Summary
우리는 빠른 세균 검출 및 식별을 위해 전기 센서 분석 방법을 설명합니다. 분석은 리보솜 RNA (rRNA의) 종의 특정 시퀀스 DNA 올리고 뉴클레오타이드 캡처 프로브 작용 센서 어레이를 포함한다. 캡처 프로브와 고추 냉이 과산화 효소 연결된 DNA 올리고 뉴클레오타이드 검출기 프로브 대상 rRNA의의 샌드위치 하이브리드는 측정 전류 측정 전류를 생성합니다.
Abstract
전기 센서가 널리 혈당의 신속하고 정확한 측정을 위해 사용되며, 분석의 다양한 검출에 적용 할 수 있습니다. 전기 센서는 유용한 전기 신호로 생물학적 인식 이벤트를 transducing에 의해 작동합니다. 신호 전달은 전류 측정 전극에 산화 환원 효소의 활동을 결합하여 발생합니다. 센서의 특이성은 고유의 효소의 특성, 포도당 센서의 경우 포도당 산화 효소 또는 효소 항체 또는 프로브 사이의 결합의 산물 중 하나입니다.
여기, 우리가 직접 감지하고 박테리아를 식별하는 전기 센서 분석 방법을 설명합니다. 모든 경우에, 여기에 설명 된 프로브 DNA 올리고 뉴클레오티드이다. 이 방법은 대상 리보솜 RNA (rRNA의)를 캡처 및 검출기 프로브 샌드위치 하이브리드를 기반으로합니다. 검출기 프로브가 시간에 연결되어있는 동안 포획 프로브는 센서 표면에 고정되어orseradish 퍼 옥시 데이즈 (HRP). 같은 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine (TMB)와 같은 기판 표면에 결합 캡처 표적 탐지기 단지와 전극에 추가되면, 기판은 HRP에 의해 산화 작업 전극에 의해 감소된다. 전극에 전류 흐름을 생산, 전극에서 HRP의 기질에 의해 전자의 왕복이 산화 환원 사이클 결과.
Introduction
세균 검출 및 식별을위한 표적 분자로 rRNA를 사용하면 장점을 가지고 있습니다. 박테리아 세포의 rRNA의의 풍부한 대상 증폭 1 필요없이 밀리리터 당 250 박테리아의 낮은 민감도 제한을 제공합니다. 세균성 rRNA의가 DNA 프로브와 하이브리드 액세스 할 수있는 고유 한 종의 특정 시퀀스를 포함하고 있습니다. 따라서, 전기 센서 배열은 각 센서가 다른 종의 특정 캡처 프로브 기능화되어 알 수없는 박테리아를 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 양성 대조군 센서는 "다리"캡처 및 검출기 프로브 내부 교정 신호를 생성 할 수있는 합성 올리고 뉴클레오티드 대상에 대해 포함되어야한다.
전기 센서는 기본 및 translational 연구 애플 리케이션의 넓은 범위가 있습니다. 예를 들어, 분석은 정확하게 E.의 효과를 측정하기 위해 여기에 설명 된 사용되었습니다 RRN에서 대장균의 성장 단계세균 생리학 2에 관심있는 연구자들에게 큰 관심입니다 및 사전 rRNA의 사본 번호. 전기 센서 분석의 감도는 노이즈 비율로 신호에 의해 결정됩니다. 신호 증폭 및 소음 감소 방법의 다양한 탐구되었다. 우리는 센서 표면의 화학적 성질을 개선하는 검출기 프로브 및 / 또는 HRP 효소의 비특이적 결합을 줄이는 열쇠는 사실을 알게 될 것입니다. 특히, alkanedithiols 및 mercaptohexanol의 혼합 단층이 대상 하이브리드 3 캡처 프로브의 접근성을 유지하면서 더 완전 전극 표면을 커버하여 배경을 줄이기 위해 발견되었습니다. 이러한 표면 화학 처리는 복잡한 생물 학적 샘플을 포함하는 분석에 특히 중요하다.
