Summary
אנו מתארים שיטת assay חיישן אלקטרוכימי לגילוי חיידקים מהיר והזדהות. Assay כרוך מערך חיישנים פונקציונליות עם בדיקות ללכוד oligonucleotide DNA ל( rRNA) רצפי מינים ספציפיים ריבוזומלי RNA. הכלאה כריך של rRNA היעד עם הבדיקה ללכוד ובדיקת גלאי דנ"א oligonucleotide peroxidase צמודת חזרת מייצרת נוכחית amperometric למדידה.
Abstract
חיישנים אלקטרוכימיים נמצאים בשימוש נרחב למדידה מהירה ומדויקת של רמת סוכר בדם, ויכולים להיות מותאם לזיהוי של מגוון רחב של analytes. חיישנים אלקטרוכימיים לפעול על ידי transducing אירוע הוקרה ביולוגי לאות חשמלי שימושי. התמרה אות מתרחשת על ידי צימוד הפעילות של אנזים חיזור לאלקטרודה amperometric. הספציפיות חיישן היא גם מאפיין מהותי של האנזים, גלוקוז אוקסידאז במקרה של חיישן גלוקוז, או תוצר של קשר בין האנזים ונוגדן או הבדיקה.
כאן, אנו מתארים שיטת assay חיישן אלקטרוכימי כדי לזהות באופן ישיר ולזהות חיידקים. בכל מקרה, הבדיקות שתוארו כאן הן oligonucleotides DNA. שיטה זו מבוססת על הכלאה כריך של בדיקות ללכוד וגלאי עם היעד RNA ריבוזומלי (rRNA). הבדיקה ללכוד מעוגנת למשטח החיישן, ואילו הבדיקה הגלאי קשורה לשעותperoxidase orseradish (HRP). כאשר מצע כגון 3,3 ", 5,5"-tetramethylbenzidine (TMB) הוא הוסיף לאלקטרודה עם מתחמים ללכוד יעד גלאים מאוגדים פני השטח שלו, המצע הוא חמצון על ידי HRP ומופחת על ידי אלקטרודה לעבוד. תוצאות מחזור חיזור זה בדילוגים של אלקטרונים על ידי המצע מהאלקטרודה לHRP, ייצור זרימת זרם באלקטרודה.
Introduction
שימוש rRNA כמולקולת מטרה לאיתור וזיהוי חיידקים יש מספר היתרונות. השפע של rRNA בתאי חיידקים מספק לגבול רגישות נמוך כמו 250 חיידקים למ"ל, ללא צורך בהגברת 1 היעד. rRNA חיידקים מכיל רצפי מינים ספציפיים ייחודיים כי הם נגישים להכלאה עם בדיקות ה-DNA. כתוצאה מכך, מערך של חיישני אלקטרו יכול לשמש כדי לזהות חיידקים לא ידועים, שבו כל חיישן פונקציונלי עם בדיקה ללכוד מינים ספציפיים שונה. חיישני בקרה חיוביים צריכים להיכלל ליעד oligonucleotide סינטטי ש" גשרים "ללכוד ובדיקות גלאים ליצור אות כיול פנימית.
יש חיישנים אלקטרוכימיים מגוון רחב של יישומי מחקר בסיסיים ותרגומים. לדוגמה, assay מתואר כאן נעשה שימוש כדי למדוד את ההשפעה של א 'דווקא שלב צמיחת חיידק בRRNלהעתיק מספרים מראש rRNA ו, שהוא עניין רב לחוקרים המעוניינים בחיידקי פיזיולוגיה 2. הרגישות של assay חיישן אלקטרוכימי נקבעת על ידי יחס האות לרעש. מגוון רחב של שיטות והגברת אות להפחתת רעש נחקר. אנו מוצאים כי שיפור הכימיה של פני השטח החיישן הוא מפתח לצמצום כריכה ספציפי של בדיקה ו / או אנזים HRP גלאי. בפרט, monolayer מעורבת של alkanedithiols וmercaptohexanol כבר מצא להפחית את הרקע על ידי כיסוי פני האלקטרודה יותר לחלוטין תוך שמירה על הנגישות של הבדיקה ללכוד להכלאת היעד 3. טיפולי כימיה של פני שטח אלה חשובים במיוחד עבור מבחני הכוללים דגימות ביולוגיות מורכבות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Functionalization של חיישנים אלקטרוכימיים
- הכן את הבדיקה ללכוד thiolated בריכוז של 0.05 מיקרומטר ב300 מיקרומטר 1,6-hexanedithiol (HDT), 10 מ"מ טריס-HCl, pH 8.0, 0.3 M NaCl, 1 mM EDTA ו דגירה בחושך בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות . דגירה של הבדיקה ללכוד thiolated עם HDT מבטיחה כי קבוצת תיאול על הבדיקה ללכוד מצטמצמת, וכתוצאה מכך תוצאות יותר עקביות.
