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Bioengineering

Bacterial Detection & identification au moyen de capteurs électrochimiques

Published: April 23, 2013 doi: 10.3791/4282

Summary

Nous décrirons une méthode de dosage du capteur électrochimique pour la détection rapide de bactéries et d'identification. L'essai comporte une matrice de capteurs fonctionnalisé avec de l'ADN d'oligonucléotides sondes de capture pour des séquences spécifiques d'espèces d'ARN ribosomique (ARNr). Sandwich hybridation de l'ARNr cible avec la sonde de capture et une sonde de détection d'oligonucléotides d'ADN lié à la peroxydase de raifort produit un courant ampérométrique mesurable.

Abstract

Les capteurs électrochimiques sont largement utilisés pour la mesure rapide et précise de glucose dans le sang et peuvent être adaptés à la détection d'une large variété d'analytes. Les capteurs électrochimiques fonctionnent par transduction d'un événement de reconnaissance biologique en un signal électrique utile. La transduction de signal se produit par couplage de l'activité d'une enzyme d'oxydo-réduction pour une électrode ampérométrique. spécificité du capteur est soit une caractéristique inhérente de l'enzyme, la glucose-oxydase dans le cas d'un capteur de glucose, ou un produit de couplage entre l'enzyme et un anticorps ou une sonde.

Ici, nous décrivons une méthode de dosage du capteur électrochimique pour détecter directement et identifier les bactéries. Dans tous les cas, les sondes décrites ici sont des oligonucléotides d'ADN. Cette méthode est basée sur hybridation sandwich de capture et de détection des sondes avec cible ARN ribosomal (ARNr). La sonde de capture est fixée à la surface du capteur, tandis que la sonde de détection est lié à horseradish peroxydase (HRP). Quand un substrat tel que le 3,3 ', 5,5'-tétraméthylbenzidine (TMB) est ajouté à une électrode avec des complexes de capture-cible-détecteur lié à sa surface, le substrat est oxydée par le HRP et réduit par l'électrode de travail. Cette redox cycle conduit à la navette d'électrons par le substrat de l'électrode à la HRP, produisant le flux de courant dans l'électrode.

Introduction

Utiliser ARNr comme une molécule cible pour la détection et l'identification bactérienne a un certain nombre d'avantages. L'abondance de l'ARNr dans les cellules bactériennes prévoit une limite de sensibilité aussi bas que 250 bactéries par millilitre, sans la nécessité d'amplification de la cible 1. ARNr bactérien contient des séquences spécifiques d'espèces uniques qui sont accessibles à l'hybridation avec des sondes d'ADN. En conséquence, un ensemble de capteurs électrochimiques peut être utilisée pour identifier des bactéries inconnues, où chaque capteur est fonctionnalisé avec une sonde de capture spécifique d'espèce différente. Capteurs de contrôle positifs doivent être inclus pour une cible d'oligonucléotides synthétiques qui «ponts» de la capture et des sondes de détection pour créer un signal de calibrage interne.

Les capteurs électrochimiques ont une large gamme d'applications de recherche fondamentale et translationnelle. Par exemple, le dosage décrit ici a été utilisé pour mesurer précisément l'effet de E. phase de croissance coli sur les RRNA et le nombre de copies pré-ARNr, qui est d'un grand intérêt pour les chercheurs qui s'intéressent à la physiologie bactérienne 2. La sensibilité du test de détection électrochimique est déterminé par le rapport signal sur bruit. Une variété d'amplification du signal et des méthodes de réduction du bruit ont été explorées. Nous constatons que l'amélioration de la chimie de la surface du capteur est essentielle pour réduire la liaison non spécifique de la sonde de détection et / ou enzyme HRP. En particulier, une monocouche mixte de alkanedithiols et mercaptohexanol a été trouvée pour réduire le fond, en recouvrant la surface de l'électrode plus complètement, tout en conservant l'accessibilité de la sonde de capture pour l'hybridation de la cible 3. Ces traitements chimiques de surface sont particulièrement importants pour les essais portant sur des échantillons biologiques complexes.

