Summary
हम तेजी से बैक्टीरिया का पता लगाने और पहचान के लिए एक विद्युत सेंसर परख विधि का वर्णन है. परख ribosomal शाही सेना (rRNA) प्रजाति विशेष दृश्यों के लिए डीएनए oligonucleotide कब्जा जांच के साथ क्रियाशील एक संवेदक सरणी शामिल है. कब्जा जांच और एक हॉर्सरैडिश peroxidase से जुड़ी डीएनए oligonucleotide डिटेक्टर जांच के साथ लक्ष्य rRNA की सैंडविच संकरण एक औसत दर्जे का amperometric वर्तमान उत्पादन करता है.
Abstract
विद्युत सेंसर व्यापक रूप से रक्त शर्करा का तेजी से और सही माप के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं और analytes की एक विस्तृत विविधता का पता लगाने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. विद्युत सेंसर एक उपयोगी बिजली के संकेत में एक जैविक मान्यता घटना transducing द्वारा संचालित. संकेत पारगमन एक amperometric इलेक्ट्रोड के लिए एक redox एंजाइम की गतिविधि युग्मन के द्वारा होता है. सेंसर विशिष्टता एक अंतर्निहित एंजाइम की विशेषता, एक ग्लूकोज सेंसर के मामले में ग्लूकोज oxidase, या एंजाइम और एक एंटीबॉडी या जांच के बीच संबंध का एक उत्पाद या तो है.
यहाँ, हम सीधे पता लगाने और बैक्टीरिया की पहचान करने के लिए एक विद्युत सेंसर परख विधि का वर्णन है. हर मामले में, यहाँ वर्णित जांच डीएनए oligonucleotides हैं. इस पद्धति का लक्ष्य ribosomal शाही सेना (rRNA) के साथ पकड़ने और डिटेक्टर जांच के सैंडविच संकरण पर आधारित है. डिटेक्टर जांच ज से जुड़ा हुआ है, जबकि कब्जा जांच, सेंसर सतह पर लंगर डाले हैorseradish peroxidase (एचआरपी). ऐसे 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) के रूप में एक सब्सट्रेट इसकी सतह के लिए बाध्य कब्जा लक्ष्य डिटेक्टर परिसरों के साथ एक इलेक्ट्रोड के लिए जोड़ा जाता है, सब्सट्रेट एचआरपी द्वारा ऑक्सीकरण और काम कर इलेक्ट्रोड से कम है. इलेक्ट्रोड में वर्तमान प्रवाह उत्पादन, इलेक्ट्रोड से एचआरपी के लिए सब्सट्रेट द्वारा इलेक्ट्रॉनों के चक्कर में यह रेडोक्स चक्र का परिणाम है.
Introduction
बैक्टीरिया का पता लगाने और पहचान के लिए एक लक्ष्य अणु के रूप में rRNA का उपयोग कर लाभ का एक नंबर है. बैक्टीरियल कोशिकाओं में rRNA की बहुतायत लक्ष्य प्रवर्धन 1 के लिए आवश्यकता के बिना मिली लीटर प्रति 250 बैक्टीरिया के रूप में कम के रूप में एक संवेदनशीलता सीमा का प्रावधान है. बैक्टीरियल rRNA डीएनए जांच के साथ संकरण करने के लिए पहुंच रहे हैं कि अद्वितीय प्रजाति विशेष दृश्यों में शामिल है. नतीजतन, विद्युत सेंसर की एक सरणी के प्रत्येक संवेदक एक अलग प्रजाति विशेष कब्जा जांच के साथ क्रियाशील है जहां अज्ञात बैक्टीरिया की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. सकारात्मक नियंत्रण सेंसर "पुल" पर कब्जा और डिटेक्टर जांच एक आंतरिक अंशांकन संकेत बनाने के लिए एक कृत्रिम oligonucleotide लक्ष्य के लिए शामिल किया जाना चाहिए.