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Protocol
1. 전기 화학 센서의 작용
- 300 μM에서 0.05 μM의 농도에서 thiolated 캡처 프로브를 준비하는 1,6 - hexanedithiol (HDT), 10 MM 트리스 - HCL, pH를 8.0, 0.3 M의 NaCl, 10 분 동안 상온에서 어둠 속에서 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 부화 . HDT와 thiolated 캡처 프로브의 배양 더 일관성있는 결과의 결과로, 포획 프로브의 티올 그룹이 감소되도록합니다.
- 수분 및 / 또는 미립자를 제거하기 위하여 5 초 동안 노출 된 금 16 센서 어레이 칩 (들)에 질소 스트림을 적용합니다.
- 센서 배열의 모든 16 센서의 작동 전극에 HDT-thiolated 캡처 프로브 믹스의 6 μl를 적용하고 4 ° C 하룻밤에 덮여 페트리 접시에 센서 칩 (들)을 저장합니다. Thiolated 캡처 프로브는 벌거 벗은 금 전극에 직접 바인딩 및 HDT는 캡처 프로브의 내용물을 과도을 방지하고 목표 하이브리드을 촉진 확장 된 형태에서 그들을 유지하는 역할을합니다.
- 날 따라 5 초 동안 질소의 흐름에 따라 2 ~ 3 초 건조를위한 이온 H 2 O와 센서 칩을 씻는다.
- 10 MM 트리스 - HCL, pH를 8.0, 0.3 M의 NaCl, 1 mM의 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1 mM의 16 개 센서와 50 분 동안 부화의 작업 전극 6 메르 캅토-1-헥산 (MCH)의 6 μl를 적용합니다. 이 이후의 모든 센서 칩에서 incubate은 상온에서 적용 페트리 접시에서 수행됩니다. MCH는 thiolated 캡처 프로브 또는 HDT가 전극 표면에 존재하지 않는 틈새를 채우는 차단제 역할을합니다.
2. 샘플 준비
- 5 분 16,000 XG에 microcentrifuge 관 및 원심 분리기 성장의 로그 단계 (≈ 0.1 OD 600)에서 세균성 문화의 1 ML을 전송합니다. 배양 상청액을 제거합니다. 박테리아 펠렛은 즉시 처리 또는 -80 ° C 나중에 사용하기 위해 저장할 수 있습니다.
- 철저 봇에 피펫 팁을 적용하여 1 M NaOH를 10 μL에서 박테리아 펠렛을 resuspend을microcentrifuge 관 및 여러 번 위아래로 피펫의 탐. 5 분 상온에서 현탁액을 품어.
- 1 M 인산 버퍼, 산도 7.2의 50 μl를 추가 형광 - 수정 검출기 프로브의 2.5 % 소 혈청 알부민 (BSA)와 0.25 밀리미터를 포함하여 세균 해물을 중화. 실온에서 10 분 동안 중화 해물을 품어. 형광 - 수정 검출기 프로브는 세균성 rRNA의 대상 분자 잡종.
3. 전기 센서 분석
- 5 초 질소의 흐름에 따라 2 ~ 3 초 건조를위한 이온 H 2 O와 센서 칩에서 MCH를 씻으십시오.
- 14 각 센서의 작동 전극에 중화 세균 해물 4 μl를 적용하고 15 분 동안 품어. 대상 검출기 프로브 컴플렉스 고정 thiolated 캡처 프로브에 잡종.
- 2.5 % BSA 및 0.25 &를 포함, 1 M 인산 버퍼, 산도 7.2 올리고 뉴클레오티드를 브리징 1 nm의 4 μl를 적용MU, M 형광 - 수정 검출기 프로브 2 개의 긍정적 인 제어 센서 (신호 정상화를 위해 사용되는) 15 분 동안 부화.
- 5 초 질소의 흐름에 따라 2 ~ 3 초 건조를위한 이온 H 2 O와 센서 칩을 씻으십시오.
- 1 M 인산 버퍼, 산도 7.2에서 0.5 U / ㎖ 방지 형광-HRP 4 μl를 적용 16 개 센서의 작동 전극에 0.5 %의 카제인을 함유하고 15 분 동안 품어. 안티 - 형광-HRP가 고정화 된 형광 - 수정 검출기 프로브에 바인딩합니다.
- 5 초 질소의 흐름에 따라 2 ~ 3 초 건조를위한 이온 H 2 O와 센서 칩을 씻으십시오.