- החל זרם של חנקן עד 16 שבב מערך החשוף זהב חיישן (ים) למשך 5 שניות כדי להסיר את הלחות ו / או חלקיקים.
- החל 6 μl של תמהיל הבדיקה ללכוד HDT-thiolated להאלקטרודה העבודה של כל 16 החיישנים של מערך החיישנים ולאחסן את שבב החיישן (ים) בצלחת פטרי מכוסה על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. בדיקות ללכוד thiolated להיקשר ישירות לאלקטרודה הזהב החשופה וHDT פועל למניעת overpacking של הבדיקות ללכוד ולשמור אותם בקונפורמציה מורחבת שמקדמת הכלאה עם היעד.
- לאחר היום, לשטוף עם שבב חיישן deionized H 2 O במשך 2-3 שניות ויבשות תחת זרם של חנקן למשך 5 שניות.
- החל 6 μl של 10 מ"מ טריס-HCl, pH 8.0, 0.3 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 מ"מ 6 mercapto-1-hexanol (MCH) לאלקטרודה העבודה של כל 16 החיישנים ו דגירה במשך 50 דקות. זה ובכל incubations שבב החיישן הבאים מבוצעים בצלחת פטרי מכוסה בטמפרטורת חדר. MCH פועל כסוכן חסימה, מילוי בכל פערים שבו הבדיקה ללכוד thiolated או HDT לא קיימת על פני השטח האלקטרודה.
2. לדוגמא הכנה
- העבר 1 מ"ל של תרבות חיידקים בשלב היומן של צמיחה (OD 600 ≈ 0.1) לצינור microcentrifuge צנטריפוגות ב XG 16,000 למשך 5 דקות. הסר את supernatant התרבות. יכולה להיות מעובד גלולה החיידקים באופן מיידי או מאוחסנת ב -80 ° C לשימוש מאוחר יותר.
- יסודיות resuspend גלולה חיידקים ב10 μl של 1 M NaOH על ידי יישום קצה פיפטה לבוטטום של צינור microcentrifuge וpipetting מעלה ומטה מספר פעמים. דגירה ההשעיה בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות.
- לנטרל את lysate החיידקים על ידי הוספה של 50 μl 1 חיץ פוספט ', pH 7.2, המכיל 2.5% מ"מ סרום אלבומין (BSA) ושור של 0.25 בדיקה גלאי העמסה-שונה. דגירה lysate נוטרל למשך 10 דקות בטמפרטורת חדר. בדיקות גלאי העמסה-modified להכליא עם מולקולות מטרת rRNA חיידקיים.
3. Assay חיישן אלקטרוכימי
- שטוף MCH משבב החיישן עם deionized H 2 O עבור 2-3 שניות ויבשות תחת זרם של חנקן למשך 5 שניות.
- החל 4 μl של lysate חיידקים נטרל את האלקטרודה לעבודה של כל אחד מחיישני 14 ו דגירה במשך 15 דקות. מתחמי בדיקה יעד גלאים להכליא לבדיקות ללכוד thiolated משותק.
- החל 4 μl של 1 ננומטר גישור oligonucleotide ב1 חיץ פוספט ', pH 7.2, המכיל BSA 2.5% ו 0.25 μ בדיקה גלאי העמסה-modified M ל2 חיישני בקרה חיוביות (ששמש לנורמליזציה אות) ו דגירה במשך 15 דקות.