विद्युत सेंसर बुनियादी और translational अनुसंधान आवेदनों की एक विस्तृत श्रृंखला है. उदाहरण के लिए, परख ठीक ई. के प्रभाव को मापने के लिए यहाँ वर्णित इस्तेमाल किया गया है rRN पर कोलाई विकास के चरणबैक्टीरियल फिजियोलॉजी 2 में रुचि शोधकर्ताओं के लिए महान ब्याज की है जो एक और पूर्व rRNA प्रतिलिपि संख्या,. विद्युत सेंसर परख की संवेदनशीलता शोर अनुपात करने के लिए संकेत द्वारा निर्धारित किया जाता है. संकेत प्रवर्धन और शोर कम करने के तरीकों की एक किस्म का पता लगाया गया है. हम सेंसर सतह के रसायन शास्त्र में सुधार डिटेक्टर जांच और / या एचआरपी एंजाइम की अविशिष्ट बंधन को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है कि लगता है. विशेष रूप से, alkanedithiols और mercaptohexanol की एक मिश्रित monolayer के लक्ष्य संकरण 3 के लिए कब्जा जांच की पहुंच बनाए रखते हुए और पूरी तरह से इलेक्ट्रोड सतह को कवर द्वारा पृष्ठभूमि कम पाया गया है. ये रसायन शास्त्र की सतह उपचार जटिल जैविक नमूनों को शामिल assays के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण हैं.
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Protocol
1. विद्युत सेंसर की functionalization
- 300 माइक्रोन में 0.05 माइक्रोन की एकाग्रता में thiolated कब्जा जांच को तैयार 1,6-hexanedithiol (HDT), 10 मिमी Tris-एचसीएल, पीएच 8.0, 0.3 एम NaCl, 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर अंधेरे में 1 मिमी EDTA और सेते . HDT साथ thiolated कब्जा जांच की ऊष्मायन अधिक अनुरूप परिणाम है, जिसके परिणामस्वरूप कब्जा जांच पर thiol समूह कम है कि यह सुनिश्चित करता है.
- नमी और / या कण निकालने के लिए 5 सेकंड के लिए नंगे सोना 16 संवेदक सरणी चिप (ओं) को नाइट्रोजन की एक धारा को लागू करें.
- संवेदक सरणी के सभी 16 सेंसर का काम कर इलेक्ट्रोड को HDT-thiolated कब्जा जांच मिश्रण के 6 μl लागू करें और 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर एक कवर पेट्री डिश में सेंसर चिप (एस) की दुकान. Thiolated कब्जा जांच नंगे सोने इलेक्ट्रोड को सीधे बाँध और HDT कब्जा जांच की overpacking रोकने और लक्ष्य के साथ संकरण को बढ़ावा देता है कि एक विस्तारित रचना में उन्हें रखने के लिए कार्य करता है.
- दिन के बाद 5 सेकंड के लिए नाइट्रोजन की एक धारा के तहत 2-3 सेकंड और सूखे के लिए विआयनीकृत एच 2 ओ के साथ सेंसर चिप धो लो.
- 10 मिमी Tris-एचसीएल, पीएच 8.0, 0.3 एम NaCl, 1 मिमी EDTA, 1 मिमी सभी 16 सेंसर और 50 मिनट के लिए सेते का काम कर इलेक्ट्रोड को 6 mercapto-1-HEXANOL (एमसीएच) के 6 μl लागू करें. यह और बाद के सभी सेंसर चिप incubations के कमरे के तापमान पर एक कवर पेट्री डिश में प्रदर्शन कर रहे हैं. मातृ एवं शिशु स्वास्थ्य thiolated कब्जा जांच या HDT इलेक्ट्रोड सतह पर मौजूद नहीं है, जहां किसी भी अंतराल में भरने, एक अवरुद्ध एजेंट के रूप में कार्य करता है.
2. नमूना तैयार
- 5 मिनट के लिए 16,000 XG पर एक microcentrifuge ट्यूब और अपकेंद्रित्र को विकास की लॉग चरण (≈ 0.1 600 आयुध डिपो) में जीवाणु संस्कृति के 1 मिलीलीटर स्थानांतरण. संस्कृति सतह पर तैरनेवाला निकालें. बैक्टीरिया गोली तुरंत कार्रवाई या -80 डिग्री सेल्सियस पर बाद में उपयोग के लिए भंडारित किया जा सकता है.
- अच्छी तरह से बीओटी के लिए पिपेट टिप लगाने से 1 एम NaOH के 10 μl में बैक्टीरिया गोली resuspendmicrocentrifuge ट्यूब और कई बार ऊपर और नीचे pipetting के टॉम. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर निलंबन सेते हैं.
- , 1 एम फास्फेट बफर, 7.2 पीएच के 50 μl जोड़कर एक fluorescein-संशोधित डिटेक्टर जांच के 2.5% गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) और 0.25 मिमी युक्त द्वारा बैक्टीरियल lysate बेअसर. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए निष्प्रभावी lysate सेते हैं. Fluorescein संशोधित डिटेक्टर जांच बैक्टीरियल rRNA अणु लक्ष्य के साथ संकरण.
