Summary
Descreve-se um método de ensaio de sensor electroquímico para a detecção bacteriana rápida e identificação. O ensaio envolve uma matriz de sensores funcionalizada com as sondas de DNA para o RNA de captura de oligonucleótidos (rRNA) sequências específicas das espécies ribossomal. Sandwich de rRNA alvo de hibridação com a sonda de captura e uma sonda detectora de peroxidase de rábano ligada ao oligonucleótido de DNA produz uma corrente mensurável amperométrica.
Abstract
Os sensores electroquímicos são amplamente usados para a medição rápida e precisa da glucose sanguínea e pode ser adaptado para a detecção de uma ampla variedade de analitos. Sensores eletroquímicos operam por transdução de um evento de reconhecimento biológico em um sinal elétrico útil. A transdução do sinal ocorre por acoplamento a actividade de uma enzima de redox a um eléctrodo amperométrico. Especificidade do sensor ou é uma característica inerente da enzima, oxidase de glucose, no caso de um sensor de glicose, ou um produto de ligação entre a enzima e um anticorpo ou sonda.
Aqui, descrevemos um método de ensaio sensor eletroquímico para detectar diretamente e identificar bactérias. Em todos os casos, as sondas aqui descritas são oligonucleótidos de ADN. Este método é baseado na hibridização sanduíche de captura e detector sondas com alvo ribossomal RNA (rRNA). A sonda de captura é ancorada à superfície do sensor, enquanto que a sonda é ligada ao detector de horseradish peroxidase (HRP). Quando um substrato, tal como 3,3 ', 5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) é adicionada a um eléctrodo com complexos de captura-alvo de detectores ligados à sua superfície, o substrato é oxidado por HRP e reduzido pelo eléctrodo de trabalho. Este ciclo redox resultados em vaivém de elétrons pelo substrato do eletrodo para HRP, produzindo o fluxo de corrente no eletrodo.
Introduction
Usando rRNA como uma molécula alvo para a detecção e identificação de bactérias tem um número de vantagens. A abundância de rRNA em células bacterianas estabelece um limite de sensibilidade tão baixo como 250 bactérias por mililitro, sem a necessidade de amplificação de um alvo. RRNA bacteriano contém seqüências específicas de espécies únicas que são acessíveis a hibridização com sondas de DNA. Consequentemente, uma série de sensores electroquímicos podem ser usadas para identificar as bactérias desconhecidos, em que cada sensor é funcionalizada com uma sonda de captura específica da espécie diferente. Sensores de controlo positivo deve ser incluído para um alvo oligonucleotídeo sintético que "pontes" a captura e sondas de detecção para criar um sinal de calibração interno.
Os sensores electroquímicos têm uma ampla gama de aplicações de pesquisa básica e translacional. Por exemplo, o ensaio aqui descrito foi usado para medir com precisão o efeito da E. coli em fase de crescimento RRNA e números de cópias pré-rRNA, que é de grande interesse para pesquisadores interessados em fisiologia bacteriana 2. A sensibilidade do ensaio sensor electroquímico é determinado pela relação sinal-ruído. Uma variedade de métodos de amplificação de sinal e de redução do ruído ter sido explorado. Descobrimos que a melhoria da química da superfície do sensor é essencial para reduzir a ligação não específica da sonda detectora e / ou enzima HRP. Em particular, numa monocamada mista de alkanedithiols e mercaptohexanol foi encontrada para reduzir o fundo, cobrindo a superfície do eléctrodo de forma mais completa, mantendo a acessibilidade da sonda de captura para a hibridação alvo 3. Estes tratamentos químicos de superfície, são particularmente importantes para os ensaios em amostras biológicas complexas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Funcionalização de sensores eletroquímicos
- Prepare a sonda de captura tiolada a uma concentração de 0,05 mM em 300 mM de 1,6-hexanedithiol (HDT), 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, NaCl 0,3 M, EDTA 1 mM e incubar no escuro à temperatura ambiente durante 10 min . A incubação da sonda de captura tiolado com HDT garante que o grupo tiol na sonda de captura é reduzido, o que resulta em resultados mais consistentes.
- Aplicar uma corrente de azoto a 16 de chip sensor array nua ouro (s) durante 5 segundos para remover a humidade e / ou partículas.