- שטוף את שבב החיישן עם deionized H 2 O במשך 2-3 שניות ויבשות תחת זרם של חנקן למשך 5 שניות.
- החל 4 μl של 0.5 U / מ"ל אנטי העמסה-HRP ב1 חיץ פוספט ', pH 7.2, המכיל 0.5% קזאין להאלקטרודה העבודה של כל 16 החיישנים ודגירה במשך 15 דקות. אנטי ההעמסה-HRP נקשר לבדיקות גלאי העמסה-שונה המשותקות.
- שטוף את שבב החיישן עם deionized H 2 O במשך 2-3 שניות ויבשות תחת זרם של חנקן למשך 5 שניות.
- החל סרט גם מדבקה על פני השטח של השבב וחיישן העומס לתוך הר שבב החיישן. פיפטה μl 50 של מצע TMB על כל 16 החיישנים ולסגור את הר שבב החיישן.
- השג amperometry ומדידות Voltammetry מחזורי לכל 16 חיישני שימוש בקורא צ'יפ הליוס. Amperometric הנוכחי הוא פרופורציונלי לשיעור של TMB Reduction על משטח החיישן (ראה איור 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אנו מתארים assay אלקטרוכימי שבנוי באופן דומה לכריך ELISA. כפי שניתן לראות בתרשים 1, יעד ההכלאה ריבוזומלי רנ"א (rRNA) עם בדיקות ללכוד וגלאי שפותחה על ידי תגובת חיזור catalyzed ידי HRP מצומדת לברי נוגדן אנטי העמסה אשר נקלטות על ידי העמסת הצמדה '3 בבדיקת הגלאי. מרכיב חשוב של רגישות assay הוא הכימיה של פני השטח של האלקטרודה הזהב. מצאנו כי monolayer משולשת המורכב מבדיקות thiolated ללכוד, mercaptohexanol וhexanedithiol משפרת את יחס אות לרעש באופן משמעותי על ידי הפחתת רקע ספציפי מחייב של חלבון הכתב 3. מבחני מתוארים כאן מעסיקים 16 שבב מערך חיישני GeneFluidics שמוצג באיור 2. כל אחד מהחיישנים במערך מכיל שלוש אלקטרודות, עבודה, התייחסות, ועזר, שבו יש נקודות מגע בקצה של 4 השבב. השבב לקרואיש ER סיכות פוגו שמתחברות עם כל אחד מהנקודות המגע. קורא השבב משמש כממשק למערך החיישנים עם פוטנציומטר נשלט על ידי אלגוריתם מחשב.
דוגמאות לזרימת זרם חיישן אלקטרוכימי מוצגות באיור 3. זרימת זרם בחיישנים היא גבוהה באופן מלאכותי במהלך השניות הראשונות לאחר מדידות amperometric להתחיל בגלל ההצטברות של מצע מתחמצן במהלך הזמן מיישום של TMB אל פני השטח החיישן לייזום אלגוריתם הקורא. זרימה נוכחית מגיעה במהירות למצב יציב ואמינה ניתן לקבל קריאות חיישן מדויקות בתוך שישים שניות. מבחני חיישן מבוצעים בדרך כלל בשני עותקים כבקרה פנימית לשונות חיישן. מצאנו כי שונות חיישן לחיישן היא קבועה יחסית, כך שניתן לבצע 16 מבחני חיישנים שונים במקביל על מערך שבבי GeneFluidics 16-חיישן. בקרות חיוביות ושליליות הן אסןTial. כביקורת חיובית, אנו כוללים oligonucleotide סינטטי "גישור" ה-DNA שhybridizes הן ללכידה ובדיקות גלאים ומשמש כמטרה סינטטי של ריכוז ידוע. בדרך זו, תוצאות שהושגו תוך שימוש בפונקציות oligonucleotide הגישור כבקרה פנימית כיול כדי למזער את הווריאציה שבב לשבב.
