内耳有毛細胞におけるパッチクランプ記録は、単離されたゼブラフィッシュから

Summary

このビデオの目的は、成人のゼブラフィッシュの内耳器官から健康な無傷の有毛細胞を取得した後、それらの電位依存性チャネルの生物物理学的特性を特徴付けることを目的としたパッチクランプ研究のためにそれらを使用するための手順を示すことである。

Abstract

種々の種から単離された感覚有毛細胞の電位依存性チャネルのパッチクランプ解析は^、1月4日以前に説明したが、この動画はゼブラフィッシュから有毛細胞へのそれらの技術の最初のアプリケーションを表してきた。球形嚢、つぼ、卵形嚢と三半規管：ここでは、内耳のエンド臓器すべてから健康な無傷の有毛細胞を単離するための方法を示しています。さらに、私たちは、有毛細胞のサイズと形態の多様性を発揮し得ることができるパッチクランプ記録の種類の例を与える。他のものに比べて、このゼブラフィッシュモデルシステムを使用することの利点は、聴覚とバランスの両方に影響を及ぼすゼブラフィッシュ突然変異体の利用に起因しています。トランスジェニック系統と遺伝的解析と操作、細胞単離および電気生理学的手法を利用する他の技術の使用との組み合わせでロール有毛細胞pに大きな洞察を促進しなければならないここで紹介これらの感覚モダリティを媒介することに横たわっていた。

Protocol

1。予備実験の準備

1. 100ミリリットルNZR（通常ゼブラリンゲル）の（a）、（b）50ミリリットルNZR + Tricaine（MS222）、（c）は10ミリリットルNZR + BSAと、（d）100ミリリットルのLoCaS：6溶液（組成は表1を参照）を準備（低Ca ^{2 +の}溶液）、（e）の10ミリリットルLoCaS +パパイン、（f）は、100ミリリットルK ⁺内部 ​​溶液。ソリューションの（a）、（b）、（d）及び（f）4℃で最長1ヶ月まで保存することができるソリューション（c）及び（e）実験の日を準備する必要があります。すべてのソリューションは、実験を開始する前に、室温でなければなりません。
2. ラベルとのほぼ中間ソリューション（）、（C）、（D）と、および（e）4 35ミリメートルペトリ皿を埋める。
3. シルガード（ダウコーニング、ミッドランド、ミシガン州）で60ミリメートルペトリ皿を充填してから、魚が転倒することなく、背筋を伸ばして座るようになり、その中に空洞を切断することによって、解剖皿を作る。
4. ガラスの端に犬の毛の接着卵胞年末までに少なくとも二つの細胞の分離ツールを準備瞬間接着剤とパスツールピペットは、髪は約0.5cmでピペットの末尾を超えて拡張することができます。ラブラドール·レトリバーとWeimaraners風ソフト毛皮の犬の毛はうまくいく。

2。聴覚と前庭迷路の分離

1. NZR + Tricaineを入れたビーカー中に浸漬することにより1成体ゼブラフィッシュを生け贄に捧げる。すべての鰓蓋の動きが止まるまで、視覚的に鰓を監視します。魚を除去し、新鮮なNZRでリンスする前に追加の10分待ちます。これらの手順は、インスティテューショナルアニマルケアによって承認されていると利用ペパーダイン大学の委員会（動物実験委員会）が、承認があなた自身の機関から入手する必要があります。
2. 1それぞれの目のソケットを介して標準縫製ストレートピン（約2.5センチ）とヘッドからの距離の半分に約3分の1背腹軸を介して第3のピンを挿入することにより、最大解剖皿の背側に魚をピンに示すように尾へ図1A。
3. ズーム（0.62-5x）を10倍接眼レンズを装着ステレオ解剖顕微鏡下では、約点から頭蓋骨の屋根を削除することで、脳や脊髄の短い部分を露出させるために、春のはさみ（ファイン科学ツールカタログ番号15000から02）を使用前方の魚の鼻に鰓のレベルまで尾0.5センチメートル。脊髄を切断し、脊髄神経やその他の添付ファイルをカットしながら微鉗子（ファイン科学ツールカタログ番号11251から30）で脳を持ち上げ脳を削除した（ 図1B）捨てる。
4. 残っている頭蓋骨カプセルの腹側半分が内耳器官を含む "ボウル"を形成する。もっと吻方各内耳の尾側に対称に配置lagenasと球形嚢の著名な、白、不透明な耳と横方向に配置卵形嚢の耳石を観察する（ 図1Cおよび図4A）。
5. すべての腹と横attachmenを切断することによって、骨のボウルを取り外しtsは優しく微鉗子で頭からそれを持ち上げながら。 LoCaS（ 図1Dおよび図4B）を含むペトリ皿に入れます。
6. 細かい鉗子の2ペアを使用して、中央に鉗子のポイントを挿入し、半分をこじ開け右半分と左半分を分離し、どちらかの骨の側縁をつかんで離しあるいは、それらを引っ張って、正中線でボウルをバラバラに割れる離れて。細かい鉗子（ 図2）を用いて骨から2迷路を削除します。
7. 三半規管、utricles、球形嚢とlagenas（ 図4C）：聴覚と前庭エンドの臓器を特定するために迷路を点検します。各耳の下のピンクがかった領域が有毛細胞を含む斑です。同様に、半規管の膨大部内側にピンクのストリップは、有毛細胞が配置されている頂を識別します。
8. 慎重に細かい鉗子を使用つぼや卵形嚢から耳石を取り外します（