- Aplicar 6 ul da mistura de sondas de captura de HDT-tiolado para o eléctrodo de trabalho de todos os 16 sensores da cortina de sensores e armazenar o chip sensor (es) numa placa de Petri cobertas a 4 ° C durante a noite. Sondas de captura tiolados ligar diretamente para o eletrodo de ouro nu eo HDT age para evitar excesso de embalagem das sondas de captura e mantê-los em uma conformação estendida que promove a hibridação com o alvo.
- Oapós o dia, lavar o chip sensor com H2O desionizada durante 2-3 segundos e seco sob uma corrente de azoto durante 5 seg.
- Aplicar 6 ul de 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,3 M de NaCl, 1 mM de EDTA, 1 mM de 6-mercapto-1-hexanol (MCH) para o eléctrodo de trabalho de todos os 16 sensores e incubar durante 50 min. Esta e todas as incubações subsequentes chips sensores são realizados numa caixa de Petri coberta, à temperatura ambiente. MCH actua como um agente de bloqueio, preenchendo todas as lacunas onde a sonda de captura tiolada ou HDT não está presente na superfície do eléctrodo.
2. Preparação da Amostra
- Transferir 1 ml de uma cultura bacteriana em fase logarítmica de crescimento (DO600 ≈ 0,1) a um tubo de microcentrifugação e centrifugar a 16000 xg durante 5 min. Remover o sobrenadante da cultura. A pelete bacteriana podem ser processados imediatamente ou armazenada a -80 ° C para uso posterior.
- Ressuspender cuidadosamente o sedimento bacteriano em 10 ul de NaOH 1 M aplicando a ponta da pipeta para o bottom do tubo de microcentrífuga e pipetando para cima e para baixo várias vezes. Incubar a suspensão à temperatura ambiente durante 5 min.
- Neutralizar o lisado bacteriano por adição de 50 ul de 1 M de tampão fosfato, pH 7,2, contendo 2,5% de albumina de soro bovino (BSA) e 0,25 mM de uma sonda detectora de fluoresceína modificado. Incubar o lisado neutralizado durante 10 min à temperatura ambiente. Detector de sondas Fluoresceína modificados hibridam com as moléculas-alvo rRNA bacteriano.
3. Sensor eletroquímico Assay
- Lavar o MCH a partir do chip sensor com H2O desionizada durante 2-3 segundos e seco sob uma corrente de azoto durante 5 seg.
- Aplicar 4 ul de ligado bacteriano neutralizada para o eléctrodo de trabalho de cada um dos sensores 14 e incubar durante 15 min. Complexos sonda-alvo detector de hibridizar imobilizadas sondas de captura tiolados.
- Aplicar 4 pi de 1 nM de extrapolação oligonucleótido em 1 M de tampão fosfato, pH 7,2, contendo 2,5% de BSA e 0,25 μ M fluoresceína modificado sonda detectora de dois sensores de controlo positivo (utilizados para a normalização do sinal) e incubar durante 15 min.
- Lavar o chip sensor com H2O desionizada durante 2-3 segundos e seco sob uma corrente de azoto durante 5 seg.
- Aplicar 4 ul de 0,5 U / mL de anti-fluoresceína-HRP em 1 M de tampão fosfato, pH 7,2, contendo 0,5% de caseína para o eléctrodo de trabalho de todos os 16 sensores e incubar durante 15 min. O anti-fluoresceína-HRP liga-se às sondas imobilizadas detector fluoresceína modificados.
- Lavar o chip sensor com H2O desionizada durante 2-3 segundos e seco sob uma corrente de azoto durante 5 seg.
- Aplicar uma camada bem adesivo na superfície do chip sensor e montagem de carga para o chip sensor. Pipetar 50 ml de substrato TMB em todos os 16 sensores e feche a montagem chip sensor.
