Summary
Se describe un método de ensayo sensor electroquímico para la detección e identificación bacteriana rápida. El ensayo implica una serie de sensores funcionalizado con sondas de captura de oligonucleótidos de ADN para ARN ribosomal (ARNr) secuencias específicas de la especie. Sandwich hibridación de ARNr objetivo con la sonda de captura y una sonda de oligonucleótido detector de ADN unido a peroxidasa de rábano picante produce una corriente amperométrica medible.
Abstract
Los sensores electroquímicos se utilizan ampliamente para una rápida y precisa medición de la glucosa en la sangre y se pueden adaptar para la detección de una amplia variedad de analitos. Los sensores electroquímicos operan por transducción de un evento de reconocimiento biológico en una señal eléctrica útil. La transducción de señales se produce mediante el acoplamiento de la actividad de una enzima redox a un electrodo amperométrico. Especificidad del sensor es ya sea una característica inherente de la enzima, la glucosa oxidasa en el caso de un sensor de glucosa, o un producto de la vinculación entre la enzima y un anticuerpo o sonda.
A continuación, describimos un método de ensayo sensor electroquímico para detectar e identificar bacterias directamente. En todos los casos, las sondas descritas aquí son oligonucleótidos de ADN. Este método se basa en sándwich de hibridación de sondas de captura y el detector con objetivo de ARN ribosómico (ARNr). La sonda de captura está anclado a la superficie del sensor, mientras que la sonda detectora está vinculada a horseradish peroxidasa (HRP). Cuando se añade un sustrato tal como 3,3 ', 5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) a un electrodo con complejos de captura-meta-detector unidos a su superficie, el sustrato se oxida por el HRP y reduce en el electrodo de trabajo. Este ciclo redox resultados, en el transporte de electrones por el sustrato del electrodo con HRP, producir flujo de corriente en el electrodo.
Introduction
Uso de rRNA como una molécula diana para la detección e identificación bacteriana tiene una serie de ventajas. La abundancia de ARNr en las células bacterianas prevé un límite de sensibilidad tan bajo como 250 bacterias por mililitro y sin la necesidad de amplificación de la diana 1. RRNA bacteriano contiene secuencias únicas especies específicas que son accesibles a la hibridación con sondas de ADN. En consecuencia, una serie de sensores electroquímicos se puede utilizar para identificar las bacterias desconocidos, donde cada sensor está funcionalizado con una sonda de captura específica de la especie diferente. Sensores del control positivo deben ser incluidos para un objetivo oligonucleótido sintético que "puentes" de la captura y las sondas de detección para crear una señal de calibración interna.
Los sensores electroquímicos tienen una amplia gama de aplicaciones de investigación básica y de la traducción. Por ejemplo, el ensayo descrito aquí se ha utilizado para medir con precisión el efecto de la E. coli en fase de crecimiento rrnA y el número de copias pre-rRNA, que es de gran interés para los investigadores interesados en la fisiología bacteriana 2. La sensibilidad del ensayo sensor electroquímico se determina por la relación señal a ruido. Se han explorado una diversidad de amplificación de la señal y los métodos de reducción de ruido. Nosotros encontramos que la mejora de la química de la superficie del sensor es clave para reducir la unión no específica de la sonda detector y / o enzima HRP. En particular, se ha encontrado una monocapa mixta de alkanedithiols y mercaptohexanol para reducir fondo, cubriendo la superficie del electrodo de forma más completa al tiempo que conserva la accesibilidad de la sonda de captura para la hibridación de destino 3. Estos tratamientos química de la superficie son particularmente importantes para los ensayos que implican muestras biológicas complejas.
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Protocol
1. Funcionalización de sensores electroquímicos
- Prepare la sonda de captura tiolada a una concentración de 0,05 mM en 300 mM de 1,6-hexanoditiol (HDT), 10 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 0,3 M de NaCl, 1 mM de EDTA y se incuba en la oscuridad a temperatura ambiente durante 10 min . La incubación de la sonda de captura tiolado con HDT asegura que se reduce el grupo tiol de la sonda de captura, lo que resulta en resultados más consistentes.
- Aplicar una corriente de nitrógeno a 16 de oro desnudo chip de matriz de sensores (s) durante 5 segundos para eliminar la humedad y / o partículas.
- Aplicar 6 l de la mezcla de sonda de captura HDT-tiolada al electrodo de trabajo de los 16 sensores de la serie de sensores y almacenar el chip del sensor (s) en un plato cubierto Petri a 4 ° C durante la noche. Sondas de captura tiolado se unen directamente al electrodo de oro desnudo y la HDT actúa para prevenir embalaje excesivo de las sondas de captura y mantenerlos en una conformación extendida que promueve la hibridación con el objetivo.
- Latras día, lavar el chip sensor con H2O desionizada durante 2-3 seg y seco bajo una corriente de nitrógeno durante 5 seg.