3。有毛細胞の単離

1. プラスチックホールピペット（Fisher Scientific社のカタログ番号13-711-9AM）を使用して、LoCaS +パパインは、転送される流体の体積を最小限に含まれている皿に終わり器官を動かす。
2. 室温で30分間この溶液中に、これらの構造体を培養する。
3. 潜伏期間の終了時に、NZR + BSAを含む皿に構造体を動かすと、少なくとも30分間この溶液中でインキュベートする。有毛細胞は最大4時間、この溶液中に健康を維持しますが、（次の手順を参照してください）​​分離後1-2時間後に劣化します。
4. 細胞単離のための準備として、NZRを含む皿にエンド器官の一つを移動します。
5. lagenasとutriclesは、優しくピンク色がかった上皮tiの斑-シートをリフトオフする犬の毛を使用有毛細胞（図3A）が含まれてssue。斑はえぐらでき球形嚢の耳石の下から（犬の毛を使用）、半規管の膨大部内側にその場所から頂。
6. ステップ1.4で調製した2細胞単離·ツールを使用して、有毛細胞（図3B）が含まれている残骸フィールドを生成するために黄斑または頂をひいて粉にする。細胞は、少なくとも5分はそれを移動する前に、皿の底に沈ませます。
7. 位相コントラスト光学系を備えた倒立顕微鏡のステージに皿を再配置します。 40X倍率で細胞を観察し、形態の多様性に注意してください。他は長く、薄いながら、多くの細胞はアボカドの形をしている。根尖毛束の存在は有毛細胞としてそれらを識別し、位相の明るさは、自分の健康を保証します。隔離された有毛細胞の顕微鏡写真を図5に示します。

4。ゼブラフィッシュの有毛細胞をパッチクランプ

1. perfoの準備のために場所5mgのアムホテリシンB（シグマA4888）を1.5 mlマイクロチューブに100μlのDMSOで埋める：定格パッチ録音^5,6は 、次のようにアンホテリシン含有の内部溶液を調製します。アムホテリシンのすべてが溶解するまで10〜20秒のために直ちにボルテックスこのソリューション。次に、ピペット625第二マイクロ遠心チューブに液K ⁺内部 ​​溶液。上記のようにK ⁺内部 ​​溶液と渦にアムホテリシン溶液10μlを追加します。在庫アムホテリシンソリューションは、数時間が、1時間後の最終的な解決策を破棄します。
2. 多段階プラー（サターP-1000）を使用して、BF 150-86-10ホウケイ酸ガラス（サターインスツルメンツ）からパッチピペットを作製。ピペットは、約2μmの先端径を有するべきであり、表1のソリューションとMΩ1-3の抵抗値を持つことになります。次のように仕事がうまくあることをプラーの設定：熱=ランプminus10は、= 0の場合、速度を引き出し= 18、遅延= 1、圧力= 600。の形状良いピペットの先端は、図5の挿入図cの写真からも明らかである。彼らは電気生理学的記録の間に、少なくともアクセス抵抗を提供するように鈍い "砲弾型"ピペットが好ましい。
3. アンホテリシン含有のK ⁺内部 ​​液で中途半端に記録電極を埋めるために、28ゲージMicrofilの注射針（世界の精密機器MF28G-5）を使用してください。
4. パッチクランプアンプのヘッドステージに貼って電極を形成する。 -10 mVの、10Hzで10msの電圧ステップを適用し、それが上下のセルの近くに録音皿の底に空気/溶液界面を介して操作されるように電極に正圧を維持します。
5. 健康的な細胞に直角に電極を配置します。電極はそれが出て流動ソリューションから脱却始まるように細胞に十分近いとき、迅速にその上にセルの "ジャンプ"まで、電極にわずかな真空を適用し、圧力を逆にしてください。すぐに目の上の吸引をやめるeは、電極と電極の内側に70mVの保持電位を適用します。数秒以内にgigaohmシールが形成されます。
6. シール形成直後に表示される電圧ステップの開始と終了時の過渡電流容量を守ってください。トランジェントが（約10分）、その最大サイズまでの大きさに成長するように見てアムホテリシンによって電極下膜の穿孔を継続的に監視します。
7. 健康な細胞で細胞全体（穴あき）の構成の確立を確認するには、過分極と電圧のステップを脱分極を適用することによって、外向きK ⁺電流を誘発する。ほとんどの有毛細胞は顕著な外向き電流（ 図6を参照）。