- Obter amperometria e medidas de voltametria cíclica para todos os 16 sensores usando o Helios Leitor Chip. Corrente amperométrica é proporcional à taxa de TMB redução na superfície do sensor (veja a Figura 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Descreve-se um doseamento electroquímico que é estruturado de forma semelhante a uma sanduíche de ELISA. Como mostrado na Figura 1, a hibridação de ARN alvo ribossomal (ARNr), com as sondas de captura e detector é desenvolvido por uma reacção redox catalisada por HRP conjugado com fragmentos de anticorpo anti-fluoresceína que se ligam à extremidade 3 'de fluoresceína de ligação na sonda do detector. Um componente importante da sensibilidade do ensaio é a química da superfície do eléctrodo de ouro. Descobrimos que uma monocamada ternário consistindo de sondas de captura, tiolados mercaptohexanol e hexanedithiol melhora significativamente a relação sinal-ruído, reduzindo a ligação da proteína repórter 3 fundo inespecífico. Os ensaios aqui descritos empregam uma matriz de sensores de 16 chips GeneFluidics mostrado na Figura 2. Cada um dos sensores da matriz contêm três eléctrodos de trabalho, referência e auxiliares, que têm pontos de contacto na extremidade do chip 4. O chip de lerer tem pinos pogo que se conectam com cada um dos pontos de contato. O leitor de chip serve como uma interface para a matriz de sensores com um potenciómetro controlado por um algoritmo do computador.
Exemplos de fluxo da corrente do sensor electroquimico são mostrados na Figura 3. O fluxo de corrente nos sensores é artificialmente elevada durante os primeiros segundos depois de começar as medições amperométricas por causa da acumulação de substrato oxidado durante o tempo de aplicação da TMB com a superfície do sensor de iniciar o algoritmo leitor. O fluxo de corrente atinge rapidamente um estado estacionário e as leituras dos sensores exactos pode ser obtido com segurança dentro de sessenta segundos. Ensaios de sensores são normalmente realizados em duplicata como um controle interno para a variabilidade sensor. Verificou-se que a variabilidade de sensor para sensor é relativamente constante, de modo que é possível realizar 16 ensaios de sensores diferentes em paralelo sobre os chips GeneFluidics matriz 16 do sensor. Controles positivos e negativos são essencial. Como um controlo positivo, que incluem uma "ponte" oligonucleótido de ADN sintético que hibrida com ambas as sondas de captura e detector e serve como um alvo sintético de concentração conhecida. Deste modo, os resultados obtidos utilizando as funções de extrapolação de oligonucleótidos como um controlo interno de calibração para minimizar a variação de chip para chip.
Ao testar as sondas de captura e de detecção, o limite de detecção deve ser determinada por diluição em série de uma amostra de concentração conhecida. Como mostrado na Figura 4, há uma correlação log-log linear entre a concentração de amostra e de saída de sinal em toda a gama dinâmica do ensaio. O limite de detecção é definido como a concentração do alvo requerida para gerar um sinal que é 3,29 desvios padrão maior do que a média dos sinais de fundo 5. Para a identificação de bactérias numa amostra desconhecida, um painel de captura relevante e pares de sondas de detecção são seleccionados. A escolha das sondas is determinadas pelos tipos de bactérias suspeitas num tipo particular de amostra. Claro que, as bactérias usuais podem ocasionalmente ser encontrado em qualquer amostra, por isso, recomendado que um par de sonda eubacteriana ser incluído que tem a capacidade de hibridar com regiões conservadas do rRNA de qualquer bactéria. Figura 5 mostra resultados representativos para as amostras contendo E. coli e K. pneumoniae, que são freqüentemente encontrados na urina de pacientes com infecção do trato urinário. Os sinais para a maior parte dos sensores será baixa e semelhantes, e estes resultados negativos podem ser combinadas, como o sinal de fundo.
Figura 1. Diagrama esquemático do ensaio sensor electroquímico. O eléctrodo de ouro revestido com mercaptohexanol e hexanedithiol e funcionalizado tiolados por adição de sondas de captura de oligonucleótidos de DNA (azul). Sandwich hybridization do 16S rRNA alvo com a sonda de captura e uma sonda de oligonucleótido de DNA detector de oligonucleótido de DNA marcado com fluoresceína (vermelho), resulta em um complexo que é detectada por adição de anti-fluoresceina - peroxidase de rábano (HRP) e o substrato TMB. Corrente amperométrica é gerado pelo ciclo redox que resulta da oxidação da HRP e TMB por redução de TMB pelos electrões a partir do eléctrodo.