- 센서 칩 마운트에 센서 칩과 부하의 표면에 잘 필름 스티커를 적용합니다. 피펫 50 16 개 센서 위에 TMB 기질 ㎕의 센서와 칩 마운트를 닫습니다.
- 헬리오스 칩 리더를 사용하는 모든 16 센서 전류 측정과 순환 전압 전류 법 측정을 얻습니다. 전류 측정 전류는 TMB R의 속도에 비례센서 표면에 배기관 (그림 1 참조).
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Representative Results
우리는 샌드위치 ELISA와 유사하게 구성되어 전기 화학적 분석을 설명합니다. 그림 1, 검출기 프로브에 3 '형광 결합에 바인딩 방지 형광 항체 단편을 결합 HRP에 의해 촉매 산화 환원 반응에 의해 개발 캡처 및 검출기 프로브를 대상 리보솜 RNA (rRNA의) 하이브리드에 표시. 분석 감도의 중요한 구성 요소는 금 전극의 표면 화학입니다. 우리는 thiolated 캡처 프로브, mercaptohexanol 및 hexanedithiol로 구성된 삼원 단층이 크게 리포터 단백질 3의 결합 특이성 배경을 줄임으로써 신호 대 잡음 비율을 향상 것으로 나타났습니다. 분석은 그림 2에서와 같이 GeneFluidics 16 센서 어레이 칩을 채택 여기서 설명했다. 배열에있는 각 센서는 칩 4의 가장자리에 접점이 세 개의 전극, 작업, 참조 및 보조가 포함되어 있습니다. 칩 읽기어은 접촉 각 점과 연결 포고 핀을 가지고 있습니다. 칩 판독기는 컴퓨터 알고리즘에 의해 제어 전위차계 센서 어레이에 대한 인터페이스 역할을합니다.
전기 센서 전류 흐름의 예는 그림 3에 나와 있습니다. 전류 측정 측정 독자 알고리즘을 시작하는 센서 표면에 TMB의 응용 프로그램에서 시간 동안 때문에 산화 기판의 축적 시작 후 센서의 현재 흐름은 처음 몇 초 동안 인위적으로 높다. 현재의 흐름은 빠르게 정상 상태에 도달하고 정확한 센서 판독 값이 안정적으로 육십초에서 얻을 수 있습니다. 센서 분석은 일반적으로 센서 변화에 대한 내부 통제로 복제에서 수행됩니다. 우리는 센서와 센서 변동성이 상대적으로 일정하다, 그래서 16 센서 어레이 칩 GeneFluidics에 병렬로 16 가지 센서 분석을 수행하는 것이 가능하다는 것을 발견했다. 긍정적이고 부정적인 컨트롤 에센 있습니다재판. 양성 대조군으로, 우리는 캡처 및 검출기 프로브를 모두 교배 알려진 농도의 합성 대상으로 제공하는 합성 "가교"DNA 올리고 뉴클레오타이드 (가) 있습니다. 이 방법에서는, 결과는 칩 - 투 - 칩 변동을 최소화하기 위해 내부 교정 컨트롤과 가교 올리고 뉴클레오티드 함수를 사용하여 얻었다.
캡처 및 검출기 프로브를 테스트 할 때, 검출 한계는 알려진 농도의 시료 용액을 희석에 의해 결정되어야한다. 그림 4에서와 같이 시료의 농도와 분석의 동적 범위 신호 출력 사이의 선형 로그 로그 상관 관계가있다. 검출 한계는 배경 신호 5의 평균보다 3.29 표준 편차 큰 신호를 생성하는 데 필요한 대상의 농도로 정의됩니다. 미지 시료에있는 박테리아의 식별을 위해, 관련 캡처 및 검출기 프로브 쌍의 패널이 선택됩니다. 프로브의 선택 I의 샘플의 특정 유형에 의심 박테리아의 종류에 의해 결정됩니다. 물론, 비정상적인 박테리아는 때때로 모든 샘플에서 찾을 수 있습니다, 그래서 우리는 eubacterial 프로브 쌍은 어떤 박테리아의 보존 rRNA의 지역에 교배 할 수있는 능력을 가지고 포함하는 것이 좋습니다. 그림 5 E.를 포함하는 시료에 대한 대표적인 결과를 보여줍니다 대장균 및 K. 자주 요로 감염 환자의 소변에서 발견되는 폐렴. 센서의 대부분의 신호는 낮은 유사합니다, 이러한 부정적인 결과는 배경 신호로 풀링 할 수 있습니다.