5。代表的な結果

図4は、細胞単離のステップの間に撮影した画像を示しています。パネルで、lagenas、saccluliとutriclesに関連付けられている耳石がthrouを見ることができますGHそれらの上に横たわることを骨の薄い層。これらの不透明な構造は解剖の後続のステップの間に動物から終わり臓器の安全な取り外しを助けるために便利な観光スポットを提供します。パネルBは、無傷の迷路とutricles、lagenasと球形嚢の著名な耳石が含まれている骨の "ボウル"を示しています。パネルCは、骨から削除された迷路を示しています。つぼでスカラップ縁で大きな耳、卵形嚢で球形嚢と豆の形をした耳石でつらら状の耳石に注意してください。つぼから単離された細胞で見られる大きさと形態の多様性の一部は、 図5に示されている。健康な細胞は容易に鋭い境界を持つ明るい相として識別される。セル形状は、大きく2つのクラスに分割することができます：アボカド状（AVO）と長くて細い（THN）各グループ内のセルのサイズが著しく異なることがありますが（例：AVO 1とAVO 3の比較）。はめ込みのクラスタを示しています互いに完全に分離されなかった3セル。挿入図bのセルの黒い色と粒状の外観は容易に死んだとして、このセルを識別します。挿入図cは 、これらの細胞から記録するための適切な形状と寸法を示すパッチピペットの先端を示しています。

図6に示すように、現在のトレースは、 図5に示すAVO 2に類似つぼセルに課せられた可能性の段階を過分極と脱分極に応答して得られた。異なるサイズと形状の細胞内での電流応答は、広く電位依存性チャネルの補数の多様性を示唆して変えることができます。

図1-3：有毛細胞の単離の工程を示す漫画。

図1頭蓋骨capsuの除去ゼブラから内耳迷路を含むル。皿を解剖するゼブラフィッシュの背側を犠牲にピン。Bは 。オープン頭蓋骨、脳を取り外して廃棄します。Cは 。 utricles、lagenasと球形嚢。Dの耳石を観察します。迷路を含む頭蓋骨カプセルの腹の部分を削除します。

図2：頭蓋骨カプセルから迷路の除去。その正中線で頭蓋骨カプセルを離れて取り締まる。B。骨から迷路を削除します。Cは 。ピンセットを用いてlagenasとutriclesから耳石を取り出します。

図3：迷路から有毛細胞の単離。優しくミリアンペアを持ち上げ犬の毛とculaeますb。 2犬の毛に斑をひいて粉にする。 C.は、パッチクランプ用の分離有毛細胞を使用してください。

図4：個々の細胞の単離のステップの間に撮影した画像は、脳を除去した後にAを 、2 lagenasと球形嚢（矢印）に関連付けられている耳石とutriclesが（矢頭）可視化することができる。腹を除去した後、Bの動物から内耳器官が含まれている頭蓋骨のカプセルの一部。 Bの右半分の漫画は左卵形嚢、つぼと球形嚢の位置を識別します。破線は左の迷路のおおよその位置を示します。C。右の迷宮（中央図）、D：C言語で迷路の主要部分を説明する漫画を描いてきた。 ：前半円形運河、B：水平の運河は、c：後部運河は、d：小嚢の耳石、E：嚢状耳石、F：lagenal耳石。 Dの中のスケールバーは1 mmでAとB、CとDは0.5mmを表し

