionieren Sie die Elektrode orthogonal zu einer gesund aussehende Zelle. Wenn die Elektrode nahe genug an der Zelle ist, so dass es sich von der abfließenden Lösung beginnt, schnell umkehren Druck, Anlegen eines geringen Vakuums an die Elektrode, bis die Zelle "springt" darauf. Sofort aufhören Sog auf the Elektrode und Auftragen Haltepotential von -70 mV auf der Innenseite der Elektrode. Innerhalb von ein paar Sekunden ein Gigaohm Dichtung bilden.
6. Beachten Sie die kapazitiven Stromspitzen bei Beginn und Beendigung der Spannung Schritte, die bald nach der Dichtung Bildung erscheinen. Weiterhin die Perforation der Membran unter der Elektrode durch die Amphotericin überwachen, indem beobachtete, wie die Transienten in der Größenordnung wachsen, um ihre maximale Größe (in ca. 10 Minuten).
7. Um die Ausarbeitung der whole-cell (perforiert)-Konfiguration in einer gesunden Zelle zu bestätigen, zu entlocken außen K ⁺ Ströme durch die Anwendung hyperpolarisierenden und depolarisierende Schritte Spannung. Die meisten Haarzellen haben prominente Auswärtsströme (siehe Abbildung 6).

5. Repräsentative Ergebnisse

Abbildung 4 zeigt Bilder während der Schritte der Zellisolation entnommen. In Feld A können die Otolithen mit den lagenas, saccluli und Primordialschläuche assoziiert gesehen throu werdengh die dünne Schicht der Knochen, überlagert sie. Diese opake Strukturen bieten bequeme Landmarken in der sicheren Entfernung der Endorganen von dem Tier während der nachfolgenden Schritte der Zerlegung zu erleichtern. Panel B zeigt die "Schüssel" des Knochens, die intakten Labyrinthen und die prominenten Otolithen in den Primordialschläuche, lagenas und sacculi enthält. Panel C zeigt ein Labyrinth, das aus dem Knochen entfernt wurde. Man beachte die große otolith mit Wellenschliff in der Lagena die Eiszapfen-förmigen otolith im Sacculus und bohnenförmige otolith im utricle. Einige der Vielfalt in Größe und Morphologie in Zellen aus der Lagena isoliert gesehen ist in Abbildung 5 dargestellt. Eine gesunde Zelle ist leicht als Phase hell mit einem scharfen Rand identifiziert. Zellformen lassen sich grob in zwei Klassen eingeteilt werden: Avocado-förmig (avo) und lang und dünn (thn), obwohl die Größen der Zellen innerhalb jeder Gruppe können erheblich variieren (vgl. zB avo 1 und avo 3). Einschub zeigt einen Cluster vondrei Zellen, die nicht vollständig voneinander getrennt. Die schwarze Farbe und körniges Aussehen der Zelle in Einschub b leicht identifiziert diese Zelle tot ist. Einschub c zeigt die Spitze eines Patch-Pipette, die die geeignete Form und Dimensionen zum Aufzeichnen von diesen Zellen.

Die aktuellen Spuren in 6 gezeigt wurden in Reaktion auf Hyperpolarisieren und depolarisierenden Stufen Potential auf einer Lagena Zelle ähnlich der avo 2 in 5 gezeigt auferlegt erhalten. Übliche Reaktionen in Zellen verschiedener Größen und Formen können sehr unterschiedlich hindeutet Vielfalt in dem Komplement von spannungsabhängigen Kanälen.

Figuren 1-3: Cartoons Darstellung der Schritte in der Isolierung von Haarzellen.

Abbildung 1. Entfernen des Schädels capsule mit den Innenohr Labyrinthe aus Zebrafisch. A. Geopfert Zebrafisch Dorsalseite Merken bis zu sezieren Gericht. B. Offenen Schädel, entfernen und entsorgen Gehirn. C. Beachten Otolithen in Primordialschläuche, lagenas und sacculi. D. Entfernen ventralen Teil des Schädels Kapsel die Labyrinthe.

Abbildung 2. Entfernen der Labyrinthe vom Schädel Kapsel. A. Knacken Sie neben Schädel Kapsel ihre Mittellinie. B. Entfernen Labyrinthe aus den Knochen. C. Entfernen Sie die Otolithen aus den lagenas und Primordialschläuche mit einer Pinzette.

Abbildung 3. Isolierung von Haarzellen von Labyrinthen. A. Heben Sie maculae mit einem Hund Haar. B. Verreiben Maculae mit zwei Hundehaare. C. Verwenden Sie isolierte Haarzellen für Patch-Clamp.

Abbildung 4. Bilder während der Schritte bei der Isolierung von einzelnen Zellen aufgenommen. A. Nach Entfernen des Gehirns, die mit den beiden Otolithen lagenas und Sacculi (Pfeile) und Primordialschläuche (Pfeilspitzen) zugeordnet visualisiert werden kann. B. Nach Entfernung des ventralen Teil des Schädels, die die Kapsel Innenohr Organe des Tieres enthält. Die Karikatur in der rechten Hälfte des B identifiziert die Standorte der linken Utriculus, Lagena und Sacculus. Die gestrichelte Linie zeigt die ungefähre Position der linken Labyrinth. C. Rechts Labyrinth (Ansicht von medial) D: Cartoon Zeichnung wichtigsten Teile des Labyrinths in C. a: anterior halbkreisförmigen Kanal, b: horizontal Kanal, c: posterior Kanal, d: utrikulären otolith, e: saccular otolith, f: lagenal otolith. Maßstabsbalken in D repräsentiert 1 mm für die A und B, 0,5 mm für C und D.