그림 1. 전기 센서 분석의 개략도. 금 전극은 mercaptohexanol 및 hexanedithiol 코팅 및 thiolated DNA 올리고 뉴클레오타이드 캡처 프로브 (파란색)의 추가에 의해 작용된다. 샌드위치 HDNA 올리고 뉴클레오타이드 캡처 프로브 및 형광 표지 된 DNA 올리고 뉴클레오타이드 검출기 프로브를 대상 16S의 rRNA의의 ybridization (적색), 안티 플루의 추가에 의해 감지되는 복잡한 결과 - 고추 냉이 퍼 옥시 데이즈 (HRP) 결합 및 TMB 기질. 전류 측정 전류는 산화 환원 사이클에 의해 생성되는 HRP 및 전극에서 전자로 TMB의 환원에 의한 TMB의 산화 결과.
그림 2. . 중앙 작업 전극, 원주 기준 전극과 신호 안정화를위한 보조 전극 : 세균 식별 센서 어레이 및 칩 마운트 배열의 각 센서는 세 개의 전극으로 구성되어 있습니다. 배열의 각 센서의 작동 전극은 우리로 (표 3 참조) 그 세균 종에 대한 특정 캡처 프로브의 패널 작용하는 모든 세균의 16S rRNA의의 분자와 BrOl "가교"올리고 뉴클레오타이드 신호 보정을위한 긍정적 인 컨트롤과 그 기능에 교배 EU (eubacterial) 포획 프로브와 같은거야. 신호 포고 핀 칩 판독기에 배열을 배치하여 측정하는 센서 전극 접점을 가진 인터페이스를 제공합니다.
그림 3. 측정시 전류 측정 전류 출력. 전류 측정 전류는 배열의 모든 16 센서를 병렬로 측정됩니다. 현재의 흐름은 처음에 의한 이전의 칩 리더로 배열을 연결하고 측정을 시작하는 산화 TMB 기질의 축적에 매우 부정적이다. 그 후, 전류가 빠르게 안정 및 센서 판독 값은 60 초에 기록됩니다. 더 큰 음의 전류와 전극이 가장 높은 신호가있다.
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그림 4. E. 직렬 배로 희석 검출 한계를 결정하는 대장균. 센서는 E의 농도를 알고있는 일련 배로 희석과 중복에서 테스트되었습니다 대장균 해물. 관찰 된 신호 판독, 검은 원으로 그려진 이상적인 신호 곡선을 예측하는 데 사용되었다. 모두를위한 합동 표준 편차 복제 및 낮은 목표 농도에서 배경 신호가 배경에 3.29 표준 편차로 정의 탐지 (파란색 선)의 한계를 계산하는 데 사용되었다.
그림 5. 대장균과 폐렴 간균. E.에 대한 대표적인 전기 센서 분석 결과 대장균 및 K. pneumonIAE는 표 2와 3에 설명 된 프로브 쌍 반응에 대한 검사를했다. KE 프로브 쌍 반응성 K. 구별 E.에서 폐렴 대장균. 가교 올리고 뉴클레오티드 (BrOl)은 양성 대조군과 내부 표준 용액으로 사용됩니다.
