Patch Clamp Recordings i Indre ørehår celler isolert fra sebrafisk

Summary

Formålet med denne videoen er å demonstrere prosedyrer for å innhente sunne, intakte hårceller fra det indre øret organer av voksen sebrafisk og deretter bruke dem for patch clamp studier med sikte på å karakterisere biofysiske egenskaper deres spenningsstyrte kanaler.

Abstract

Patch clamp analyser av spenningsstyrte kanaler i sensoriske hårcellene isolert fra en rekke arter har blitt beskrevet tidligere ^1-4 men denne videoen representerer den første anvendelsen av disse teknikkene til hår celler fra sebrafisk. Her viser vi en metode for å isolere sunne, uskadde hårcellene fra alle de indre øret indre organer: saccule, lagena, utricle og halvsirkelformet kanaler. Videre viser vi mangfoldet i håret celle størrelse og morfologi og gi et eksempel på hva slags patch clamp opptak som kan skaffes. Fordelen med bruk av denne sebrafisk modellsystem over andre stammer fra tilgjengeligheten av sebrafisk mutanter som påvirker både hørsel og balanse. I kombinasjon med bruk av transgene linjer og andre teknikker som utnytter genetisk analyse og manipulasjon, cellen isolasjon og elektrofysiologiske metoder introdusert her bør rette for større innsikt i roller hårcellene plå i formidling disse sensoriske modaliteter.

Protocol

1. Pre-eksperimentelle Forberedelser

1. Forbered seks løsninger (se tabell 1 for preparater): (a) 100 ml NZR (normal sebrafisk Ringers), (b) 50 ml NZR + Tricaine (MS222), (c) 10 ml NZR + BSA, (d) 100 ml Locas (lav Ca ^{2 +} oppløsning), (e) 10 ml Locas + papain, (f) 100 ml K ^+-interne løsninger. Løsninger (a), (b), (d) og (f) kan lagres i opp til en måned ved 4 ° C. Løsninger (c) og (e) bør være forberedt dagen av eksperimentering. Alle løsningene bør være ved romtemperatur før begynnelsen eksperimenter.
2. Produsent og fyll fire 35 mm petriskåler omtrent halvveis med løsninger (a), (c), (d) og (e).
3. Lage en dissekere rett ved å fylle en 60 mm petriskål med Sylgard (Dow Corning, Midland, MI) og deretter kutte et hulrom i det som vil tillate en fisk til å sitte oppreist uten å velte.
4. Forberede minst to celleisolasjon verktøy ved liming hårsekken slutten av en dog hår til slutten av et glassPasteur pipette med superlim, slik at håret å forlenges forbi enden av pipetten med ca 0,5 cm. Hårene fra soft-pels hunder som Labrador retriever og Weimaraners fungere godt.

2. Isolering av Auditiv og Vestibularisnevritt Labyrinth

1. Ofre en voksen sebrafisk ved nedsenkning i et beger med NZR + Tricaine. Visuelt overvåke gjellene til alle opercular bevegelser har opphørt. Vent ytterligere ti minutter før du tar fisk og skylle med friskt NZR. Disse prosedyrene har blitt godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité (IACUC) av Pepperdine University, men godkjenning kan skaffes fra din egen institusjon.
2. Pin fisken til dissekere parabolen dorsal side opp ved å sette en standard sy rett pin (ca 2,5 cm lang) gjennom hvert øye socket og en tredje pinne gjennom dorsal-ventral aksen om lag en tredjedel til halvparten av avstanden fra hodet til hale som illustrert iFigur 1A.
3. Under en zoom (0,62-5x) stereo disseksjonsmikroskop utstyrt med 10x okularer, bruk våren saks (Fine Science Verktøy katalognummer 15000-02) for å avsløre hjernen og en kort segment av ryggmargen ved å fjerne skallen taket fra et punkt ca 0,5 cm Caudal til nivået av gjellene frem til nesen av fisken. Skjær ryggmargen og løft hjernen med fine tang (Fine Science Verktøy katalognummer 11251-30) mens kutte spinal nerver og andre vedlegg, fjern hjernen og kast (figur 1B).
4. Ventral halvdelen av skallen kapsel som gjenstår danner en "bolle" som inneholder det indre øret organer. Observere de fremste, hvite, ugjennomsiktige otolitter i lagenas og sacculi ligger symmetrisk på caudal slutten av hver indre øret og sideveis plasserte utricle otolitter mer rostrally (Tall 1C og 4A).
5. Fjern bollen av bein ved å kutte alle ventrale og laterale attachments mens forsiktig løfte den ut av hodet med fine tang. Plassere den i petriskål inneholder Locas (Tall 1D og 4B).
6. Bruk av to par av fine pinsetter, sprekk hverandre bollen ved midtlinjen sin ved enten gripe sidekanter benet og trekke dem fra hverandre eller alternativt, separering høyre og venstre halvdeler ved å sette punktene pinsettangens i sentrum og nysgjerrige halvdelene hverandre. Fjerne de to labyrinter fra benet ved hjelp av fine pinsetter (figur 2).
7. Inspisere labyrintene for å identifisere auditive og vestibulære indre organer: den halvsirkelformede kanaler, utricles, sacculi og lagenas (Figur 4C). De rosa områder under hver otolith er maculae inneholder hårceller. Tilsvarende identifiserer en stripe av rosa inni ampullae av halvsirkelformet kanalene i cupula hvor hårcellene er plassert.
8. Fjern forsiktig otolitter fra lagena og utricle med den fine tang (