Figura 2. . Bacteriana matriz de sensores de identificação e montagem de chip Cada sensor na matriz é composta por três eletrodos: um eletrodo de trabalho central, um eletrodo de referência circunferencial e um eletrodo auxiliar para a estabilização do sinal. Os eléctrodos de trabalho de cada sensor da matriz são funcionalizadas com um painel de sondas de captura específico para as espécies bacterianas de interesse (ver Tabela 3), enquanto ll como um (eubacteriana) sonda de captura hibrida com o UE que todas as moléculas de rRNA 16S bacterianas brol e uma "ponte" de oligonucleótidos, que funciona como controlo positivo para a calibração do sinal. O sinal é medido colocando a matriz em um leitor de fichas com pinos de pogo que fazem interface com os pontos de contacto de eléctrodo sensor.
Figura 3. Amperométrica corrente de saída actual durante a medição amperométrica. Medido em paralelo para todos os 16 sensores da matriz. O fluxo de corrente é inicialmente extremamente negativo devido ao acúmulo de substrato TMB oxidado antes de conectar a matriz para o leitor de chip e iniciar a medição. A partir daí, a corrente se estabiliza rapidamente e leituras dos sensores são registrados em 60 seg. Eletrodos com maior corrente negativa têm os maiores sinais.
"Figura 4" src = "/ files/ftp_upload/4282/4282fig4.jpg" />
Figura 4. Série de diluição de dez vezes de E. coli para determinar o limite de detecção. sensores foram testados em duplicado, com diluições de dez vezes em série de uma concentração conhecida de E. coli lisado. As leituras de sinal observados, representados como círculos pretos, foram usadas para prever uma curva de sinal idealizada. O desvio padrão combinado de todas as repetições e o sinal de fundo com o menor concentração alvo foram usadas para calcular o limite de detecção (linha azul), definida como 3,29 desvios padrão sobre o fundo.
Figura 5. Representante de sensores eletroquímicos resultados do ensaio para Escherichia coli e Klebsiella pneumoniae. E. coli e K. pneumoniae foram testadas quanto à reactividade com pares de sondas descritos nas Tabelas 2 e 3. Reatividade com o par sonda KE distingue K. pneumoniae e E. O oligonucleotídeo coli. ponte (brol) serve como controle positivo e padrão de calibração interno.
| Nome Probe | Subunidade ribossômica e Localização * | Seqüência |
| KE Cap 10m | 16S 74 | 5'-S-AGCTCTCTGT |
| KE Det 11m | 16S 63 | 5'-GCTACCGYTCG-F |
| EK Cap 15m | 23S 1492 | 5'-AGCCTTGATTTTCCG-S |
| EK Det 15m | 23S 1507 | 5'-F-TCGTCATCACACCTC |
| EL Cap 17m | 23S 1507 | 5'-AGCGTTAAAAGGTACCG-S |
| EL Cap 18m | 23S 1507 | 5'-AGCGTTAADAAGGTACCG-S |
| EL Det 15m | 23S 1492 | 5'-F-TCGTCATCACACCTC |
| EB Cap 23m | 16S 1275 | 5'-S-ACTTTATGAGGTCCGCTTGCTCT |
| EB Det 23m | 16S 1252 | 5'-CGCGAGGTCGCCTTCCTTTGTAT-F |
| PM Cap 15m | 16S 183 | 5'-S-TTTGGTCCGTAGACA |
| PM Det 17m | 16S 166 | 5'-TTATGCGGTATTAGCCA-F |
| PA Cap 11m | 16S 453 | 5'-S-ACTTACTGCCC |
| PA Det 14m | 16S 439 | 5'-TTCCTCCCAACTTA-F |
| GN União Cap 19m | 16S 1502 | 5'-S-GTTCCCCTACGGTTACCTT |
| UE Det 18m | 16S 1484 | 5'-GTTACGACTTCACCCCAG-F |
| UE brol 37m | 5'-CTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAACCGTAGGGGAAC |
Tabela 2. Oligonucleotídeos de DNA Sonda Par seqüências. Captura (Cap) sondas são sintetizados com ligações tiol (S). Detector (Det) sondas são sintetizados com fluoresceína (F) modificações. Note-se que pares de sondas envolve quer uma sonda 5'-tiolado de captura e uma sonda detectora de 3'-fluoresceína-modificada ou uma sonda de captura de 3'-tiolada e uma sonda detectora de 5'-fluoresceína-modificado. As duas sondas de captura EL são misturadas antes da utilização. Para simplificar o ensaio, as sondas de detecção pode ser aplicado a cada um dos sensores, como uma mistura, sem reactividade cruzada significativa. KE - Klebsiella e Enterobacter, EK - E. coli e K. pneumoniae, EL - E. cloacae, EB - família Enterobacteriaceae, PM - P. mirabilis, PA - P. aeruginosa, EU - eubacterianas, brol - Bridging oligonucleotídeos. * - Location número refere a distância, desde o início dos genes 16S ou 23S.