| 프로브 이름 | 리보솜 소단위와 위치 * | 순서 |
| 10m KE 캡 | 16S 74 | 5'-S-AGCTCTCTGT |
| KE Det에 11m | 16S 63 | 5'-GCTACCGYTCG-F |
| EK 캡 15m | 23S 1492 | 5'-AGCCTTGATTTTCCG-S |
| EK Det에 15m | 23S 1507 | 5'-F-TCGTCATCACACCTC |
| EL 모자 17m | 23S 1507 | 5'-AGCGTTAAAAGGTACCG-S |
| EL 모자 18m | 23S 1507 | 5'-AGCGTTAADAAGGTACCG-S |
| EL Det에 15m | 23S 1492 | 5'-F-TCGTCATCACACCTC |
| EB 캡 23m | 16S 1275 | 5'-S-ACTTTATGAGGTCCGCTTGCTCT |
| EB Det에 23m | 16S 1252 | 5'-CGCGAGGTCGCCTTCCTTTGTAT-F |
| PM 캡 15m | 16S 183 | 5'-S-TTTGGTCCGTAGACA |
| PM Det에 17m | 16S 166 | 5'-TTATGCGGTATTAGCCA-F |
| PA 캡 11m | 16S 453 | 5'-S-ACTTACTGCCC |
| 14m PA Det에 | 16S 439 | 5'-TTCCTCCCAACTTA-F |
| EU GN 캡 19m | 16S 1502 | 5'-S-GTTCCCCTACGGTTACCTT |
| EU Det에 18m | 16S 1484 | 5'-GTTACGACTTCACCCCAG-F |
| EU BrOl 37m | 5'-CTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAACCGTAGGGGAAC |
표 2. DNA의 올리고 뉴클레오티드 프로브 쌍 시퀀스. 캡처 (모자) 프로브는 티올 연계 (S)로 합성된다. 검출기 (Det에) 프로브는 형광 (F) 수정을 합성한다. 프로브 쌍 5'-thiolated 캡처 프로브와 3'-형광 - 수정 검출기 프로브 또는 3'-thiolated 캡처 프로브와 5'-형광 - 수정 검출기 프로브 중 하나를 포함합니다. 두 개의 EL 캡처 프로브를 사용하기 전에 혼합한다. 분석을 단순화하기 위해, 검출기 프로브는 교차 반응성 의미없는 혼합물로 각 센서에 적용 할 수 있습니다. KE - 간균 및 엔테로, EK - 대장균 및 K. 폐렴, EL - E. 배설강, EB - 장내 세균 가족, PM - P. mirabilis의, PA - P. 녹농균, EU - Eubacterial, BrOl - 브리지 올리고 뉴클레오티드. * - 위치 N진한 갈색의 16S 또는 23S 유전자의 시작까지의 거리를 말합니다.
| 세균 종 | 반응 프로브 쌍 |
| 대장균 | EK + EB |
| 폐렴 간균 | KE + EK + EB |
| 프로 테우스 mirabilis의 | PM + EB |
| 녹농균 | PA |
| 엔테로 종 | KE + EB 또는 EL + EB 또는 KE + EL + EB |
표 3. 프로브 쌍으로 세균 종의 인식.
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Discussion
여기에 설명 된 전기 센서 분석은 핵산 표적을 신속하게 탐지 할 수 있습니다. 민감도와 특이도가 차례로 길이 캡처 및 검출기 프로브의 GC 내용에 따라 대상 프로브 하이브 리다이 제이션의 자유 에너지에 부분적으로 의존한다. 우리는 일반적으로 주위 온도 (~ 20 ° C) 5, 6에서 하이브리드 단계를 수행하십시오. 그러나 하이브리드 단계 (3.2, 3.3)는 칩이 포함 된 커버 챔버에 배치됩니다 경우 하이브리드 오븐 높은 온도에서 수행 증발 7, 8을 방지하기 위해 여과지를 적신 할 수 있습니다. 최적의 신호는 하이브리드 사이트 8 사이의 간격없이 핵산 대상에 인접한 사이트에 잡종을 포착 검출기 프로브 쌍을 얻을 수있다. 이 신호 향상은 스택베이스 쌍으로와 "도우미 조사"효과로 알려진 인접한 지역의 하이브리드 접근성을 증가시켜 작업 할 생각된다. 캡처 검출기 PROB인접 사이트에 전자 하이브리드는 rRNA의 대상 5의 분열에 박테리아 결과 알칼리 용해하기 때문에 중요하다. 이 방법은 임상 및 연구 애플 리케이션의 광범위한 다양한, RNA 또는 DNA 목표 중 하나 탐지에 적용 할 수 있습니다. 예를 들어 그것은 작은 RNA를 의해 규제 또는 하나 DNA 나 mRNA의 하나로 항생제 내성 유전자 표적을 감지하는 세포의 기능을 연구하기 위해이 방법을 사용하는 것이 가능해야한다. 사전 amplication 낮은 사본 번호에 존재 표적을 탐지 할 필요가있다. 또한, RNA 분해 효소 억제제는 잠재적으로 불안정한 RNA 표적의 저하를 방지하기 위해 시료 준비 중에 추가해야합니다.