כאשר בודקים ללכוד ובדיקות גלאים, גבול הגילוי צריך להיקבע על ידי דילול סידורי של מדגם של ריכוז ידוע. כפי שניתן לראות באיור 4, קיים מתאם יומן יומן לינארי בין ריכוז מדגם ופלט אות על פני הטווח הדינמי של assay. המגבלה של גילוי מוגדר כריכוז של היעד הנדרש כדי לייצר אות שהיא 3.29 סטיות תקן גבוה יותר מהממוצע של אותות רקע 5. לצורך זיהוי של חיידקים במדגם לא ידוע, פנל של לכידה רלוונטית וזוגות בדיקה גלאים נבחרו. הבחירה של בדיקות אניים נקבע על ידי הסוגים של חיידקים שנחשדו בסוג מסוים של מדגם. כמובן, יכולים להיות מדי פעם מצאו חיידקים יוצא דופן בכל מדגם, ולכן אנו ממליצים כי זוג חללית eubacterial להיכלל שיש לו את היכולת להכליא לאזורים משומרים rRNA של כל חיידקים. איור 5 מציג תוצאות נציג לדגימות המכילות א coli ו ק דלקת ריאות, הנמצאים לעתים קרובות בשתן של חולים עם זיהום בדרך שתן. אותות עבור רוב החיישנים יהיו נמוכים ודומה, וניתן נקוו תוצאות שליליות אלה כאות רקע.
איור 1. תרשים סכמטי של assay חיישן אלקטרוכימי. האלקטרודה מצופה בזהב וmercaptohexanol hexanedithiol ופונקציונלי על ידי תוספת של בדיקות ללכוד oligonucleotide DNA thiolated (כחול). כריך שעותybridization של rRNA 16S היעד עם הבדיקה ללכוד oligonucleotide דנ"א ובדיקת גלאי דנ"א oligonucleotide העמסה שכותרתו (אדום), תוצאות מורכבות שהוא זוהה על ידי תוספת של אנטי - והעמסת peroxidase חזרת (HRP) המצומד ומצע TMB. נוכחי Amperometric מופק על ידי מחזור חיזור הנובע מחמצון של TMB ידי HRP וההפחתה של TMB ידי אלקטרונים מן האלקטרודה.
איור 2. . מערך חיידקי זיהוי חיישן והר שבב כל חיישן במערך מורכב משלוש אלקטרודות: אלקטרודה מרכזית עובד, אלקטרודת ייחוס היקפית ואלקטרודת עזר לייצוב אות. האלקטרודות העבודה של כל חיישן במערך הן פונקציונליות עם פנל של בדיקות ללכוד ספציפי למיני חיידקים של עניין (ראה טבלה 3) כפי שאנו LL כחללית איחוד אירופי (eubacterial) לכידה שhybridizes לכל מולקולות rRNA 16S החיידקים וoligonucleotide "גישור" BrOl שמתפקד כביקורת חיובית לכיול אות. אות נמדדת על ידי הצבת המערך בקורא שבבים עם סיכות פוגו שממשק עם הנקודות מגע אלקטרודה החיישן.
איור 3. התפוקה נוכחית Amperometric במהלך מדידה. נוכחי Amperometric נמדד במקביל לכל 16 החיישנים במערך. זרימת זרם בתחילה היא שלילית ביותר בשל הצטברות של מצע TMB מתחמצן לפני חיבור המערך לקורא השבבים והחל מדידה. לאחר מכן, נוכחי מייצב במהירות ובקריאות חיישן נרשמות ב 60 שניות. אלקטרודות עם זרם שלילי גדול יותר יש את האותות הגבוהים ביותר.
"איור 4" src = "/ files/ftp_upload/4282/4282fig4.jpg" />
איור 4. פי עשרה דילול סדרתי של א ' coli כדי לקבוע את הגבול של זיהוי. חיישנים נבדקו בשני עותקים עם סידורים פי עשרה דילולים של ריכוז ידוע של ע ' coli lysate. קריאות האותות שנצפו, זממו כעיגולים שחורים, ששימשו לחיזוי עקום אות אידיאלית. סטיית התקן ונקווה לכל משכפל ואות הרקע בריכוז הנמוך ביותר הייתה היעד המשמשת לחישוב המגבלה של זיהוי (קו כחול), שהוגדר כ3.29 סטיות תקן מעל הרקע.
