Summary
我々は、迅速な菌の検出および同定のための電気化学センサの測定方法を説明する。アッセイは、リボソームRNA（rRNAの）種特異的配列のためのDNAオリゴヌクレオチド捕捉プローブで官能化されたセンサアレイを含む。捕捉プローブと西洋ワサビペルオキシダーゼ連動DNAオリゴヌクレオチドの検出プローブでターゲットのrRNAのサンドイッチハイブリダイゼーションは、測定電流測定電流を生成する。
Abstract
電気化学センサが広く血糖の迅速かつ正確な測定のために使用され、検体の多種多様な検出のために適合させることができる。電気化学センサは、有用な電気信号に生体認識イベントに形質導入することによって動作する。シグナル伝達は、電流測定電極に酸化還元酵素の活性を結合することによって起こる。センサの特異性は、酵素の固有の特性、グルコースセンサの場合、グルコースオキシダーゼ、又は酵素及び抗体又はプローブ間のリンケージの積である。
ここでは、直接細菌を検出し、識別するための電気化学センサの測定方法を説明する。いずれの場合も、ここで説明するプローブは、DNAオリゴヌクレオチドである。この方法は、標的リボソームRNA（rRNAの）とキャプチャーと検出プローブのサンドイッチハイブリダイゼーションに基づいています。検出プローブがhに連結されている間に捕捉プローブは、センサー表面に固定されているorseradishペルオキシダーゼ（HRP）。例えば、3,3 '、5,5' - テトラメチルベンジジン（TMB）などの基板は、その表面に結合した捕捉対象検出器複合体を有する電極に追加されると、基板は、HRPにより酸化され、作用電極によって低減される。電極で電流の流れを作り出す、電極からHRPに基板による電子の往復でこの酸化還元サイクル結果。
Introduction
細菌の検出および同定のための標的分子としてのrRNAを使用すると、多くの利点を有する。細菌細胞内のrRNAの存在量が標的増幅1を必要とせずにミリリットルあたり250バクテリアの低感度限界のために用意されています。細菌のリボソームRNAは、DNAプローブとのハイブリダイゼーションにアクセス可能なユニークな種特異的な配列を含む。これにより、電気化学センサのアレイは、各センサが異なる種特異的捕捉プローブで官能化されている未知の細菌を同定するために用いることができる。ポジティブコントロールセンサーは、 "ブリッジ"捕捉および検出プローブが内部校正信号を作成するために合成オリゴヌクレオチド標的のために含まれるべきである。
電気化学センサーは、基本的な研究および翻訳の幅広い用途を有する。例えば、ここに記載されたアッセイを正確E.の効果を測定するために使用されているRRN上の大腸菌増殖期細菌の生理学2に興味を持って研究者に大きな関心であると事前rRNAのコピー数、。電気化学センサアッセイの感度は、信号対雑音比によって決定される。信号増幅及びノイズ低減の様々な方法が検討されている。私たちは、センサー表面の化学的性質を改善することは検出プローブおよび/またはHRP酵素の非特異的結合を減少させるための鍵であることがわかります。特に、アルカンジチオール及びメルカプトヘキサノールとの混合単分子膜は、標的ハイブリダイゼーション3に対して捕捉プローブのアクセス可能性を保持しながらより完全に電極表面を被覆することによってバックグラウンドを低減することが見出された。これらの表面化学処理は、複雑な生物学的サンプルを伴うアッセイのために特に重要である。
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Protocol
1。電気化学センサーの機能化
- 300μMの1,6 - ヘキサン（HDT）、10mMのトリス-HCl、pH8.0、0.3 MのNaCl、1mMのEDTA、10分間、室温で暗所でインキュベートにおいて0.05μMの濃度でチオール化捕捉プローブを準備。 HDTを有するチオール化捕獲プローブのインキュベーションは、より一貫性のある結果をもたらし、捕捉プローブのチオール基が低減されることを保証する。
- 水分および/または粒子を除去するために5秒間裸金16センサアレイチップ（複数可）に窒素気流を適用する。
- HDT-チオール捕捉プローブの6μlのセンサアレイのすべての16のセンサーの作用電極に混合し、4℃で一晩カバーペトリ皿にセンサーチップ（s）を保存し適用します。チオール捕捉プローブは、裸の金電極に直接結合し、HDTは、捕捉プローブの過剰充填防止し、それらの目標とのハイブリダイゼーションを促進し、拡張コンフォメーションを保つように作用する。
- ザ翌日、5秒間、窒素気流下で2〜3秒で乾燥し、脱イオンH 2 Oとセンサチップを洗う。