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Protocol

1. Fonctionnalisation des capteurs électrochimiques

  1. Préparer la sonde de capture thiolée à une concentration de 0,05 um à 300 um 1,6-Hexanedithiol (HDT), 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,3 M de NaCl, 1 mM EDTA et incuber dans l'obscurité à la température ambiante pendant 10 min . L'incubation de la sonde de capture thiolé avec HDT assure que le groupe thiol sur la sonde de capture est réduite, ce qui entraîne des résultats plus cohérents.
  2. Appliquer un courant d'azote à l'or nu 16 puce de réseau de capteurs (s) pendant 5 secondes pour éliminer l'humidité et / ou de particules.
  3. Appliquer 6 pl du mélange de sondes de capture HDT-thiolé à l'électrode de travail de l'ensemble 16 des capteurs du réseau de capteurs et de stocker la puce de capteur (s) dans une boîte de Petri couverte à 4 ° C pendant une nuit. Des sondes de capture thiolées se lient directement à l'électrode d'or à nu et la HDT agit pour empêcher suremballage des sondes de capture et de les maintenir dans une conformation étendue qui favorise l'hybridation avec la cible.
  4. Leaprès jour, laver la puce du capteur avec déminéralisée H 2 O pendant 2-3 sec et sec sous un courant d'azote pendant 5 sec.
  5. Appliquer 6 pi de 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,3 M de NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM 6-mercapto-1-hexanol (SMI) à l'électrode de travail de l'ensemble des 16 capteurs et incuber pendant 50 min. Ceci et toutes les incubations de puces de capteurs qui suivent sont réalisées dans une boîte de Petri couvert à la température ambiante. MCH agit comme un agent de blocage, de remplissage dans les fentes, où la sonde de capture thiolé ou HDT n'est pas présent sur la surface de l'électrode.

2. Préparation des échantillons

  1. Transférer 1 ml de culture bactérienne dans la phase logarithmique de croissance (DO600 ≈ 0,1) dans un tube à centrifuger et centrifuger à 16000 g pendant 5 min. Eliminer le surnageant de culture. Le culot bactérien peut être traitée immédiatement ou stocké à -80 ° C pour une utilisation ultérieure.
  2. Soigneusement remettre le culot bactérien dans 10 pi de 1 M NaOH en appliquant la pointe de la pipette au bottom du tube de centrifugation et de pipetage de haut en bas plusieurs fois. Incuber la suspension à température ambiante pendant 5 min.
  3. Neutraliser le lysat bactérien en ajoutant 50 pl de 1 M tampon phosphate, pH 7,2, contenant 2,5% de sérum-albumine bovine mM (BSA) et 0,25 d'une sonde de détection de fluorescéine modifié. Incuber le lysat neutralisé pendant 10 min à température ambiante. Sondes de détection fluorescéine modifiés s'hybrident avec des molécules cibles d'ARNr bactériens.

3. Capteur électrochimique Assay

  1. Laver le SMI de la puce du capteur avec déminéralisée H 2 O pendant 2-3 sec et sec sous un courant d'azote pendant 5 sec.
  2. Appliquer 4 de lysat bactérien neutralisé à l'électrode de travail de chacun des 14 capteurs et incuber pendant 15 min. Complexes sonde-cible s'hybrident détecteur de sondes de capture immobilisées thiolés.
  3. Appliquer 4 l de 1 nM de transition oligonucléotide à 1 M tampon phosphate, pH 7,2, contenant 2,5% de BSA et 0,25 μ M fluorescéine modifié sonde de détection à 2 capteurs de contrôle positif (utilisé pour la normalisation du signal) et incuber pendant 15 min.
  4. Laver la puce du capteur avec déminéralisée H 2 O pendant 2-3 sec et sec sous un courant d'azote pendant 5 sec.
  5. Appliquer 4 ul de 0,5 U / ml anti-fluorescéine-HRP à 1 M tampon phosphate, pH 7,2, contenant 0,5% de caséine à l'électrode de travail de l'ensemble des 16 capteurs et incuber pendant 15 min. L'anti-fluorescéine-HRP se lie aux sondes de détection de fluorescéine modifiés immobilisés.
  6. Laver la puce du capteur avec déminéralisée H 2 O pendant 2-3 sec et sec sous un courant d'azote pendant 5 sec.
  7. Appliquer un film autocollant bien à la surface de la puce du capteur et la charge dans le support de la puce capteur. Pipette 50 ul de substrat TMB sur les 16 capteurs et fermer le support de puce capteur.
  8. Obtenir amperometry et les mesures de voltampérométrie cycliques pour les 16 capteurs en utilisant le lecteur de puce Hélios. Courant ampérométrique est proportionnelle à la vitesse de TMB réduction sur la surface du capteur (voir Figure 1).