| Espécies bacterianas | Pares de sondas reativas |
| Escherichia coli | EK + EB |
| Klebsiella pneumoniae | KE + EK + EB |
| Proteus mirabilis | PM + EB |
| Pseudomonas aeruginosa | PA |
| Espécies Enterobacter | KE + EB ou EL + EB ou KE + EL + EB |
Tabela 3. Reconhecimento de espécies bacterianas por pares de sondas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
O ensaio sensor electroquímico aqui descritos permite uma rápida detecção de alvos de ácido nucleico. Sensibilidade e especificidade dependerá em parte da energia livre de hibridização sonda-alvo, o que por sua vez depende do comprimento e do teor de GC de captura e as sondas de detecção. Normalmente, efectuar os passos de hibridação à temperatura ambiente (~ 20 ° C), 5, 6. No entanto, os passos de hibridação (3.2 e 3.3) também pode ser realizada a temperaturas elevadas num forno de hibridação se o chip é colocado numa câmara contendo cobertos papel de filtro humedecido para evitar a evaporação 7, 8. Sinal óptimo é obtido com pares de sondas de captura de detectores que hibridizam para locais adjacentes no ácido nucleico alvo, sem um espaço entre os sítios de hibridação 8. Este aumento do sinal é pensado para funcionar por base-par empilhamento e pelo aumento da acessibilidade hibridização das regiões adjacentes, conhecida como "sonda helper" efeito. Problemas Capture-detectore hibridação com sítios adjacentes é também importante porque a lise alcalina das bactérias resulta na fragmentação do rRNA alvo 5. Este método pode ser aplicado para a detecção de alvos de ADN ou ARN, ou, com uma vasta variedade de aplicações clínicas e investigação. Por exemplo, deverá ser possível usar este método para estudar as funções celulares que são regulados por pequenos RNAs ou para detectar alvos de genes de resistência aos antibióticos, quer como DNA ou mRNA. Pré-amplificação pode ser necessário detectar alvos presentes em números de cópias baixos. Além disso, os inibidores de RNAse devem ser adicionados durante a preparação da amostra para evitar a degradação do RNA alvos potencialmente instáveis.
Este método possui várias vantagens sobre outros métodos de detecção e identificação de bactérias. Métodos de microbiologia clínica padrão requerem o crescimento bacteriano em meio de agar para a quantificação e aplicação de métodos de identificação. O crescimento de bactérias de colónias visíveis envolve tipicamenteincubação durante a noite, atrasando significativamente o tempo de coleta da amostra para a comunicação dos resultados. Há um grande interesse no desenvolvimento de métodos mais rápidos, moleculares de detecção de patógenos, incluindo biossensores eletroquímicos 9. No entanto, tem sido dada pouca atenção ao desempenho de biossensores de DNA em amostras biológicas primas. O ensaio sensor electroquímico aqui descritos podem ser realizados directamente em amostras de soro e urina, sem uma perda significativa de sensibilidade de 7. O uso de sondas de captura e a monocamada tiolados misto descrito aqui torna a superfície do sensor resistente à absorção de proteína não específica, retendo sensibilidade em amostras biológicas, incluindo matérias-soro ou urina 10. Como poucos como uma célula bacteriana por sensor (250 bactérias por mililitro) são detectáveis, o que é comparável com a sensibilidade das técnicas de amplificação por PCR 1. Vários métodos de identificação de bactérias baseadas em PCR foram descritos 11, 12. Embora a PCR pode potencialmente detectar poucas moléculas alvo do que o ensaio de sensor electroquímico aqui descritos, os métodos baseados em PCR obtiveram aprovação limitada por causa da alta aquisição de equipamento e / ou o custo dos reagentes, em relação a métodos de microbiologia clínica padrão. Em contraste, os sensores electroquímicos são relativamente baratas para produzir. Mesmo que os eléctrodos são fabricados por ouro pulverização, a quantidade de ouro por chip é baixa porque a espessura do eléctrodo é de apenas 1.000 Angstroms.