- 10mMのトリス-HCl、pH8.0、0.3 MのNaCl、1mMのEDTA、1mMの全てのセンサ16と50分間インキュベート作用電極に6 - メルカプト-1 - ヘキサノール（MCH）6μlのを適用する。これ以降のすべてのセンサチップインキュベーションを室温で覆われたペトリ皿で行われる。 MCHは、チオール捕捉プローブまたはHDTは、電極表面上に存在しない任意のギャップを埋める、ブロッキング剤として機能します。
2。試料調製
- 5分間16,000 xgで遠心チューブと遠心分離機に成長の対数期（≈0.1 OD 600）で細菌培養液1mlを転送します。培養上清を取り除きます。細菌ペレットを直ちに処理または-80°C、後で使用するために保存することができる。
- 徹底的にボットにピペットチップを適用することにより、1MのNaOH10μlに細菌ペレットを再懸濁マイクロチューブのトムと数回ピペッティング。 5分間室温で懸濁液をインキュベートする。
- ウシ血清アルブミン（BSA）およびフルオレセイン変性検出プローブの0.25mMの2.5％を含有し、pHが7.2、1 Mリン酸緩衝液50μlを添加して細菌溶解物を中和する。室温で10分間中和された溶解物をインキュベートする。フルオレセイン変性検出プローブは、細菌リボソームRNA標的分子とハイブリダイズする。
3。電気化学センサーアッセイ
- 5秒のために、窒素気流下2-3秒、乾燥のために脱イオンH 2 OとのセンサーチップからMCHを洗ってください。
- 14センサーのそれぞれの作用電極に中和細菌溶解4μlのを適用し、15分間インキュベートする。標的検出プローブ複合体は、固定されたチオール化捕獲プローブにハイブリダイズする。
- 2.5％BSAおよび0.25＆を含む1Mのリン酸緩衝液中でオリゴヌクレオチドをブリッジ1nmの4μlを、pHが7.2を適用μ、Mフルオレセイン変性検出プローブ2陽性対照センサ（信号正規に使用される）と15分間インキュベートする。
- 5秒のために、窒素気流下2-3秒、乾燥のために脱イオンH 2 Oとセンサチップを洗ってください。
- 15分間のすべての16のセンサーとインキュベートの作用電極に0.5％カゼインを含む1 Mリン酸緩衝液で0.5 U / mlの抗フルオレセイン-HRP4μlの、pHが7.2を適用します。抗フルオレセイン-HRPは、固定化されたフルオレセイン修飾された検出プローブに結合する。
- 5秒のために、窒素気流下2-3秒、乾燥のために脱イオンH 2 Oとセンサチップを洗ってください。
- センサーチップマウントにセンサチップと負荷の表面によくフィルムステッカーを適用します。全16センサーへのTMB基質のピペットを50μlとセンサチップマウントを閉じます。
- ヘリオスチップリーダーを使用しているすべての16センサー用アンペロメトリーとサイクリックボルタンメトリー測定値を得る。電流測定電流は、TMB、rの速度に比例しているセンサー表面に析出（ 図1参照）。
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Representative Results
私たちは、サンドイッチELISAと同様に構成されている電気化学的測定法について説明します。 図1に示すように、捕捉および検出プローブと標的リボソームRNA（rRNAの）ハイブリダイゼーションを検出プローブ上の3 'フルオレセイン結合に結合する抗フルオレセイン抗体フラグメントに結合したHRPにより触媒される酸化還元反応によって開発されている。分析感度の重要な構成要素は、金電極の表面の化学的性質である。我々は、チオール化捕捉プローブ、メルカプトヘキサノール、及びヘキサンからなる三元系単分子層が著しくレポータータンパク3の結合非特異的バックグラウンドを減少させることによって信号対雑音比を改善することを見出した。アッセイは、 図2に示すGeneFluidics 16センサアレイチップを採用してここで説明する。アレイ内の各センサは、3つの電極、仕事、基準、及びチップ4の縁に接触点を有する補助を含んでいる。チップの読み取り小胞体は、接触点のそれぞれと接続するポゴピンを有する。チップリーダーはコンピュータアルゴリズムによって制御ポテンショメータとセンサーアレイのインタフェースとして機能します。
電気化学センサの電流の流れの例を図3に示されている。アンペロメトリック測定値がTMBのアプリケーションからセンサー表面にリーダーアルゴリズムを開始するまでの時間の間にあるために酸化基質の蓄積を開始した後、センサーの現在の流れは、最初の数秒の間に人為的に高いです。電流の流れは急速に安定した状態で正確なセンサーの読み取りが確実に60秒以内に取得することができる達する。センサアッセイは、典型的には、センサばらつきの内部対照として重複して行われる。我々は、センサ間の変動が比較的一定であるので、それは、16センサアレイチップGeneFluidicsに平行に16の異なるセンサアッセイを行うことが可能であることを見出した。正と負のコントロールが不可欠である動。陽性対照として、我々はキャプチャと検出プローブの両方にハイブリダイズし、既知濃度の合成ターゲットとして合成 "橋渡し" DNAオリゴヌクレオチドを含む。このようにして、チップ間のばらつきを最小化するために内部キャリブレーション制御などの架橋オリゴヌクレオチドの機能を用いて得られた結果。