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Representative Results

Nous décrivons un dosage électrochimique qui est structuré de manière similaire à un test ELISA sandwich. Comme le montre la figure 1, la cible d'ARN ribosomal (ARNr) l'hybridation avec des sondes de capture et de détection est développée par une réaction d'oxydo-réduction catalysée par HRP conjugué à des fragments d'anticorps anti-fluorescéine qui se lient à la liaison 3 'fluorescéine sur la sonde de détection. Un élément important de la sensibilité du dosage est la chimie de surface de l'électrode en or. Nous avons constaté qu'une monocouche ternaire constitué de sondes de capture, thiolés mercaptohexanol et Hexanedithiol améliore de manière significative le rapport signal-sur-bruit en réduisant fond non spécifique de liaison de la protéine rapporteur 3. Les tests décrits ici employer un 16 puce de réseau de capteurs GeneFluidics montre la figure 2. Chacun des capteurs de la matrice contiennent des trois électrodes, de travail, de référence et auxiliaire, qui ont des points de contact au niveau du bord de la puce 4. La puce lueer a des broches de pogo qui se connectent à chacun des points de contact. Le lecteur de puce sert d'interface pour le réseau de capteurs avec un potentiomètre commandé par un algorithme informatique.

Des exemples de électrochimique courant du capteur sont présentés dans la figure 3. La circulation du courant dans les capteurs est artificiellement élevé pendant les premières secondes après que les mesures ampérométriques commencent à cause de l'accumulation de substrat oxydé pendant le temps de l'application de TMB à la surface du capteur de lancer l'algorithme de lecteur. Le flux de courant atteint rapidement un état stable et des mesures précises de capteur puisse être obtenue dans les soixante secondes. dosages de capteurs sont généralement effectuées en double comme un contrôle interne de la variabilité du capteur. Nous avons constaté que la variabilité capteur-capteur est relativement constante, de sorte qu'il est possible d'effectuer 16 tests de capteurs différents en parallèle sur les GeneFluidics de puce de réseau de 16 capteurs. Des contrôles positifs et négatifs sont essentiel. Comme contrôle positif, on inclut un "pontage" oligonucléotide d'ADN synthétique qui s'hybride à la fois la capture et les sondes de détection et sert de cible synthétique, de concentration connue. De cette façon, les résultats obtenus à l'aide des fonctions de transition d'oligonucléotides comme un contrôle d'étalonnage interne pour minimiser la variation puce à puce.

Lors du test de capture et sondes de détection, la limite de détection doit être déterminée par dilution en série d'un échantillon de concentration connue. Comme le montre la figure 4, il existe une corrélation logarithmique linéaire entre la concentration de l'échantillon et de sortie du signal dans la plage dynamique de l'analyse. La limite de détection est définie comme la concentration de la cible requis pour générer un signal qui est 3,29 écart-type supérieur à la moyenne des signaux de fond 5. Pour l'identification de bactéries dans un échantillon inconnu, un panel de capture pertinents et paires de sondes de détection sont sélectionnés. Le choix des sondes is déterminé par les types de bactéries suspectées dans un type particulier de l'échantillon. Bien sûr, les bactéries inhabituelles peuvent parfois être trouvées dans n'importe quel échantillon, nous recommandons une paire de sondes eubactérienne être inclus qui a la capacité de s'hybrider à des régions de l'ARNr conservées de toutes les bactéries. Figure 5 montre des résultats représentatifs pour les échantillons contenant E. coli et K. pneumoniae, qui sont fréquemment trouvés dans l'urine des patients atteints d'une infection des voies urinaires. Signaux pour la plupart des capteurs seront faibles et similaires, et ces résultats négatifs peuvent être regroupés comme le signal de fond.