3. Hair Cell Isolation

1. Ved hjelp av en plast overføringspipetten (Fisher Scientific katalognummer 13-711-9 AM), flytte indre organer til parabolen inneholder Locas + papain minimere volumet av væske overføres.
2. Inkuber disse strukturene i denne løsningen i tretti minutter ved romtemperatur.
3. På slutten av inkubasjonstiden, flytter strukturene til parabolen inneholdende NZR + BSA og inkuberes i denne løsningen i minst tretti minutter. Hårcellene vil forbli sunt i denne løsningen for opptil fire timer, men vil svekkes etter 1-2 timer etter isolasjon (se neste trinn).
4. I forberedelsene til celleisolasjon, flytte en av de indre organer til parabolen inneholder NZR.
5. For lagenas og utricles, bruk en hund hår til å forsiktig løft av maculae ark av rosa epithelial tissue som inneholder hårcellene (figur 3A). Den maculae kan øses ut (ved hjelp av en hund hår) fra under otolitter av sacculi, og cupulae fra sine steder inne i ampullae av halvsirkelformet kanalene.
6. Ved å bruke to celleisolasjon verktøy fremstilt i trinn 1.4, triturate en makula eller cupula å generere en rusk feltet som inneholder hårcellene (figur 3B). La cellene minst fem minutter for å avgjøre på bunnen av fatet før den flyttes.
7. Flytte parabolen til scenen av en omvendt mikroskop utstyrt med fasekontrast optikk. Observere celler under 40X forstørrelse og merk mangfoldet i morfologi. Mange celler er avokado-formet, mens andre er lang og tynn. Tilstedeværelsen av apikale hårbunter identifiserer dem som hårceller og fase-lysstyrke sikrer deres helse. Photomicrographs av isolerte hårcellene er vist i Figur 5.

4. Patch Clamping sebrafisk hårcellene

1. I forberedelsene til perfokarakter patch opptak ^5,6, forberede amfotericin-holdig intern løsning som følger: sted 5 mg amfotericin B (Sigma A4888) i et 1,5 ml mikrosentrifugerør og fyll med 100 pl DMSO. Umiddelbart vortex denne løsningen i 10-20 sekunder til all amfotericin oppløses. Deretter, pipette 625 pl K ^+-interne løsninger inn i en andre mikrosentrifugerør. Tilsett 10 pl av den amfotericin løsningen til K ^+-interne løsninger og virvle som ovenfor. Bestanden amfotericin løsningen vil vare i flere timer, men kastes sluttløsningen etter én time.
2. Dikte patch pipetter fra BF 150-86-10 borsilikatglass (Sutter Instruments) ved hjelp av en multi-stage avtrekker (Sutter P-1000). Pipetter burde ha tips diameter på ca 2 mikrometer og vil ha motstand av 1-3 MΩ med løsningene i tabell 1. Innstillingene på avtrekker som fungerer godt er som følger: Heat = rampe minus10, Pull = 0, Velocity = 18, Delay = 1, Pressure = 600. Formentuppen av en god pipette er tydelig fra fotografiet i det innfelte c av Figur 5. Blunt "bullet-formet" pipettene er foretrukket som de tilbyr minst tilgang motstand under elektrofysiologiske opptak.
3. Bruk en 28 sporvidde Microfil sprøytenålen (MF28G-5; Verden Precision Instruments) for å fylle et opptak elektrode halvveis med amfotericin-holdige K ^+-intern løsning.
4. Fest elektroden til headstage av en patch clamp forsterker. Påfør -10 mV, 10 ms spenning trinn ved 10 Hz og opprettholde positivt trykk i elektroden som det manøvreres gjennom luft / løsningen grensesnitt og ned til bunnen av opptaket parabolen nær cellene.
5. Plasser elektroden ortogonalt til en sunn celle. Når elektroden er nær nok til cellen slik at det begynner å bevege seg bort fra den ut-strømmende løsning, raskt reversere trykket påføre en svak vakuum til elektroden til cellen "hopper" ned i den. Umiddelbart slutte sug på the elektrode og anvende en holder potensialet -70 mV til innsiden av elektroden. Innen et par sekunder en gigaohm segl vil danne.
6. Observere kapasitive gjeldende transienter på utbruddet og oppsigelse av spenningen trinnene som vises kort tid etter sel formasjon. Fortsette å overvåke perforasjon av membranen under elektroden ved amfotericin ved å se som transienter vokse i størrelsesorden opp til maksimal størrelse (i omtrent ti minutter).
7. For å bekrefte etablering av hel-celle (perforert) konfigurasjon i en frisk celle, lokke fram utover K ⁺ strøm ved å bruke hyperpolarizing og depolariserende trinn på spenning. De fleste hårcellene har fremtredende ytre strøm (se figur 6).