3. विद्युत सेंसर परख
- 5 सेकंड के लिए नाइट्रोजन की एक धारा के तहत 2-3 सेकंड और सूखे के लिए विआयनीकृत एच 2 ओ के साथ सेंसर चिप से मातृ एवं शिशु स्वास्थ्य को धो लें.
- 14 सेंसरों से प्रत्येक का काम कर इलेक्ट्रोड को निष्प्रभावी बैक्टीरियल lysate के 4 μl लागू करें और 15 मिनट के लिए सेते हैं. लक्ष्य डिटेक्टर जांच परिसरों स्थिर thiolated कब्जा जांच करने के संकरण.
- 2.5% BSA और 0.25 और युक्त, 1 एम फास्फेट बफर, 7.2 पीएच में oligonucleotide ब्रिजिंग 1 एनएम के 4 μl लागू करेंम्यू, एम fluorescein संशोधित डिटेक्टर जांच 2 सकारात्मक नियंत्रण सेंसर (संकेत सामान्य बनाने के लिए प्रयोग किया जाता है) और 15 मिनट के लिए सेते हैं.
- 5 सेकंड के लिए नाइट्रोजन की एक धारा के तहत 2-3 सेकंड और सूखे के लिए विआयनीकृत एच 2 ओ के साथ सेंसर चिप धो लें.
- , 1 एम फास्फेट बफर, 7.2 पीएच में 0.5 यू / एमएल विरोधी Fluorescein एचआरपी के 4 μl लागू करें सभी 16 सेंसर का काम कर इलेक्ट्रोड को 0.5% कैसिइन युक्त और 15 मिनट के लिए सेते हैं. विरोधी Fluorescein एचआरपी स्थिर fluorescein-संशोधित डिटेक्टर जांच को बांधता है.
- 5 सेकंड के लिए नाइट्रोजन की एक धारा के तहत 2-3 सेकंड और सूखे के लिए विआयनीकृत एच 2 ओ के साथ सेंसर चिप धो लें.
- सेंसर चिप माउंट में सेंसर चिप और लोड की सतह के लिए एक अच्छी तरह से फिल्म स्टीकर लागू करें. पिपेट 50 सभी 16 सेंसरों पर TMB सब्सट्रेट के μl और सेंसर चिप माउंट बंद करें.
- Helios चिप रीडर का उपयोग करते हुए सभी 16 सेंसरों के लिए amperometry और चक्रीय voltammetry माप प्राप्त करते हैं. Amperometric वर्तमान TMB r की दर के लिए आनुपातिक हैसेंसर सतह पर शिक्षा (चित्रा 1 देखें).
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Representative Results
हम एक सैंडविच एलिसा को इसी तरह से संरचित है कि एक विद्युत परख का वर्णन है. जैसा कि चित्र 1, डिटेक्टर जांच पर 3 'fluorescein संबंध है कि बाँध विरोधी fluorescein एंटीबॉडी टुकड़े को संयुग्मित एचआरपी द्वारा उत्प्रेरित एक redox प्रतिक्रिया द्वारा विकसित की है पर कब्जा और डिटेक्टर जांच के साथ लक्ष्य ribosomal शाही सेना (rRNA) संकरण में दिखाया गया है. परख संवेदनशीलता का एक महत्वपूर्ण घटक सोना इलेक्ट्रोड की सतह रसायन शास्त्र है. हम thiolated कब्जा जांच, mercaptohexanol, और hexanedithiol से मिलकर एक त्रिगुट monolayer काफी संवाददाता प्रोटीन 3 के बंधन अविशिष्ट पृष्ठभूमि को कम करने से संकेत करने वाली शोर अनुपात को बेहतर बनाता है कि मिल गया है. assays के चित्रा 2 में दिखाया गया एक GeneFluidics 16 संवेदक सरणी चिप रोजगार यहाँ वर्णित है. सरणी में सेंसर के हर चिप 4 के किनारे पर संपर्क अंक है जो तीन इलेक्ट्रोड, काम करने, संदर्भ, और सहायक होते हैं. चिप पढ़ाएर संपर्क बिंदुओं में से प्रत्येक के साथ कनेक्ट कि पोगो पिन है. चिप पाठक एक कंप्यूटर कलन विधि द्वारा नियंत्रित एक तनाव नापने का यंत्र के साथ सेंसर सरणी के लिए एक अंतरफलक के रूप में कार्य करता है.