이 방법은 박테리아를 검출하고 확인하는 다른 방법에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 표준 임상 미생물학 방법은 식별 방법의 정량 및 응용 프로그램에 대한 한천 배지에 박테리아의 성장을 필요로합니다. 볼 식민지 박테리아의 성장은 일반적으로 포함하룻밤 배양은 상당히 결과의보고에 표본 컬렉션에서 시간을 지연. 전기 바이오 센서 9 등 병원체 검출의 더 빠른, 분자 방법 개발에 큰 관심이 있습니다. 그러나 약간의 관심은 원시 생물학적 샘플에서 DNA 바이오 센서의 성능을 제공하고있다. 전기 센서 분석은 여기에 설명 된 민감도 7의 상당한 손실없이 혈청과 소변 시료에서 직접 수행 할 수 있습니다. thiolated 캡처 프로브 및 여기서 설명하는 혼합 된 단층의 사용은 혈청 또는 소변 10 등의 원시 생물 표본 감도를 유지, 비 특정 단백질 흡수에 저항 센서 표면을 렌더링합니다. 센서 당 세균 세포 (밀리리터 당 250 균) 등의 몇 가지 감지이기 때문에, 이는 PCR 증폭 기술 (1)의 민감도 비교입니다. 여러 가지 PCR 기반의 세균 식별 방법 11 1 기술되었다2. PCR은 잠재적으로 전기 센서 분석이 여기에 설명 된 것보다 적은 표적 분자를 검출 할 수 있지만, PCR 기반의 방법이 높기 때문에 장비 획득 및 표준 임상 미생물학 방법에 비해 / 또는 시약 비용의 제한 도입을 달성했다. 반면, 전기 센서는 생산 상대적으로 저렴합니다. 전극은 금 스퍼터링에 의해 제조 된 경우에도 전극의 두께는 1,000 옹스트롬 때문에 칩 당 금의 양이 낮습니다.
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Disclosures
모든 저자는 설명 된 방법에 관련된 특허에 발명자이다. 이들 특허 중 하나가 Qvella 법인 허가되었습니다. BMC와 DAH는 Qvella 회사의 지분이 있습니다. VG는 전기 센서 어레이 칩의 제조 업체입니다 GeneFluidics 회장, 칩 마운트, 그리고이 문서에 설명 된 칩 리더입니다.
Acknowledgments
본 연구는 알레르기 및 전염병 국립 연구소의 협력 계약 상 AI075565 (DAH)로 의해 웬디와 소아 비뇨기과 연구의 우수 켄 루비 기금에 의해 지원되었다. BMC는 주디스와 소아 비뇨기과 로버트 윈스턴 의자입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-mercapto-1-hexanol (MCH) | Sigma | 451088 | Store at room temperature |
| 1,6-hexanedithiol (HDT) | Sigma | H-12005 | Store at room temperature |
| Thiolated capture probes | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
| Fluorescein-modified detector probes | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
| Bridging Oligonucleotide | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
| Anti-Fluorescein-HRP, Fab fragments | Roche | 11 426 346 910 | Store at 4 °C |
| Helios Chip Reader | GeneFluidics | GFR-2009 | |
| Sensor Chip Mount | GeneFluidics | GFR-003 | |
| Film well sticker | GeneFluidics | Shipped with sensor chips | |
| Bare gold 16-sensor array chips | GeneFluidics | SC1000-16X-B | Store in 100% N2 at room temperature |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | Store at 4 °C |
| 1M Phosphate Buffer, pH 7.2 | 0.35M NaH2PO4, 0.65M K2HPO4, adjusted to pH 7.2 | ||
| Blocker Casein in PBS | Pierce | 37528 | Dilute with an equal volume of 1M Phosphate Buffer, pH 7.2, store at 4 °C |
| Table 1. Reagents and Equipment. | |||
References
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