Abbildung 5 Isoliert, gesunde Zellen von der Lagena, die die Vielfalt der Morphologie; avo:. Avocado geformten Zellen; thn: lange, dünne Zellen. Inset a: Cluster aus drei vollständig isolierten Zellen; Einschub b: tote Zelle; Einschub c: Spitze des Patch-Elektrode in elektrophysiologischen Ableitungen von Zebrafisch Haarzellen verwendet. Maßstab = 20 um gehört zu der Hauptfigur und allen Einsätzen.

Abbildung 6. Currents in einem Patch erfasst geklemmt Haarzelle. Gemittelten Antworten in einer Zelle (t ähnlicheo avo 2 in 5) zu drei Präsentationen von Spannungsstufen in 10 mV Schritten von -140 mV bis +70 mV von einem Haltepotential von -70 mV aufgetragen. Beachten Sie die Inaktivierung Strom, der bei mehr depolarisiert Potenziale erscheint. Spannungsstufe Größen werden neben einigen der Spuren gezeigt.

Discussion

Sorgfältige Präparation der Endorgane und schonende Behandlung der Zellen ist entscheidend für die erfolgreiche Isolierung von gesunder, intakter und physiologisch aktive Haarzellen. Die Einhaltung der folgenden Tipps sollen Ihnen versichern Erfolg:

1. Es ist einfacher, gesunde Zellen vor kleinere Fische (2-2,5 cm Länge) erhalten. Größere Fische haben viele weitere Fetttröpfchen, dass obskure Visualisierung während der Dissektion Prozess.
2. Vorsicht beim Entfernen der Otolithen, die die Haarzellen überlagern werden. Berühren Sie die Zellen, wenn packte die Otolithen mit einer Pinzette.
3. Die besten Ergebnisse werden erzielt, wenn die Maculae und cupulae ausgeschaltet werden als Bleche und die Zellen aus dem Epithel verrieben abgehoben.
4. Wir finden die Verwendung eines Hundehaare um Zellen verreiben überlegen zu sein anderer Methoden, einschließlich der Verwendung von menschlichen Wimpern ^7, die nicht so verjüngt und weniger flexibel.
5. Während Patch-Clamp, Anwendung von Überdruck auf tEr Elektrode, wie sie durch die Luft / Lösung Schnittstelle ist wichtig, dass die Spitze sauber läuft. Die Freisetzung des Überdrucks an die Zelle ermöglichen, zu "springen" auf die Elektrode ist ebenfalls wichtig. Diese Methode löscht ein kleines Volumen von Amphotericin-haltigen Lösung entfernt von der Spitze, wodurch die Wahrscheinlichkeit zur Bildung einer Abdichtung mit dem Gigaohm Zelle. In unseren Experimenten verwenden wir die perforierten Patch Aufnahmetechnik anstelle der traditionellen whole-cell-Konfiguration wegen der Fragilität der Zellen. Versuch "go Ganzzell" führt oft zum Verlust der Gigaohm Dichtung.

Die hier beschriebene Methode erbringt Hunderte von gesundem Haar Zellen pro Tier. Die Technik kann bei Raumtemperatur durchgeführt werden und erfordert keine spezielle Ausrüstung über einem Binokular. Ein früherer Bericht in JoVE beschreibt die Präparation des Innenohrs im Zebrafisch mit einem ventralen Zugang ^8. Diese Autoren zeigen die dissektion von ganzen, Paraformaldehyd-fixierten Innenohr Organe. Wir ermutigen die Leser dieses Video zum Vergleich mit unseren Methoden zu beobachten. Ein Vorteil der hier vorgestellten Verfahren ist die Gewinnung von lebenden Zellen nützlich für physiologische Untersuchungen. Neben ihrer Verwendung bei der Patch-Clamp-Experimente, um die spannungsgesteuerte Kanäle studieren (wie hier gezeigt) die Verwendung dieser Zellen erweitert werden zu Zelle Resonanz ^9,10, Monitor Neurotransmitterfreisetzung indem Kapazitätsmessungen ^11,12 untersuchen kann, ob Neuromodulation induziert durch die Aktivierung von Liganden gesteuerte Kanäle ¹³ sowie erschließen die Fülle der Informationen, die aus Verwendung von Mutanten, die sowohl Hör-und Gleichgewichtsstörungen ¹⁴ beeinflussen entnommen werden kann.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
(a) NZR (Normal Zebrafish Ringer's) (in mM)	116 NaCl, 2 KCl, 2 CaCl2, 3 Glucose, 5 Na+-HEPES, pH 7.35.
(b) NZR + Tricaine	NZR + 0.02% 3-aminobenzoic acid ethyl ester methane sulfonate (Sigma A5040).
(c) NZR + BSA	NZR + 0.4% Bovine Serum Albumin (Sigma A2153).
(d) LoCaS (Low Ca2+ Solution) (in mM)	100 NaCl, 2 KCl, 0.05 CaCl2, 0.05 MgCl2, 3 Glucose, 30 Na+-HEPES, pH 7.35.
(e) LoCaS + papain	LoCaS + 0.05% L-cysteine (Sigma C1276) + 0.2% papain (Sigma P3375).
(f) K+-internal solution (in mM)	52 K2SO4, 38 KCl, 1 K+-EGTA, 5 K+-HEPES, pH 7.3.
Table 1. Solutions.