विद्युत सेंसर वर्तमान प्रवाह के उदाहरण 3 चित्र में दिखाया जाता है. Amperometric माप पाठक कलन विधि की शुरुआत करने के लिए सेंसर सतह को TMB के आवेदन से समय के दौरान क्योंकि ऑक्सीकरण सब्सट्रेट के संचय के लिए शुरू के बाद सेंसर में वर्तमान प्रवाह पहले कुछ सेकंड के दौरान कृत्रिम रूप से उच्च है. वर्तमान प्रवाह जल्दी से एक स्थिर अवस्था तक पहुँच जाता है और सटीक सेंसर रीडिंग मज़बूती से साठ सेकंड के भीतर प्राप्त किया जा सकता है. सेंसर assays के आम तौर पर सेंसर परिवर्तनशीलता के लिए एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में दो प्रतियों में प्रदर्शन कर रहे हैं. हम सेंसर को सेंसर परिवर्तनशीलता अपेक्षाकृत स्थिर है, तो यह 16 संवेदक सरणी चिप GeneFluidics पर समानांतर में 16 विभिन्न सेंसर assays के प्रदर्शन करने के लिए संभव है कि मिल गया है. सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण एस्सेन हैंtial. एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में, हम पर कब्जा और डिटेक्टर जांच करने के लिए दोनों hybridizes और जाना जाता एकाग्रता की एक कृत्रिम लक्ष्य के रूप में कार्य करता है कि एक कृत्रिम "ब्रिजिंग" डीएनए oligonucleotide शामिल हैं. इस तरह, परिणाम चिप करने वाली चिप भिन्नता को कम करने के लिए एक आंतरिक अंशांकन नियंत्रण के रूप में ब्रिजिंग oligonucleotide कार्यों का उपयोग कर प्राप्त की.
कब्जा और डिटेक्टर जांच का परीक्षण करते हैं, पता लगाने की सीमा में जाना एकाग्रता का एक नमूना के धारावाहिक कमजोर पड़ने से निर्धारित किया जाना चाहिए. चित्रा 4 में दिखाया गया है, नमूना एकाग्रता और परख के गतिशील रेंज पर संकेत उत्पादन के बीच एक रेखीय लॉग लॉग संबंध है. पता लगाने की सीमा पृष्ठभूमि संकेतों 5 की औसत से 3.29 मानक विचलन अधिक है एक संकेत उत्पन्न करने के लिए आवश्यक लक्ष्य की एकाग्रता के रूप में परिभाषित किया गया है. एक अज्ञात नमूने में बैक्टीरिया की पहचान के लिए, प्रासंगिक कब्जा और डिटेक्टर जांच जोड़े का एक पैनल का चयन किया जाता है. जांच के विकल्प मैंनमूने की एक विशेष प्रकार में संदिग्ध बैक्टीरिया के प्रकार के द्वारा निर्धारित की. बेशक, असामान्य बैक्टीरिया कभी कभी किसी भी नमूने में पाया जा सकता है, तो हम एक eubacterial जांच जोड़ी किसी भी बैक्टीरिया का संरक्षित rRNA के क्षेत्रों को संकरण करने की क्षमता है कि शामिल किया जा सलाह देते हैं. चित्रा 5 ई. युक्त नमूने लिए प्रतिनिधि परिणामों से पता चलता है कोली और कश्मीर अक्सर मूत्र पथ के संक्रमण के साथ रोगियों के मूत्र में पाया जाता है जो निमोनिया,. सेंसर के अधिकांश के लिए सिग्नल कम और समान हो जाएगा, और इन नकारात्मक परिणामों पृष्ठभूमि संकेत के रूप में जमा किया जा सकता है.
चित्रा 1. विद्युत सेंसर परख के योजनाबद्ध आरेख. सोने इलेक्ट्रोड mercaptohexanol और hexanedithiol साथ लेपित और thiolated डीएनए oligonucleotide कब्जा जांच (नीला) के अलावा द्वारा क्रियाशील है. सैंडविच जडीएनए oligonucleotide कब्जा जांच और fluorescein लेबल डीएनए oligonucleotide डिटेक्टर जांच के साथ लक्ष्य -16 RRNA की ybridization (लाल), विरोधी fluorescein के अलावा द्वारा पता चला है कि एक परिसर में परिणाम - हॉर्सरैडिश peroxidase (एचआरपी) साधना और TMB सब्सट्रेट. Amperometric वर्तमान रेडोक्स चक्र से उत्पन्न होता है कि एचआरपी और इलेक्ट्रोड से इलेक्ट्रॉनों द्वारा TMB की कमी से TMB के ऑक्सीकरण का परिणाम है.