איור 5. תוצאות assay חיישנים אלקטרוכימיים נציג לחיידקי Escherichia וKlebsiella pneumoniae. E. coli ו ק pneumonIAE נבדק לתגובתיות עם זוגות בדיקה מתוארים בלוחות 2 ו -3. תגובתיות עם זוג חללית KE מבדילה ק דלקת ריאות מE. coli. גישור oligonucleotide (BrOl) משמש כביקורת חיובית וסטנדרטי כיול פנימי.
| שם בדיקה | מקטע ריבוזומלי ומיקום * | רצף |
| KE שווי 10m | 16S 74 | 5'-S-AGCTCTCTGT |
| KE Det 11m | 16S 63 | 5'-GCTACCGYTCG-F |
| EK שווי 15m | 23S 1492 | 5'-AGCCTTGATTTTCCG-S |
| EK Det 15m | 23S 1507 | 5'-F-TCGTCATCACACCTC |
| EL Cap 17m | 23S 1507 | 5'-AGCGTTAAAAGGTACCG-S |
| EL Cap 18m | 23S 1507 | 5'-AGCGTTAADAAGGTACCG-S |
| EL Det 15m | 23S 1492 | 5'-F-TCGTCATCACACCTC |
| EB שווי 23m | 16S 1275 | 5'-S-ACTTTATGAGGTCCGCTTGCTCT |
| EB Det 23m | 16S 1252 | 5'-CGCGAGGTCGCCTTCCTTTGTAT-F |
| PM פקק 15m | 16S 183 | 5'-S-TTTGGTCCGTAGACA |
| PM Det 17m | 16S 166 | 5'-TTATGCGGTATTAGCCA-F |
| רשות פקק 11m | 16S 453 | 5'-S-ACTTACTGCCC |
| רשות Det 14m | 439 16S | 5'-TTCCTCCCAACTTA-F |
| האיחוד האירופי GN פקק 19m | 16S 1502 | 5'-S-GTTCCCCTACGGTTACCTT |
| האיחוד האירופי Det 18m | 16S 1484 | 5'-GTTACGACTTCACCCCAG-F |
| האיחוד האירופי BrOl 37m | 5'-CTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAACCGTAGGGGAAC |
טבלת 2. רצפי DNA oligonucleotide Probe זוג. לכידה (CAP) בדיקות מסונתזים עם קשרי תיאול (S). גלאי (דט) בדיקות מסונתזים עם העמסה (F) שינויים. שים לב שבדיקה כרוך בזוגות או בדיקה 5'-thiolated לכידה ובדיקת גלאי 3'-העמסה-modified או בדיקה ללכוד 3'-thiolated ובדיקת גלאי 5'-העמסה-שונה. שתי הבדיקות ללכוד EL מעורבבות לפני השימוש. כדי לפשט את assay, יכולות להיות מיושמות בדיקות גלאים לכל חיישן כתערובת ללא תגובה הצולבת משמעותי. KE - Klebsiella וEnterobacter, EK - E.coli וק דלקת ריאות, EL - א ' cloacae, EB - Enterobacteriaceae המשפחה, אחר הצהריים - פ מיראביליס, הרשות הפלסטינית - פ aeruginosa, איחוד אירופי - oligonucleotide גישור - Eubacterial, BrOl. * - מיקום nהענבר מתייחס למרחק מההתחלה של 16S או גן 23S.