捕捉および検出プローブをテストする場合、検出限界は、既知濃度の試料の連続希釈によって決定されるべきである。 図4に示すように、試料濃度およびアッセイのダイナミックレンジにわたって出力される信号との間の線形対数相関がある。検出限界は、バックグラウンド信号5の平均値よりも3.29の標準偏差も大きい信号を生成するために必要な対象物の濃度として定義される。未知試料中の細菌の同定のための、関連する捕捉および検出プローブ対のパネルが選択される。プローブの選択Isが、試料の特定のタイプに疑われる細菌の種類によって決まる。もちろん、珍しい細菌が時折任意のサンプルで見つけることができますので、真正細菌プローブ対は、任意の細菌の保存rRNAの領域にハイブリダイズする能力を持っていることを含めることをお勧めします。 図5は、E. が含まれているサンプルのための代表的な結果を示しています大腸菌やK.頻繁に尿路感染症を有する患者の尿中に見出される肺炎 。センサのほとんどの信号が低いと類似しており、これら陰性の結果は、バックグラウンド信号としてプールすることができる。
図1。電気化学センサアッセイの概略図。金電極をメルカプトヘキサノールとヘキサンで被覆し、チオール化DNAオリゴヌクレオチド捕捉プローブ（青）の添加により官能化される。サンドイッチHDNAオリゴヌクレオチド捕捉プローブおよびフルオレセイン標識したDNAオリゴヌクレオチド検出プローブ（赤）でターゲットの16S rRNA遺伝子のybridization、抗フルオレセインの添加によって検出される複合体をもたらす - ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）結合体とTMB基質。電流測定電流は、酸化還元サイクルによって生成されるHRPと電極から電子によるTMBの還元によるTMBの酸化から生じる。
図2。細菌の識別センサーアレイとチップマウントアレイ内の各センサは、3つの電極で構成されています。中央の作用電極、参照電極周及び信号安定化のための補助電極。アレイ内の各センサの作用電極は、我々のように（ 表3参照）の近隣の菌種に特異的な捕獲プローブのパネルで官能化されているすべての細菌の16SのrRNAの分子とシグナルキャリブレーションのためのポジティブコントロールとして機能するBrOl "橋渡し"オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするEU（真正細菌）キャプチャープローブとしてLL。信号は、ポゴピンでチップリーダーにアレイを配置することによって測定されるセンサ電極の接点とのインターフェース。
図3。測定時の電流測定出力電流。電流測定電流は、アレイ内のすべての16個のセンサを並列で測定されます。電流の流れは、最初に起因する酸化TMB基質の蓄積前にチップリーダに配列を接続し、測定を開始するには極めて負である。その後、現在は急速に安定化し、センサーの測定値を60秒で記録されている。大きな負の電流で電極が最も高い信号を持っている。
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図4。 E. 10倍希釈シリアル検出限界を決定するために、 大腸菌 。センサはE.の既知の濃度の連続十倍希釈液で二重に試験した。 大腸菌ライセート。観測された信号の測定値は、黒丸としてプロット理想化された信号曲線を予測するために使用された。すべて複製し、最も低い目標濃度のバックグラウンド信号のためのプールされた標準偏差は3.29背景上の標準偏差として定義され、検出限界（青線）を計算するために使用された。
図5。 大腸菌および肺炎桿菌。E.ための代表的な電気化学的センサーの測定結果 大腸菌やK. pneumonIAEは、 表2および3に記載のプローブ対との反応性について試験した。 KEのプローブ対との反応性は、Kを区別E.から肺炎大腸菌。ブリッジオリゴヌクレオチド（BrOl）が正の制御と内部較正標準として機能します。
| プローブ名 | リボソームサブユニットと場所* | シーケンス |
| 10メートルKEキャップ | 16S 74 | 5'-S-AGCTCTCTGT |
| KEデット11メートル | 16S 63 | 5'-GCTACCGYTCG-F |
| EKキャップ15メートル | 23S 1492 | 5'-AGCCTTGATTTTCCG-S |
| EKデット15メートル | 23S 1507 | 5'-F-TCGTCATCACACCTC |
| ELキャップ17メートル | 23S 1507 | 5'-AGCGTTAAAAGGTACCG-S |