चित्रा 2. . एक केंद्रीय काम इलेक्ट्रोड, एक परिधीय संदर्भ इलेक्ट्रोड और संकेत स्थिरीकरण के लिए एक सहायक इलेक्ट्रोड: बैक्टीरियल पहचान संवेदक सरणी और चिप माउंट सरणी में प्रत्येक संवेदक तीन इलेक्ट्रोड के होते हैं. सरणी में प्रत्येक सेंसर का काम कर इलेक्ट्रोड के रूप में हम (3 टेबल देखें) ब्याज की बैक्टीरियल प्रजातियों के लिए विशिष्ट कब्जा जांच के एक पैनल के साथ क्रियाशील कर रहे हैं सभी बैक्टीरियल 16S rRNA के अणुओं और एक BrOl "ब्रिजिंग" oligonucleotide संकेत जांच के लिए सकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है कि करने के लिए hybridizes कि एक यूरोपीय संघ (eubacterial) पर कब्जा जांच के रूप में करूँगा. सिग्नल पोगो पिन के साथ एक चिप रीडर में सरणी रखने से मापा जाता है कि सेंसर इलेक्ट्रोड संपर्क अंक के साथ इंटरफेस.
चित्रा 3. माप के दौरान amperometric वर्तमान उत्पादन. Amperometric मौजूदा सरणी में सभी 16 सेंसरों के लिए समानांतर में मापा जाता है. वर्तमान प्रवाह शुरू में होने के कारण पहले चिप पाठक को सरणी जोड़ने और माप शुरू करने ऑक्सीकरण TMB सब्सट्रेट के संचय के लिए बेहद नकारात्मक है. इसके बाद, वर्तमान जल्दी से स्थिर और सेंसर रीडिंग 60 सेकंड में दर्ज की गई हैं. अधिक से अधिक नकारात्मक वर्तमान के साथ इलेक्ट्रोड उच्चतम संकेत है.
"चित्रा 4" src = "/ files/ftp_upload/4282/4282fig4.jpg" />
4 चित्रा. ई. के सीरियल दस गुना कमजोर पड़ने पता लगाने की सीमा निर्धारित करने के लिए कोलाई. सेंसर ई. के एक ज्ञात एकाग्रता के धारावाहिक दस गुना dilutions के साथ दो प्रतियों में परीक्षण किया गया कोलाई lysate. मनाया संकेत रीडिंग, काले घेरे के रूप में प्लॉट आर्दश संकेत वक्र भविष्यवाणी करने के लिए इस्तेमाल किया गया. सभी के लिए जमा मानक विचलन replicates और सबसे कम लक्ष्य एकाग्रता में पृष्ठभूमि संकेत पृष्ठभूमि पर 3.29 मानक विचलन के रूप में परिभाषित किया गया पहचान (ब्लू लाइन) की सीमा की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया गया.
चित्रा 5. Escherichia कोलाई और क्लेबसिएला निमोनिया. ई. के लिए प्रतिनिधि विद्युत सेंसर परख परिणाम कोली और कश्मीर pneumonIAE टेबल्स 2 और 3 में वर्णित जांच के जोड़े के साथ जेट के लिए परीक्षण किया गया. केई जांच जोड़ी के साथ जेट लालकृष्ण अलग पहचानता ई. से निमोनिया कोलाई. ब्रिजिंग oligonucleotide (BrOl) सकारात्मक नियंत्रण और आंतरिक अंशांकन मानक के रूप में कार्य करता है.