5. Representant Resultater

Figur 4 viser bilder tatt under de trinn celleisolasjon. I panel A, kan otolitter knyttet til lagenas, saccluli og utricles ses through det tynne laget av bein som ligger over dem. Disse ugjennomsiktige strukturene gir praktiske landemerker til hjelp i sikker fjerning av de indre organer fra dyret under de etterfølgende trinn i disseksjon. Panel B viser "bolle" av bein som inneholder intakte labyrinter og fremtredende otolitter i utricles, lagenas og sacculi. Panel C viser en labyrint som har blitt fjernet fra benet. Legg merke til den store otolith med scalloped kant i lagena, den istapp-formet otolith i saccule og bønne-formet otolith i utricle. Noen av mangfoldet i størrelse og morfologi sett i celler isolert fra lagena er illustrert i Figur 5. En sunn celle er lett identifisert som fase lyse med en skarp omkrets. Celleformer kan grovt deles inn i to klasser: Avokado-formet (AVO) og lang og tynn (thn) selv om størrelsen på cellene i hver gruppe kan variere betydelig (sammenlign for eksempel avo 1 og avo 3). Innfelt en viser en klynge avtre celler som ikke var helt isolert fra hverandre. Den svarte fargen og granulært utseende av cellen i innfelte b identifiserer lett denne cellen som døde. Innsatt c viser spissen av en patch pipette illustrerer form og dimensjoner passende for opptak fra disse cellene.

Gjeldende spor vist i Figur 6 ble oppnådd som reaksjon på hyperpolarizing og depolariserende trinnene av potensial som pålegges lagena celle lik avo 2 vist i figur 5. Gjeldende responser i celler i forskjellige størrelser og former kan variere mye foreslå mangfold i komplementet av spenningsstyrte kanaler.

Figurene 1-3: Tegneserier illustrerer trinnene i isolering av hårcellene.

Figur 1. Fjerning av skallen capsule inneholder det indre øret labyrinter fra sebrafisk. A. Pin ofret sebrafisk dorsal side opp til dissecting parabolen. B. Åpen skallen og ta bort hjernen. C. Observere otolitter i utricles, lagenas og sacculi. D. Fjern ventral del av skallen kapsel inneholder labyrinter.

Figur 2. Fjerning av labyrinter fra skallen kapsel. A. Sprekk hverandre skull kapsel til midtlinjen sin. B. Fjern labyrinter fra bein. C. Fjerne otolitter fra lagenas og utricles med pinsett.

Figur 3. Isolering av hårceller fra labyrinter. A. Forsiktig løft av maculae med en hund hår. B. Triturate maculae med to hunden hår. C. Bruk isolerte hårcellene for patch clamp.

Figur 4. Images tatt under trinn i isoleringen av individuelle celler. A. Etter fjerning av hjernen, kan otolitter forbundet med to lagenas og sacculi (piler) og utricles (pilhoder) bli visualisert. B. Etter fjerning av ventrale parti av skallen kapsel som inneholder det indre øret organer fra dyret. Tegneserie i høyre halvdel av B identifiserer plasseringen av venstre utricle, lagena og saccule. Den stiplede linje indikerer den omtrentlige posisjonen til venstre labyrinten. C. Høyre labyrint (medial visning) D: Cartoon tegning som illustrerer viktige deler av labyrinten i C. a: anterior semisirkulær kanal, b: horisontal kanal, c: posterior kanalen, d: utricular otolith, e: saccular otolith, f: lagenal otolith. Skala bar i D representerer 1 mm for A og B, 0,5 mm for C og D.