Figure 1
Figure 1. Schéma du test de détection électrochimique. L'électrode d'or est recouvert d'mercaptohexanol et Hexanedithiol et fonctionnalisé par addition d'ADN sondes de capture d'oligonucléotides thiolés (bleu). Sandwich hybridization de l'ARNr 16S cible avec l'oligonucléotide sonde de capture de l'ADN et la sonde de détection oligonucléotide d'ADN marqué à la fluorescéine (rouge), se traduit par un complexe qui est détectée par addition d'anticorps anti-fluorescéine - peroxydase de raifort (HRP) et le substrat TMB. Ampérométrique courant est généré par le cycle d'oxydo-réduction qui résulte de l'oxydation de la TMB par HRP et la réduction de la TMB par des électrons de l'électrode.

Figure 2
Figure 2. . Réseau de capteurs d'identification bactérienne et de monture de puce à chaque capteur dans la matrice se compose de trois électrodes: une électrode centrale de travail, une électrode de référence circonférentielle et une électrode auxiliaire pour la stabilisation du signal. Les électrodes de travail de chaque capteur dans le tableau sont fonctionnalisés avec un panel de sondes de capture spécifiques pour les espèces bactériennes d'intérêt (voir le tableau 3) que nous ll en tant que (eubactérienne) sonde de capture UE qui s'hybride à tous 16S molécules d'ARNr bactériens et un Bröl oligonucléotides «transition» que les fonctions de contrôle positif pour l'étalonnage du signal. Le signal est mesurée en plaçant la matrice dans un lecteur de puce avec les repères de pogo qui interface avec les points de contact de l'électrode de capteur.

Figure 3
Figure 3. Le courant de sortie de courant pendant la mesure ampérométrique. Ampérométrique est mesurée en parallèle pour tous les capteurs 16 de la matrice. La circulation du courant est d'abord extrêmement négative due à l'accumulation de substrat de TMB oxydée avant de connecter le tableau au lecteur de puce et de commencer la mesure. Par la suite, le courant se stabilise rapidement et les capteurs sont enregistrées à 60 sec. Électrodes avec plus courant négatif ont les signaux les plus élevés.

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Figure 4. Serial dix dilution de E. coli afin de déterminer la limite de détection. capteurs ont été testés en double avec dilutions décimales d'une concentration connue de E. coli lysat. Les lectures de signaux observés, tracés par des cercles noirs, ont été utilisés pour prédire une courbe de signal idéalisé. L'écart-type commun à toutes les répétitions et le signal de fond à la concentration cible plus bas ont été utilisés pour calculer la limite de détection (ligne bleue), définie comme 3,29 écarts-types sur fond.

Figure 5
Figure 5. Représentant électrochimiques résultats d'analyses de détection pour Escherichia coli et Klebsiella pneumoniae. E. coli et K. pneumonIAE ont été testés pour leur réactivité avec des paires de sondes décrits dans les tableaux 2 et 3. La réactivité avec la paire de sondes KE distingue K. pneumoniae E. coli. L'oligonucléotide de pontage (Bröl) sert de contrôle positif et étalon interne.