| जांच के नाम | Ribosomal सबयूनिट और स्थान * | अनुक्रम |
| 10 केई कैप | -16 74 | 5'-एस AGCTCTCTGT |
| केई डेट 11m | -16 63 | 5'-GCTACCGYTCG एफ |
| ई.के. कैप 15 | 23S 1492 | 5'-AGCCTTGATTTTCCG एस |
| ई.के. डेट 15 | 23S 1507 | 5'-एफ TCGTCATCACACCTC |
| ईएल कैप 17 | 23S 1507 | 5'-AGCGTTAAAAGGTACCG एस |
| ईएल कैप 18m | 23S 1507 | 5'-AGCGTTAADAAGGTACCG एस |
| ईएल डेट 15 | 23S 1492 | 5'-एफ TCGTCATCACACCTC |
| ईबी कैप 23m | -16 1275 | 5'-एस ACTTTATGAGGTCCGCTTGCTCT |
| ईबी डेट 23m | -16 1252 | 5'-CGCGAGGTCGCCTTCCTTTGTAT एफ |
| प्रधानमंत्री कैप 15 | -16 183 | 5'-एस TTTGGTCCGTAGACA |
| प्रधानमंत्री डेट 17 | -16 166 | 5'-TTATGCGGTATTAGCCA एफ |
| पीए कैप 11m | -16 453 | 5'-एस ACTTACTGCCC |
| 14 पीए डेट | -16 439 | 5'-TTCCTCCCAACTTA एफ |
| यूरोपीय संघ के जीएन कैप 19m | -16 1502 | 5'-एस GTTCCCCTACGGTTACCTT |
| यूरोपीय संघ डेट 18m | -16 1484 | 5'-GTTACGACTTCACCCCAG एफ |
| यूरोपीय संघ BrOl 37m | 5'-CTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAACCGTAGGGGAAC |
तालिका 2. डीएनए प्रोटोकॉल जांच जोड़ी दृश्यों. कैद (कैप) जांच thiol लिंकेज (एस) के साथ संश्लेषित कर रहे हैं. डिटेक्टर (डेट) जांच fluorescein (एफ) संशोधनों के साथ संश्लेषित कर रहे हैं. जांच जोड़े एक 5'-thiolated कब्जा जांच और एक 3'-fluorescein संशोधित डिटेक्टर जांच या एक 3'-thiolated कब्जा जांच और एक 5'-fluorescein-संशोधित डिटेक्टर जांच या तो शामिल है कि ध्यान दें. दो ईएल कब्जा जांच का उपयोग करने से पहले मिश्रित कर रहे हैं. परख आसान बनाने के लिए, डिटेक्टर जांच पार जेट महत्वपूर्ण बिना एक मिश्रण के रूप में प्रत्येक संवेदक के लिए लागू किया जा सकता है. केई - क्लेबसिएला और Enterobacter, ई.के. - ई. कोलाई और कश्मीर निमोनिया, ईएल - ई. cloacae, ईबी - Enterobacteriaceae परिवार, अपराह्न - पी. मिराबिलिस, पीए - पी. aeruginosa, यूरोपीय संघ - Eubacterial, BrOl - ब्रिजिंग प्रोटोकॉल. * - स्थान पताभूरा रंग -16 या 23S जीन की शुरुआत से दूरी को दर्शाता है.
| बैक्टीरियल प्रजातियों | रिएक्टिव जांच जोड़े |
| Escherichia कोलाई | ई.के. + ईबी |
| क्लेबसिएला निमोनिया | केई + ई.के. + ईबी |
| बदलनेवाला प्राणी मिराबिलिस | प्रधानमंत्री + ईबी |
| Pseudomonas aeruginosa | पीए |
| Enterobacter प्रजातियों | केई + ईबी या ईएल + ईबी या केई + ईएल + ईबी |
तालिका 3. जांच जोड़े द्वारा बैक्टीरियल प्रजातियों की पहचान.