- Aplicar 6 l de 10 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 0,3 M de NaCl, 1 mM de EDTA, 1 mM de 6-mercapto-1-hexanol (MCH) para el electrodo de trabajo de todos los sensores 16 y se incuba durante 50 min. Esta y todas las incubaciones posteriores chip sensor se llevan a cabo en una placa de Petri cubierta a temperatura ambiente. MCH actúa como un agente de bloqueo, debería llenar los vacíos en donde la sonda de captura tiolado o HDT no está presente en la superficie del electrodo.
2. Preparación de la muestra
- Se transfiere 1 ml de cultivo bacteriano en la fase logarítmica de crecimiento (OD 600 ≈ 0,1) a un tubo de microcentrífuga y se centrifuga a 16.000 xg durante 5 min. Eliminar el sobrenadante del cultivo. El sedimento bacteriano se puede procesar inmediatamente o se almacenó a -80 ° C para su uso posterior.
- Completamente resuspender el pellet bacteriano en 10 l de NaOH 1 M aplicando la punta de la pipeta en el bottom del tubo de microcentrífuga y pipeta hacia arriba y abajo varias veces. Se incuba la suspensión a temperatura ambiente durante 5 min.
- Neutralizar el lisado bacteriano mediante la adición de 50 l de tampón fosfato 1 M, pH 7,2, que contiene 2,5% de albúmina sérica bovina (BSA) y 0,25 mM de una sonda de detector de fluoresceína-modificado. Se incuba el lisado neutralizado durante 10 min a temperatura ambiente. Fluoresceína modificados con sondas detectoras se hibridan con moléculas diana de rRNA bacterianas.
3. Sensor electroquímico Ensayo
- Lavar la MCH desde el chip sensor con H2O desionizada durante 2-3 seg y seco bajo una corriente de nitrógeno durante 5 seg.
- Aplicar 4 l de lisado bacteriano neutralizado al electrodo de trabajo de cada uno de los sensores 14 y se incuba durante 15 min. Complejos de sonda para la diana-detector se hibridan con sondas de captura inmovilizadas tiolados.
- Aplicar 4 l de 1 nM puente oligonucleótido en tampón fosfato 1 M, pH 7,2, que contiene 2,5% de BSA y 0,25 ymu, M sonda detector de fluoresceína-modificado a 2 sensores de control positivo (utilizados para la normalización de la señal) y se incuba durante 15 min.
- Lavar el chip sensor con H2O desionizada durante 2-3 seg y seco bajo una corriente de nitrógeno durante 5 seg.
- Aplicar 4 l de 0,5 U / ml de anti-fluoresceína-HRP en tampón fosfato 1 M, pH 7,2, que contiene 0,5% de caseína al electrodo de trabajo de todos los sensores 16 y se incuba durante 15 min. El anti-fluoresceína-HRP se une a las sondas detectoras fluoresceína-modificados inmovilizados.
- Lavar el chip sensor con H2O desionizada durante 2-3 seg y seco bajo una corriente de nitrógeno durante 5 seg.
- Aplicar una película así adhesivo a la superficie del chip sensor y la carga en el chip de montaje del sensor. Añadir 50 l de sustrato TMB a los 16 sensores y cerrar el montaje chip sensor.
- Obtener amperometría y las medidas de voltametría cíclica de los 16 sensores utilizando el Helios Lector Chip. Amperométrico actual es proporcional a la tasa de TMB reducción en la superficie del sensor (véase la Figura 1).
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Representative Results
Se describe un ensayo electroquímico que está estructurado de manera similar a un sándwich ELISA. Como se muestra en la Figura 1, diana ribosómica hibridación de ARN (ARNr) con sondas de captura y el detector es desarrollado por una reacción redox catalizada por HRP conjugado con fragmentos de anticuerpo anti-fluoresceína que se unen a la 3 'vinculación fluoresceína en la sonda detectora. Un componente importante de la sensibilidad del ensayo es la química de la superficie del electrodo de oro. Hemos encontrado que una monocapa ternaria que consiste en sondas de captura tiolados, mercaptohexanol, y hexanoditiol mejora significativamente la relación señal-a-ruido de fondo mediante la reducción de la unión no específica de la proteína indicadora 3. Los ensayos descritos aquí emplear un GeneFluidics 16 sensor de chip de matriz se muestra en la Figura 2. Cada uno de los sensores de la matriz contienen tres electrodos, de trabajo, de referencia, y auxiliares, que tienen puntos de contacto en el borde del chip 4. El chip de lecturaer tiene pines pogo que se conectan con cada uno de los puntos de contacto. El lector de chip sirve como una interfaz para la matriz de sensores con un potenciómetro controlado por un algoritmo de ordenador.