| ELキャップ18メートル | 23S 1507 | 5'-AGCGTTAADAAGGTACCG-S |
| ELデット15メートル | 23S 1492 | 5'-F-TCGTCATCACACCTC |
| EBキャップ23メートル | 16S 1275 | 5'-S-ACTTTATGAGGTCCGCTTGCTCT |
| EBデット23メートル | 16S 1252 | 5'-CGCGAGGTCGCCTTCCTTTGTAT-F |
| PMキャップ15メートル | 16S 183 | 5'-S-TTTGGTCCGTAGACA |
| PMデット17メートル | 16S 166 | 5'-TTATGCGGTATTAGCCA-F |
| PAキャップ11メートル | 16S 453 | 5'-S-ACTTACTGCCC |
| 14メートルPAデット | 16S 439 | 5'-TTCCTCCCAACTTA-F |
| EU GNキャップ19メートル | 16S 1502 | 5'-S-GTTCCCCTACGGTTACCTT |
| EUデット18メートル | 16S 1484 | 5'-GTTACGACTTCACCCCAG-F |
| EU BrOl 37メートル | 5'-CTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAACCGTAGGGGAAC |
表2。 DNAオリゴヌクレオチドプローブ対配列。（キャップ）プローブをキャプチャはチオール結合（S）を用いて合成されています。検出器（デット）プローブは、フルオレセイン（F）修正を加えて合成される。プローブ対が5'-チオール捕捉プローブおよび3'-フルオレセイン修飾検出プローブまたは3'-チオール捕捉プローブおよび5'-フルオレセイン修飾された検出プローブのいずれかを含んでいることに注意してください。 2 EL捕捉プローブは、使用前に混合される。アッセイを簡素化するために、検出プローブは、交差反応なしに有意な混合物として各センサに適用することができる。 KE - クレブシエラとエンテロバクター 、EK - 大腸菌とK.肺炎 、EL - E.クロアカ 、EB - 腸内細菌の家族、PM - P.ミラビリス 、PA - P.緑膿菌 、EU - BrOl、真正細菌-ブリッジオリゴヌクレオチド。 * - ロケーションNアンバーは、16Sまたは23S遺伝子の開始からの距離を指します。
| 細菌種 | 反応性プローブ対 |
| 大腸菌 | EK + EB |
| 肺炎桿菌 | KE + EK + EB |
| ミラビリス変形菌 | PM + EB |
| 緑膿菌 | PA |
| エンテロバクター属 | KE + EBまたはEL + EBまたはKE + EL + EB |
表3。プローブ対によって細菌種の認識。
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Discussion
ここで説明する電気化学センサアッセイは、核酸標的の迅速な検出を可能にする。感度および特異性は、順番に長さ及び捕捉および検出プローブのGC含有量に依存するターゲットプローブハイブリダイゼーションの自由エネルギーに部分的に依存する。我々は一般的に、周囲温度（〜20℃）5、6でのハイブリダイゼーションの手順を実行します。チップを含有する被覆チャンバ内に配置されれば、ハイブリダイゼーション工程（3.2および3.3）もまた、ハイブリダイゼーションオーブンでより高い温度で行うことができる蒸発7,8を防止するためにろ紙を湿らせた。最適な信号は、ハイブリダイゼーション部位8の間に隙間なく核酸標的上の隣接部位にハイブリダイズキャプチャ検出プローブ対が得られる。このシグナル増強がスタッキング塩基対によってと "ヘルパープローブ"の効果として知られている隣接する領域のハイブリダイゼーションのアクセシビリティを、増加させることにより動作するように考えられている。キャプチャ検出確率隣接したサイトへの電子ハイブリダイゼーションのrRNAターゲット5の断片の中の細菌の結果のアルカリ溶解ためにも重要です。この方法は、臨床及び研究多種多様な用途で、RNAまたはDNA標的のいずれかの検出にも適用することができる。例えば、それは、低分子RNAによって調節されるか、またはDNAまたはmRNAのいずれかのいずれかと抗生物質耐性遺伝子の標的を検出するための細胞機能を研究するためにこの方法を使用することが可能であるべきである。プレamplicationは、低コピー数で存在するターゲットを検出する必要があり得る。また、RNA分解酵素阻害剤は、潜在的に不安定なRNA標的の劣化を防止するために、試料調製中に添加されるべきである。