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Discussion
यहाँ वर्णित विद्युत सेंसर परख न्यूक्लिक एसिड लक्ष्य का तेजी से पता लगाने में सक्षम बनाता है. संवेदनशीलता और विशिष्टता के बदले में लंबाई और कब्जा और डिटेक्टर जांच के जीसी सामग्री पर निर्भर करता है जो लक्ष्य से जांच के संकरण से मुक्त ऊर्जा पर निर्भर हिस्से में. हम आम तौर पर परिवेश के तापमान (~ 20 डिग्री सेल्सियस) 5, 6 में संकरण चरणों का प्रदर्शन. हालांकि, संकरण कदम (3.2 और 3.3) भी चिप युक्त एक कवर कक्ष में रखा गया है अगर एक संकरण ओवन में उच्च तापमान पर प्रदर्शन किया वाष्पीकरण 7, 8 को रोकने के लिए फिल्टर पेपर सिक्त किया जा सकता है. इष्टतम संकेत संकरण साइटों 8 के बीच एक अंतराल के बिना न्यूक्लिक एसिड लक्ष्य पर आसन्न साइटों के लिए संकरण कि कब्जा डिटेक्टर जांच के जोड़े के साथ प्राप्त की है. यह संकेत वृद्धि स्टैकिंग आधार जोड़ी से और एक "सहायक जांच" प्रभाव के रूप में जाना जाता सटे क्षेत्रों के संकरण पहुंच को बढ़ाने के द्वारा काम करने के लिए सोचा है. कब्जा डिटेक्टर समस्याआसन्न साइटों के लिए ई संकरण rRNA के लक्ष्य 5 के विखंडन में बैक्टीरिया परिणाम की क्षारीय सेल वजह से भी महत्वपूर्ण है. इस विधि नैदानिक अनुसंधान और अनुप्रयोगों का एक व्यापक विविधता के साथ, शाही सेना या डीएनए लक्ष्य या तो का पता लगाने के लिए लागू किया जा सकता है. उदाहरण के लिए यह छोटे RNAs द्वारा विनियमित रहे हैं या तो डीएनए या mRNA के रूप में या तो एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन लक्ष्य का पता लगाने के लिए कि सेलुलर कार्यों का अध्ययन करने के लिए इस विधि का उपयोग करने के लिए संभव हो जाना चाहिए. पूर्व amplication कम प्रतिलिपि संख्या में मौजूद ठिकानों का पता लगाने के लिए आवश्यक हो सकता है. इसके अलावा, RNAse अवरोधकों संभावित अस्थिर शाही सेना के ठिकानों की गिरावट को रोकने के लिए नमूना तैयार करने के दौरान जोड़ा जाना चाहिए.
इस विधि बैक्टीरिया का पता लगाने और पहचान के अन्य तरीकों पर कई फायदे हैं. मानक नैदानिक सूक्ष्म जीव विज्ञान के तरीकों पहचान तरीकों के quantitation और आवेदन के लिए अगर मध्यम पर जीवाणु वृद्धि की आवश्यकता है. दिखाई कालोनियों को बैक्टीरिया की वृद्धि को आम तौर पर शामिल हैरात ऊष्मायन, काफी परिणामों की रिपोर्टिंग करने के लिए नमूना संग्रह से समय में देरी. विद्युत biosensors के 9 सहित रोगज़नक़ का पता लगाने के लिए और अधिक तेजी, आणविक विधियों के विकास में काफी रुचि है. हालांकि, थोड़ा ध्यान कच्चे जैविक नमूने में डीएनए biosensors के प्रदर्शन के लिए दिया गया है. विद्युत सेंसर परख यहाँ वर्णित संवेदनशीलता 7 का एक महत्वपूर्ण नुकसान के बिना सीरम और मूत्र के नमूने पर सीधे किया जा सकता है. thiolated कब्जा जांच और यहाँ वर्णित मिश्रित monolayer के उपयोग के सीरम या मूत्र 10 सहित कच्चे जैविक नमूनों में संवेदनशीलता को बनाए रखना, गैर विशिष्ट प्रोटीन के अवशोषण के लिए प्रतिरोधी सेंसर सतह प्रदान करता है. सेंसर प्रति 1 बैक्टीरिया कोशिका (मिली लीटर प्रति 250 बैक्टीरिया) के रूप में कुछ पता लगाने योग्य हैं, जो पीसीआर प्रवर्धन तकनीक 1 की संवेदनशीलता के बराबर है. कई पीसीआर आधारित जीवाणु पहचान विधियों 11, 1 वर्णित किया गया है2. पीसीआर संभावित विद्युत सेंसर परख यहाँ वर्णित से कम लक्ष्य अणुओं का पता लगा सकता है, पीसीआर आधारित विधियों क्योंकि उच्च उपकरणों के अधिग्रहण और मानक नैदानिक सूक्ष्म जीव विज्ञान के तरीकों के सापेक्ष / या अभिकर्मक लागत, के सीमित गोद लेने हासिल किया है. इसके विपरीत, विद्युत सेंसर का उत्पादन करने के लिए अपेक्षाकृत कम खर्चीली हैं. इलेक्ट्रोड सोने sputtering के द्वारा निर्मित कर रहे हैं हालांकि इलेक्ट्रोड मोटाई केवल 1,000 angstroms है क्योंकि चिप प्रति सोने की मात्रा कम है.