図5の形態の多様性を説明するためのつぼから隔離された、健康な細胞; AVO：アボカド状細胞; THN：長い、薄いセル。挿入図：3不完全に単離された細胞のクラスター;はめ込みB：死んだ細胞、はめ込みがc：ゼブラフィッシュの有毛細胞から電気生理学的記録に使用されるパッチ電極の先端。スケールバー=20μmでは、メインの人物と、そのすべてのインセットに適用されます。

パッチに記録図6電流は、有毛細胞をクランプされます。セル内の平均化された応答（類似トン図5のO AVO 2）70mVの保持電位から-140 mVから70 mVから10 mV刻みで印加された電圧ステップの3つのプレゼンテーションへ。より脱分極電位で表示され、現在の不活化に注意してください。電圧ステップの大きさは、一部のトレースの隣に表示されます。

Discussion

エンド臓器や細胞の穏やかな治療法を慎重に切開は、健康、無傷と生理活性有毛細胞の単離に成功するために重要です。次のヒントに従うことにより、成功を保証します：

1. それはより小さい魚（長さ2〜2.5センチメートル）から健康な細胞を得ることが容易である。大きい魚は解剖プロセス中にその曖昧な視覚化、より多くの脂肪滴を持つ。
2. 有毛細胞を覆っている耳石を、削除する場合は、注意が必要。鉗子で耳石を掴ん時にセルには触れないでください。
3. 斑と頂がシートや上皮から粉砕細胞としてリフトオフされるときに最良の結果が得られる。
4. 我々は、人間のまつげのようにテーパーが少なく柔軟ではありません^7を使用^{することを}含め、他の方法より優れていることが細胞をひいて粉にするために犬の毛の使用を見つける。
5. パッチクランプ法、tに正圧印加時それは先端を清潔に保つことが重要である空気/溶液界面を通過する際に、彼は電極。電極上に "ジャンプ"するには、セルを有効にするには、正圧のリリースも重要である。この方法は、このようにセルとgigaohmシールを形成する可能性を高める、アウェイチップからアンホテリシン含有の少量の溶液をクリアします。私たちの実験では、代わりに、より伝統的な細胞全体の構成のために、細胞の脆弱性の穿孔パッチ記録法を使用しています。 gigaohmシールの損失でしばしば結果 "全細胞を行く"しようとしています。

ここで説明する方法は、動物ごとに健康な髪の細胞の何百ものをもたらすでしょう。技術は室温で行い、解剖顕微鏡を超えて、特別な機器を必要とすることはできません。 JOVEにおける前回の報告書では、腹側アプローチ^8を使用^したゼブラフィッシュ内耳の解剖について説明します。これらの著者はdisseを実証全体的には、パラホルムアルデヒド固定内耳器官のction。私達は私達の方法との比較のためにこの動画を視聴するには、読者を奨励しています。ここで紹介する方法の利点の一つは、生理的な調査のための有用な生細胞の取得です。これらの細胞の使用は容量測定を^{11,12にする}ことによって、細胞共鳴^9,10、モニターの神経伝達物質の放出を検討するように拡張することができます（ここに示されているように）電位依存性チャネルを研究するためのパッチクランプ実験に使うだけでなく、によって誘導される神経調節を調べるリガンド依存性チャネル¹³の活性化だけでなく、聴覚やバランス¹⁴の両方に影響を及ぼす変異体を用いたから収集することができ、豊富な情報を活用する。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
(a) NZR (Normal Zebrafish Ringer's) (in mM)	116 NaCl, 2 KCl, 2 CaCl2, 3 Glucose, 5 Na+-HEPES, pH 7.35.
(b) NZR + Tricaine	NZR + 0.02% 3-aminobenzoic acid ethyl ester methane sulfonate (Sigma A5040).
(c) NZR + BSA	NZR + 0.4% Bovine Serum Albumin (Sigma A2153).
(d) LoCaS (Low Ca2+ Solution) (in mM)	100 NaCl, 2 KCl, 0.05 CaCl2, 0.05 MgCl2, 3 Glucose, 30 Na+-HEPES, pH 7.35.
(e) LoCaS + papain	LoCaS + 0.05% L-cysteine (Sigma C1276) + 0.2% papain (Sigma P3375).
(f) K+-internal solution (in mM)	52 K2SO4, 38 KCl, 1 K+-EGTA, 5 K+-HEPES, pH 7.3.
Table 1. Solutions.