| מינים חיידקים | צמדי Probe תגובתי |
| Escherichia coli | EK + EB |
| Klebsiella pneumoniae | KE + + EK EB |
| פרוטאוס מיראביליס | PM + EB |
| Pseudomonas aeruginosa | הרשות הפלסטינית |
| מיני Enterobacter | KE + EB או EL + EB או KE + + EL EB |
לוח 3. הכרה במיני חיידקים על ידי צמדי בדיקה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Assay חיישן אלקטרוכימי המתואר כאן מאפשר זיהוי מהיר של מטרות חומצות גרעין. רגישות וסגוליות תלויים בחלקו על האנרגיה החופשית של הכלאה יעד חללית, אשר בתורו תלוי באורך ותוכן GC של הלכידה ובדיקות גלאים. אנחנו בדרך כלל לבצע את פעולות ההכלאה בטמפרטורת הסביבה (~ 20 מעלות צלזיוס) 5, 6. עם זאת, צעדי ההכלאה (3.2 ו -3.3) יכולים גם להתבצע בטמפרטורות גבוהות יותר בתנור הכלאה אם השבב ממוקם בתא מכוסה המכיל טבולה נייר סינון כדי למנוע אידוי 7, 8. אות אופטימלית מתקבלת עם זוגות בדיקה ללכוד-גלאים שלהכליא לאתרים סמוכים ביעד חומצות הגרעין ללא פער בין אתרי ההכלאה 8. הוא חשב שיפור אות זה לעבודה בבסיס זוג לערום ועל ידי הגדלת נגישות הכלאה של אזורים סמוכים, המכונה אפקט "עוזר של בדיקה". prob לכידת גלאיהכלאה דואר לאתרים סמוכים חשובה גם בגלל תמוגה בסיסית של תוצאות החיידקים בפיצול של יעד rRNA 5. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על זיהוי של מטרות או RNA או DNA, עם מגוון רחב של יישומים קליניים ומחקר. לדוגמה זה צריך להיות אפשרי להשתמש בשיטה זו כדי ללמוד פונקציות סלולריות שמוסדרות על ידי RNA הקטן או כדי לזהות מטרות גן עמידות לאנטיביוטיקה או כמו גם ה-DNA או ה-mRNA. טרום amplication עשויה להיות נחוץ כדי לזהות מטרות בהווה בלהעתיק מספרים נמוכים. בנוסף לכך, יש להוסיף מעכבי RNAse במהלך הכנת מדגם כדי למנוע השפלה של מטרות פוטנציאליות RNA לא יציבים.
לשיטה זו מספר יתרונות על פני שיטות אחרות של איתור וזיהוי חיידקים. שיטות מיקרוביולוגיה קליניות רגילות דורשות התפתחות חיידקים על מצע אגר לquantitation ויישום של שיטות זיהוי. צמיחה של חיידקים למושבות גלויות כרוכה בדרך כללדגירה הלילה, לעכב באופן משמעותי את משך הזמן מאיסוף דגימה לדיווח של תוצאות. יש עניין רב בפיתוח שיטות מהירות יותר, זיהוי מולקולרית של הפתוגן, כולל אלקטרוכימי biosensors 9. עם זאת, מעט מאוד תשומת הלב ניתנה לביצועים של biosensors DNA בדגימות ביולוגיות גלם. Assay חיישן אלקטרוכימי מתואר כאן יכול להתבצע ישירות על דגימות סרום ושתן ללא אובדן משמעותי של רגישות 7. השימוש בבדיקות ללכוד thiolated וmonolayer המעורבת המתוארת כאן הופך את משטח החיישן עמיד בפני ספיגת חלבון אינו ספציפית, שמירה על רגישות בדגימות ביולוגיות גלם כולל סרום או בשתן 10. כמה כמו 1 תא חיידק לחיישן (250 חיידקים למ"ל) הם לזיהוי, אשר ניתן להשוות את הרגישות של ה-PCR טכניקות 1 הגברה. שיטות זיהוי חיידקים כמה PCR מבוססות כבר תאר 11, 12. למרות PCR עלול לזהות מולקולות המטרה פחות מ assay חיישן אלקטרוכימי שתואר כאן, שיטות המבוססות על PCR השיגו אימוץ מוגבל בגלל רכישת ציוד הגבוהה ו / או עלויות מגיב, יחסית לשיטות מיקרוביולוגיה קליניות סטנדרטיות. בניגוד לכך, חיישנים אלקטרוכימיים הם זולים יחסית לייצר. על אף שמיוצרות על ידי אלקטרודות זהב המקרטעת, כמות הזהב לשבב היא נמוכה בגלל עובי האלקטרודה הוא רק 1,000 אנגסטרם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
כל הכותבים הם ממציאים על פטנטים הנוגעים לשיטות שתוארו. אחד מהפטנטים האלה כבר רישיון לתאגיד Qvella. BMC ו DAH יש עניין בהון תאגיד Qvella. VG הוא נשיא GeneFluidics, שהנו היצרנית של שבבי מערך חיישני אלקטרו, הר שבב, וקורא שבבים המתואר במאמר זה.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על הסכם שיתוף פעולה AI075565 פרס (לDAH) מהמכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות על ידי ועל ידי ונדי וקרן קן רובי למצוינות במחקר אורולוגיה ילדים. BMC היא יהודית ויו"ר רוברט וינסטון באורולוגיה ילדים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-mercapto-1-hexanol (MCH) | Sigma | 451088 | Store at room temperature |