Figur 5 Isolerte, sunne celler fra lagena illustrerer mangfoldet av morfologi, avo:. Avocado formede celler, thn: lange, tynne celler. Inset a: klynge av tre ufullstendig isolerte celler, innfelt b: død celle, innfelt c: tuppen av patch elektrode som brukes i elektrofysiologiske opptak fra sebrafisk hårceller. Målestokk = 20 mikrometer gjelder de viktigste figuren og alle innfellinger.

Figur 6. Currents registrert i en patch festet hår celle. Gjennomsnittlig svar i en celle (tilsvarende to avo 2 i figur 5) for å tre presentasjoner av spenning trinn anvendt i 10 mV trinn fra -140 mV til 70 mV fra en driftsenhet potensial på -70 mV. Legg merke til inaktivere strøm som vises på flere depolariserte potensialer. Voltage trinn magnitudes vises ved siden av noen av sporene.

Discussion

Forsiktig disseksjon av slutten organer og skånsom behandling av cellene er avgjørende for vellykket isolering av sunne, intakte og fysiologisk aktive hårceller. Hvis man følger følgende tips vil sikre suksess:

1. Det er lettere å få tak i friske celler fra mindre fisk (2 til 2,5 cm i lengde). Større fisk har mange flere fete dråper som obskure visualisering under disseksjon prosessen.
2. Care må tas når du fjerner otolitter, som ligger over hårcellene. Unngå å ta på cellene når gripe otolitter med pinsett.
3. Best resultat oppnås når maculae og cupulae løftes bort som ark og cellene gnidd fra epitel.
4. Vi finne bruk av en hund hår å triturate celler å være overlegne i forhold til andre metoder, herunder ved hjelp av humane øyevipper ⁷ som ikke er så avsmalnet og mindre fleksibel.
5. Under patch festebraketter, anvendelse av overtrykk til than elektrode som det passerer gjennom luft / løsningen grensesnittet er viktig å holde spissen ren. Frigivelsen av overtrykk å aktivere cellen å "hoppe" på elektroden er også viktig. Denne metoden fjerner et lite volum av amfotericin-holdige løsning bort fra spissen, og dermed øker sannsynligheten for å danne en tetning med gigaohm cellen. I våre eksperimenter bruker vi den perforerte patch opptaksteknikk stedet for den mer tradisjonelle hele-celle konfigurasjon på grunn av skjørhet av cellene. Forsøk på å "gå hele cellen" resulterer ofte i tap av gigaohm segl.

Metoden som er beskrevet her, vil gi flere hundre friske hårceller per dyr. Teknikken kan utføres ved romtemperatur og krever ikke noe spesielt utstyr utover et disseksjonsmikroskop. En tidligere rapport i Jove beskriver disseksjon av det indre øret i sebrafisk ved hjelp av en ventral tilnærming ^8. Disse forfatterne demonstrere disseDette skjer av hele, paraformaldehyd-faste indre øret organer. Vi oppfordrer leseren til å se denne videoen for sammenligning med våre metoder. En fordel med de metodene som presenteres her er innhenting av levende celler som er nyttige for fysiologiske undersøkelser. Foruten deres bruk i patch clamp eksperimenter for å studere de spenningsstyrte kanaler (som vist her) bruk av disse cellene kan bli utvidet til å studere celle resonans ^9,10, overvåke neurotransmitterfrigjørelse ved å gjøre kapasitansmålinger ^11,12, undersøke neuromodulation indusert av aktivering av ligand gated kanaler ¹³ samt benytte seg vell av informasjon som kan være gleaned fra å bruke mutanter som påvirker både hørsel og balanse ^14.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
(a) NZR (Normal Zebrafish Ringer's) (in mM)	116 NaCl, 2 KCl, 2 CaCl2, 3 Glucose, 5 Na+-HEPES, pH 7.35.
(b) NZR + Tricaine	NZR + 0.02% 3-aminobenzoic acid ethyl ester methane sulfonate (Sigma A5040).
(c) NZR + BSA	NZR + 0.4% Bovine Serum Albumin (Sigma A2153).
(d) LoCaS (Low Ca2+ Solution) (in mM)	100 NaCl, 2 KCl, 0.05 CaCl2, 0.05 MgCl2, 3 Glucose, 30 Na+-HEPES, pH 7.35.
(e) LoCaS + papain	LoCaS + 0.05% L-cysteine (Sigma C1276) + 0.2% papain (Sigma P3375).
(f) K+-internal solution (in mM)	52 K2SO4, 38 KCl, 1 K+-EGTA, 5 K+-HEPES, pH 7.3.
Table 1. Solutions.