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Todos os autores são inventores em patentes relevantes com os métodos descritos. Uma dessas patentes foi licenciada para Qvella Corporation. BMC e DAH tem participação acionária na Qvella Corporation. VG é o Presidente da GeneFluidics, que é a fabricante do chip matriz de sensores eletroquímicos, montagem de chip e leitor de chip descrito neste artigo.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado pelo Acordo de Cooperação Award AI075565 (a DAH) do Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas e pelo Fundo de Wendy e Ken Ruby for Excellence in Pediatric Urology Research. BMC é a Judith e Robert Winston cadeira de Urologia Pediátrica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-mercapto-1-hexanol (MCH) | Sigma | 451088 | Store at room temperature |
| 1,6-hexanedithiol (HDT) | Sigma | H-12005 | Store at room temperature |
| Thiolated capture probes | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
| Fluorescein-modified detector probes | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
| Bridging Oligonucleotide | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
| Anti-Fluorescein-HRP, Fab fragments | Roche | 11 426 346 910 | Store at 4 °C |
| Helios Chip Reader | GeneFluidics | GFR-2009 | |
| Sensor Chip Mount | GeneFluidics | GFR-003 | |
| Film well sticker | GeneFluidics | Shipped with sensor chips | |
| Bare gold 16-sensor array chips | GeneFluidics | SC1000-16X-B | Store in 100% N2 at room temperature |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | Store at 4 °C |
| 1M Phosphate Buffer, pH 7.2 | 0.35M NaH2PO4, 0.65M K2HPO4, adjusted to pH 7.2 | ||
| Blocker Casein in PBS | Pierce | 37528 | Dilute with an equal volume of 1M Phosphate Buffer, pH 7.2, store at 4 °C |
| Table 1. Reagents and Equipment. | |||
References
- Wu, J., Campuzano, S., Halford, C., Haake, D. A., Wang, J. Ternary Surface Monolayers for Ultrasensitive (Zeptomole) Amperometric Detection of Nucleic Acid Hybridization without Signal Amplification. Anal. Chem. 82, 8830-8837 (2010).
- Halford, C., et al. Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing by Sensitive Detection of Precursor Ribosomal RNA Using a Novel Electrochemical Biosensing Platform. Antimicrob. Agents Chemother. 56, In Press (2012).
- Campuzano, S., et al. Ternary monolayers as DNA recognition interfaces for direct and sensitive electrochemical detection in untreated clinical samples. Biosens. Bioelectron. 26, 3577-3584 (2011).
- Gau, V., et al. Electrochemical molecular analysis without nucleic acid amplification. Methods. 37, 73-83 (2005).
- Patel, M., et al. Target Specific Capture Enhances Sensitivity of Electrochemical Detection of Bacterial Pathogens. J. Clin. Microbiol. 49, 4293-4296 (2011).
- Mastali, M., et al. Optimal probe length and target location for electrochemical detection of selected uropathogens at ambient temperature. J. Clin. Microbiol. 46, 2707-2716 (2008).
- Liao, J. C., et al. Use of electrochemical DNA biosensors for rapid molecular identification of uropathogens in clinical urine specimens. J. Clin. Microbiol. 44, 561-570 (2006).
- Liao, J. C., et al. Development of an advanced electrochemical DNA biosensor for bacterial pathogen detection. J. Mol. Diagn. 9, 158-168 (2007).
- Pedrero, M., Campuzano, S., Pingarron, J. M. Electroanalytical sensors and devices for multiplexed detection of foodborne pathogen microorganisms. Sensors (Basel). 9, 5503-5520 (2009).
- Kuralay, F., Campuzano, S., Haake, D. A., Wang, J. Highly sensitive disposable nucleic acid biosensors for direct bioelectronic detection in raw biological samples. Talanta. 85, 1330-1337 (2011).
- Ecker, D. J., et al. Ibis T5000: a universal biosensor approach for microbiology. Nat. Rev. Microbiol. 6, 553-558 (2008).
- Casalta, J. P., et al. Evaluation of the LightCycler SeptiFast test in the rapid etiologic diagnostic of infectious endocarditis. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 28, 569-573 (2009).