Nom de la sonde Sous-unité ribosomique et Lieu * Séquence
KE Cap 10m 16S 74 5'-S-AGCTCTCTGT
KE Det 11m 16S 63 5'-GCTACCGYTCG-F
EK Cap 15m 23S 1492 5'-AGCCTTGATTTTCCG-S
EK Det 15m 23S 1507 5'-F-TCGTCATCACACCTC
EL Cap 17m 23S 1507 5'-AGCGTTAAAAGGTACCG-S
EL Cap 18m 23S 1507 5'-AGCGTTAADAAGGTACCG-S
EL Det 15m 23S 1492 5'-F-TCGTCATCACACCTC
EB Cap 23m 16S 1275 5'-S-ACTTTATGAGGTCCGCTTGCTCT
EB Det 23m 16S 1252 5'-CGCGAGGTCGCCTTCCTTTGTAT-F
PM Cap 15m 16S 183 5'-S-TTTGGTCCGTAGACA
PM Det 17m 16S 166 5'-TTATGCGGTATTAGCCA-F
PA Cap 11m 16S 453 5'-S-ACTTACTGCCC
PA Det 14m 16S 439 5'-TTCCTCCCAACTTA-F
UE GN Cap 19m 16S 1502 5'-S-GTTCCCCTACGGTTACCTT
UE Det 18m 16S 1484 5'-GTTACGACTTCACCCCAG-F
UE Bröl 37m 5'-CTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAACCGTAGGGGAAC

Tableau 2. ADN sonde oligonucléotidique séquences de paires. Capture des sondes (PAC) sont synthétisés avec des liens thiol (S). Détecteur de sondes (Det) sont synthétisées à la fluorescéine (F) modifications. A noter que les paires de sondes impliquent soit une sonde de 5'-thiolé capture et une sonde de détection 3'-fluorescéine-modifié ou une sonde de capture 3'-thiolé et une sonde de détection 5'-fluorescéine-modifié. Les deux sondes de capture EL sont mélangés avant l'utilisation. Pour simplifier l'analyse, sondes de détection peut être appliqué à chaque capteur en mélange sans réactivité croisée significative. KE - Klebsiella et Enterobacter, EK - E. coli et K. pneumoniae, EL - E. cloacae, EB - entérobactéries famille, PM - P. mirabilis, PA - P. aeruginosa, UE - eubactérienne, Bröl - Combler oligonucléotides. * - Emplacement nombre se réfère à la distance entre le début de la 16S ou 23S gènes.

Espèces bactériennes Paires de sondes réactives
Escherichia coli EK + EB
Klebsiella pneumoniae KE + EK + EB
Proteus mirabilis PM + EB
Pseudomonas aeruginosa PA
Enterobacter KE + EB ou EL + EB ou KE + EL + EB

Tableau 3. Reconnaissance des espèces bactériennes par paires de sondes.

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Discussion

Le test de détection électrochimique décrite ici permet la détection rapide de cibles d'acides nucléiques. La sensibilité et la spécificité dépendent en partie de l'énergie libre de l'hybridation cible-sonde, qui à son tour dépend de la longueur et la teneur en GC de la capture et sondes de détection. Nous effectuons généralement les étapes d'hybridation à température ambiante (~ 20 ° C) 5, 6. Toutefois, les étapes d'hybridation (3.2 et 3.3) peuvent également être effectuées à des températures élevées dans un four à hybridation si la puce est placée dans une chambre couverte contenant un papier filtre humidifié pour éviter l'évaporation 7, 8. Signal optimal est obtenu avec des paires de sondes de capture-détecteur qui s'hybrident à des sites adjacents sur la cible d'acide nucléique, sans un espace entre les sites d'hybridation 8. Cette amélioration du signal est pensé pour travailler par paires de bases d'empilage et en augmentant l'accessibilité de l'hybridation des régions adjacentes, connu comme un effet «aide de la sonde". Problèmes de capture-détecteure hybridation à des sites adjacents est également important parce que la lyse alcaline des résultats bactéries dans fragmentation de la cible ARNr 5. Cette méthode peut être appliquée à la détection d'ARN ou d'ADN cibles, avec une grande variété d'applications cliniques et de recherche. Par exemple, il devrait être possible d'utiliser cette méthode pour étudier les fonctions cellulaires qui sont réglementés par petits ARN ou de détecter des cibles de gènes de résistance aux antibiotiques soit comme l'ADN ou l'ARNm. Pré-amplification peut être nécessaire pour détecter des cibles présentes au nombre de copies faibles. En outre, les inhibiteurs de RNAse devraient être ajoutées au cours de la préparation des échantillons pour prévenir la dégradation des ARN cibles potentiellement instables.