| 1,6-hexanedithiol (HDT) | Sigma | H-12005 | Store at room temperature |
| Thiolated capture probes | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
| Fluorescein-modified detector probes | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
| Bridging Oligonucleotide | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
| Anti-Fluorescein-HRP, Fab fragments | Roche | 11 426 346 910 | Store at 4 °C |
| Helios Chip Reader | GeneFluidics | GFR-2009 | |
| Sensor Chip Mount | GeneFluidics | GFR-003 | |
| Film well sticker | GeneFluidics | Shipped with sensor chips | |
| Bare gold 16-sensor array chips | GeneFluidics | SC1000-16X-B | Store in 100% N2 at room temperature |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | Store at 4 °C |
| 1M Phosphate Buffer, pH 7.2 | 0.35M NaH2PO4, 0.65M K2HPO4, adjusted to pH 7.2 | ||
| Blocker Casein in PBS | Pierce | 37528 | Dilute with an equal volume of 1M Phosphate Buffer, pH 7.2, store at 4 °C |
| Table 1. Reagents and Equipment. | |||
References
- Wu, J., Campuzano, S., Halford, C., Haake, D. A., Wang, J. Ternary Surface Monolayers for Ultrasensitive (Zeptomole) Amperometric Detection of Nucleic Acid Hybridization without Signal Amplification. Anal. Chem. 82, 8830-8837 (2010).
- Halford, C., et al. Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing by Sensitive Detection of Precursor Ribosomal RNA Using a Novel Electrochemical Biosensing Platform. Antimicrob. Agents Chemother. 56, In Press (2012).
- Campuzano, S., et al. Ternary monolayers as DNA recognition interfaces for direct and sensitive electrochemical detection in untreated clinical samples. Biosens. Bioelectron. 26, 3577-3584 (2011).
- Gau, V., et al. Electrochemical molecular analysis without nucleic acid amplification. Methods. 37, 73-83 (2005).
- Patel, M., et al. Target Specific Capture Enhances Sensitivity of Electrochemical Detection of Bacterial Pathogens. J. Clin. Microbiol. 49, 4293-4296 (2011).
- Mastali, M., et al. Optimal probe length and target location for electrochemical detection of selected uropathogens at ambient temperature. J. Clin. Microbiol. 46, 2707-2716 (2008).
- Liao, J. C., et al. Use of electrochemical DNA biosensors for rapid molecular identification of uropathogens in clinical urine specimens. J. Clin. Microbiol. 44, 561-570 (2006).
- Liao, J. C., et al. Development of an advanced electrochemical DNA biosensor for bacterial pathogen detection. J. Mol. Diagn. 9, 158-168 (2007).
- Pedrero, M., Campuzano, S., Pingarron, J. M. Electroanalytical sensors and devices for multiplexed detection of foodborne pathogen microorganisms. Sensors (Basel). 9, 5503-5520 (2009).
- Kuralay, F., Campuzano, S., Haake, D. A., Wang, J. Highly sensitive disposable nucleic acid biosensors for direct bioelectronic detection in raw biological samples. Talanta. 85, 1330-1337 (2011).
- Ecker, D. J., et al. Ibis T5000: a universal biosensor approach for microbiology. Nat. Rev. Microbiol. 6, 553-558 (2008).
- Casalta, J. P., et al. Evaluation of the LightCycler SeptiFast test in the rapid etiologic diagnostic of infectious endocarditis. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 28, 569-573 (2009).