この方法は、細菌を検出し、同定する他の方法に比べていくつかの利点を有する。標準的な臨床微生物学方法が識別方法の定量およびアプリケーションのための寒天培地上に細菌の増殖を必要とする。目に見えるコロニーへの細菌の増殖は、一般的関与一晩のインキュベーション、大幅に検体採取から結果の報告までの時間を遅らせる。電気化学バイオセンサー9を含む病原体の検出のより迅速な、分子的方法の開発に大きな関心があります。しかし、ほとんど注意が生の生体試料中のDNAバイオセンサーの性能に与えられている。ここで説明する電気化学センサアッセイは、感度7の有意な損失なし血清および尿試料上で直接行うことができる。ここで説明するチオール捕捉プローブと混合単分子膜の使用は、血清または尿10を含む生の生物試料における感度を維持し、非特異的タンパク質吸収にセンサー表面耐性をレンダリングします。 （ミリリットル当たり250細菌）センサーあたり1細菌の細胞のように、いくつかは、PCR増幅技術1の感度に匹敵する、検出可能である。いくつかのPCRに基づく細菌の同定方法は、11 1に記載されている2。 PCRは、潜在的に電気化学センサアッセイはここで説明するよりも少ない標的分子を検出することができますが、PCRベースの方法は、標準的な臨床微生物学の方法に比べて、高いため、機器の取得及び/又は試薬コストの限られた採用を実現しました。対照的に、電気化学センサが生産するのに比較的安価である。電極は、金スパッタ法により作製されていても、電極の厚さは1,000オングストロームのみであるため、チップあたりの金の量が少ない。
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Disclosures
すべての著者は説明した方法に関連する特許に関する発明である。これらの特許の一つはQvella株式会社にライセンス供与されています。 BMCとDAHはQvella株式会社の持分を持っている。 VGは、電気化学センサアレイチップのメーカーですGeneFluidicsの社長、チップマウント、そして本稿で述べたチップリーダーです。
Acknowledgments
本研究では、アレルギーと国立感染症研究所からと小児泌尿器科研究の卓越性のためのウェンディとケンルビー基金協力協定賞AI075565（DAHに）によってサポートされていました。 BMCは、小児泌尿器科でジュディスとロバート·ウィンストンの椅子です。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-mercapto-1-hexanol (MCH) | Sigma | 451088 | Store at room temperature |
| 1,6-hexanedithiol (HDT) | Sigma | H-12005 | Store at room temperature |
| Thiolated capture probes | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
| Fluorescein-modified detector probes | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
| Bridging Oligonucleotide | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
| Anti-Fluorescein-HRP, Fab fragments | Roche | 11 426 346 910 | Store at 4 °C |
| Helios Chip Reader | GeneFluidics | GFR-2009 | |
| Sensor Chip Mount | GeneFluidics | GFR-003 | |
| Film well sticker | GeneFluidics | Shipped with sensor chips | |
| Bare gold 16-sensor array chips | GeneFluidics | SC1000-16X-B | Store in 100% N2 at room temperature |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | Store at 4 °C |
| 1M Phosphate Buffer, pH 7.2 | 0.35M NaH2PO4, 0.65M K2HPO4, adjusted to pH 7.2 | ||
| Blocker Casein in PBS | Pierce | 37528 | Dilute with an equal volume of 1M Phosphate Buffer, pH 7.2, store at 4 °C |
| Table 1. Reagents and Equipment. | |||
References
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