Cette méthode a plusieurs avantages par rapport à d'autres méthodes de détection et d'identification des bactéries. Méthodes de microbiologie clinique standard nécessitent la croissance bactérienne sur gélose pour la quantification et l'application de méthodes d'identification. La croissance des bactéries aux colonies visibles implique généralementune nuit d'incubation, ce qui retarde considérablement le temps de prélèvement d'échantillons pour la présentation des résultats. Il ya un grand intérêt dans le développement de méthodes plus rapides et moléculaires de détection des agents pathogènes, y compris les biocapteurs électrochimiques 9. Cependant, peu d'attention a été accordée à la performance des biocapteurs d'ADN dans des échantillons biologiques premières. Le test de détection électrochimique décrit ici peut être effectuée directement sur ​​des échantillons de sérum et l'urine sans perte significative de sensibilité 7. L'utilisation de sondes de capture thiolés et la monocouche mixte décrite ici rend la surface du capteur résistant à l'absorption de protéines non spécifiques, tout en conservant la sensibilité de spécimens biologiques premières, notamment du sérum ou de l'urine 10. Aussi peu que 1 cellule bactérienne par capteur (250 bactéries par millilitre) sont détectables, ce qui est comparable à la sensibilité des techniques d'amplification PCR 1. Plusieurs méthodes d'identification bactérienne basées sur la PCR ont été décrites 11, 12. Bien que la PCR peut détecter potentiellement moins de molécules cibles que le test de détection électrochimique décrit ici, les méthodes basées sur la PCR ont atteint adoption limitée en raison de l'acquisition d'équipements de haute et / ou les coûts de réactifs, par rapport aux méthodes de microbiologie clinique standard. En revanche, les capteurs électrochimiques sont relativement peu coûteux à produire. Même si les électrodes sont fabriquées par pulvérisation cathodique d'or, la quantité d'or par puce est faible parce que l'épaisseur de l'électrode se trouve à 1000 angströms.

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Disclosures

Tous les auteurs sont des inventeurs sur les brevets se rapportant aux méthodes décrites. Un de ces brevets a été autorisé à Qvella Corporation. BMC et DAH ont participation dans Qvella Corporation. VG est le président de GeneFluidics, qui est le fabricant de la puce de réseau de capteurs électrochimiques, montage puce et lecteur de puce décrit dans cet article.

Acknowledgments

Cette étude a été soutenue par l'accord de coopération Award AI075565 (à DAH) de l'Institut national des allergies et des maladies infectieuses et par le Fonds Wendy et Ruby Ken pour l'excellence en urologie pédiatrique recherche. BMC est le Judith et président Robert Winston en urologie pédiatrique.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-mercapto-1-hexanol (MCH) Sigma 451088 Store at room temperature
1,6-hexanedithiol (HDT) Sigma H-12005 Store at room temperature
Thiolated capture probes Operon N/A Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C
Fluorescein-modified detector probes Operon N/A Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C
Bridging Oligonucleotide Operon N/A Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C
Anti-Fluorescein-HRP, Fab fragments Roche 11 426 346 910 Store at 4 °C
Helios Chip Reader GeneFluidics GFR-2009
Sensor Chip Mount GeneFluidics GFR-003
Film well sticker GeneFluidics Shipped with sensor chips
Bare gold 16-sensor array chips GeneFluidics SC1000-16X-B Store in 100% N2 at room temperature
Bovine Serum Albumin Sigma A7906 Store at 4 °C
1M Phosphate Buffer, pH 7.2 0.35M NaH2PO4, 0.65M K2HPO4, adjusted to pH 7.2
Blocker Casein in PBS Pierce 37528 Dilute with an equal volume of 1M Phosphate Buffer, pH 7.2, store at 4 °C
Table 1. Reagents and Equipment.

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References

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Halford, C., Gau, V., Churchill, B.More

Halford, C., Gau, V., Churchill, B. M., Haake, D. A. Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors. J. Vis. Exp. (74), e4282, doi:10.3791/4282 (2013).

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