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Disclosures
सभी लेखकों वर्णित विधि के लिए प्रासंगिक पेटेंट पर आविष्कारक हैं. इन पेटेंटों में से एक Qvella निगम को लाइसेंस दिया गया है. बीएमसी और दाह Qvella निगम में इक्विटी दिलचस्पी नहीं है. वी.जी. विद्युत संवेदक सरणी चिप के निर्माता है जो GeneFluidics के राष्ट्रपति, चिप माउंट, और इस पत्र में वर्णित चिप पाठक है.
Acknowledgments
इस अध्ययन एलर्जी और संक्रामक रोगों के राष्ट्रीय संस्थान से सहकारी समझौते पुरस्कार AI075565 (दाह करने के लिए) से और वेंडी और बाल चिकित्सा मूत्रविज्ञान अनुसंधान में उत्कृष्टता के लिए केन रूबी कोष द्वारा समर्थित किया गया था. बीएमसी जूडिथ और बाल चिकित्सा मूत्रविज्ञान में रॉबर्ट विंस्टन अध्यक्ष है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-mercapto-1-hexanol (MCH) | Sigma | 451088 | Store at room temperature |
| 1,6-hexanedithiol (HDT) | Sigma | H-12005 | Store at room temperature |
| Thiolated capture probes | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
| Fluorescein-modified detector probes | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
| Bridging Oligonucleotide | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
| Anti-Fluorescein-HRP, Fab fragments | Roche | 11 426 346 910 | Store at 4 °C |
| Helios Chip Reader | GeneFluidics | GFR-2009 | |
| Sensor Chip Mount | GeneFluidics | GFR-003 | |
| Film well sticker | GeneFluidics | Shipped with sensor chips | |
| Bare gold 16-sensor array chips | GeneFluidics | SC1000-16X-B | Store in 100% N2 at room temperature |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | Store at 4 °C |
| 1M Phosphate Buffer, pH 7.2 | 0.35M NaH2PO4, 0.65M K2HPO4, adjusted to pH 7.2 | ||
| Blocker Casein in PBS | Pierce | 37528 | Dilute with an equal volume of 1M Phosphate Buffer, pH 7.2, store at 4 °C |
| Table 1. Reagents and Equipment. | |||
References
- Wu, J., Campuzano, S., Halford, C., Haake, D. A., Wang, J. Ternary Surface Monolayers for Ultrasensitive (Zeptomole) Amperometric Detection of Nucleic Acid Hybridization without Signal Amplification. Anal. Chem. 82, 8830-8837 (2010).
- Halford, C., et al. Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing by Sensitive Detection of Precursor Ribosomal RNA Using a Novel Electrochemical Biosensing Platform. Antimicrob. Agents Chemother. 56, In Press (2012).
- Campuzano, S., et al. Ternary monolayers as DNA recognition interfaces for direct and sensitive electrochemical detection in untreated clinical samples. Biosens. Bioelectron. 26, 3577-3584 (2011).
- Gau, V., et al. Electrochemical molecular analysis without nucleic acid amplification. Methods. 37, 73-83 (2005).
- Patel, M., et al. Target Specific Capture Enhances Sensitivity of Electrochemical Detection of Bacterial Pathogens. J. Clin. Microbiol. 49, 4293-4296 (2011).
- Mastali, M., et al. Optimal probe length and target location for electrochemical detection of selected uropathogens at ambient temperature. J. Clin. Microbiol. 46, 2707-2716 (2008).
- Liao, J. C., et al. Use of electrochemical DNA biosensors for rapid molecular identification of uropathogens in clinical urine specimens. J. Clin. Microbiol. 44, 561-570 (2006).
- Liao, J. C., et al. Development of an advanced electrochemical DNA biosensor for bacterial pathogen detection. J. Mol. Diagn. 9, 158-168 (2007).
- Pedrero, M., Campuzano, S., Pingarron, J. M. Electroanalytical sensors and devices for multiplexed detection of foodborne pathogen microorganisms. Sensors (Basel). 9, 5503-5520 (2009).
- Kuralay, F., Campuzano, S., Haake, D. A., Wang, J. Highly sensitive disposable nucleic acid biosensors for direct bioelectronic detection in raw biological samples. Talanta. 85, 1330-1337 (2011).
- Ecker, D. J., et al. Ibis T5000: a universal biosensor approach for microbiology. Nat. Rev. Microbiol. 6, 553-558 (2008).
- Casalta, J. P., et al. Evaluation of the LightCycler SeptiFast test in the rapid etiologic diagnostic of infectious endocarditis. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 28, 569-573 (2009).