Ejemplos de flujo de corriente electroquímica del sensor se muestran en la Figura 3. El flujo de corriente en los sensores es artificialmente alta durante los primeros pocos segundos después de las mediciones amperométricos comienzan a causa de la acumulación de sustrato oxidado durante el tiempo desde la aplicación de TMB a la superficie del sensor para iniciar el algoritmo lector. El flujo de corriente alcanza rápidamente un estado de equilibrio y lecturas de los sensores precisos fiable se puede obtener dentro de los sesenta segundos. Los ensayos de los sensores se realizan típicamente por duplicado como un control interno para la variabilidad del sensor. Hemos encontrado que la variabilidad del sensor al sensor es relativamente constante, por lo que es posible llevar a cabo 16 ensayos diferentes de sensores en paralelo en los GeneFluidics chip de matriz de 16-sensor. Los controles positivos y negativos son essencial. Como control positivo, se incluye un "puente" oligonucleótido de ADN sintético que se hibrida con tanto la captura y sondas detectoras y sirve como una diana sintética de concentración conocida. De esta manera, los resultados obtenidos utilizando el oligonucleótido puente funciona como un control de calibración interna para minimizar la variación de viruta a viruta.
Cuando se prueba sondas de captura y de detección, el límite de detección debe ser determinada por dilución en serie de una muestra de concentración conocida. Como se muestra en la Figura 4, existe una correlación log-log lineal entre la concentración de la muestra y la señal de salida sobre el rango dinámico del ensayo. El límite de detección se define como la concentración de la meta requerido para generar una señal que es 3,29 desviaciones estándar mayor que la media de las señales de fondo 5. Para la identificación de bacterias en una muestra desconocida, un panel de captura correspondiente y pares de sondas de detección se seleccionan. La elección de sondas is determinada por los tipos de bacterias que se sospecha en un tipo particular de muestra. Por supuesto, bacterias inusuales en ocasiones se pueden encontrar en cualquier muestra, por lo que se recomienda que se incluye un par de sondas eubacterias que tiene la capacidad de hibridar con regiones conservadas de rRNA de cualquier bacteria. Figura 5 muestra resultados representativos de las muestras que contenían E. coli y K. pneumoniae, que se encuentra con frecuencia en la orina de pacientes con infección del tracto urinario. Señales para la mayoría de los sensores serán bajas y similares, y estos resultados negativos pueden ser agrupados como la señal de fondo.
Figura 1. Diagrama esquemático del ensayo de sensor electroquímico. El electrodo de oro se recubre con mercaptohexanol y hexanoditiol y funcionalizado mediante la adición de sondas de captura de oligonucleótidos de ADN tiolados (azul). Sandwich hybridization del 16S rRNA diana con la sonda de captura y la sonda de oligonucleótido de ADN detector de oligonucleótido de ADN marcado con fluoresceína (rojo), da como resultado un complejo que se detecta mediante la adición de anti-fluoresceína - peroxidasa de rábano picante (HRP) conjugado y sustrato TMB. Actual amperométrico es generado por el ciclo redox que resulta de la oxidación de TMB por el HRP y la reducción de TMB por los electrones desde el electrodo.
Figura 2. . Identificación bacteriana matriz de sensores y de chip de montaje Cada sensor en la matriz se compone de tres electrodos: un electrodo central de trabajo, un electrodo de referencia circunferencial y un electrodo auxiliar para la estabilización de la señal. Los electrodos de trabajo de cada sensor en la matriz están funcionalizados con un panel de sondas de captura específico para las especies bacterianas de interés (véase la Tabla 3) como lo ll como una sonda de captura de la UE (eubacterias) que se hibrida con todas las moléculas de ARNr 16S bacterianas y un BROL oligonucleótidos "puente" que funciona como control positivo para la calibración de la señal. La señal se mide mediante la colocación de la matriz en un lector de chips con los pernos pogo que la interfaz con los puntos de contacto de los electrodos del sensor.
Figura 3. Salida de corriente durante la medición amperométrica. Corriente amperométrica se mide en paralelo para todos los 16 sensores en la matriz. El flujo de corriente es inicialmente muy negativo debido a la acumulación de sustrato TMB oxidado antes de conectar la matriz para el lector de chip y de iniciar la medición. A partir de entonces, la corriente se estabiliza de forma rápida y lecturas de los sensores se registran a 60 seg. Electrodos con mayor corriente negativa tienen los mayores señales.
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La Figura 4. Serie de diez diluciones de E. coli para determinar el límite de detección. Sensores se ensayaron por duplicado con diluciones decimales de una concentración conocida de E. coli lisado. Las lecturas de la señal observado, representan como círculos negros, fueron utilizados para predecir una curva de la señal idealizada. La desviación estándar agrupada para todas las repeticiones y la señal de fondo en la concentración objetivo más bajo se utiliza para calcular el límite de detección (línea azul), que se define como 3,29 desviaciones estándar sobre el fondo.
Figura 5. Representativos de sensores electroquímicos de los resultados del ensayo para Escherichia coli y Klebsiella pneumoniae. E. coli y K. pneumonIAE se ensayaron para determinar la reactividad con pares de sondas descritas en las Tablas 2 y 3. Reactividad con el par de sondas KE distingue K. pneumoniae E. coli. El oligonucleótido puente (BROL) sirve como control positivo y el patrón de calibración interno.
| Nombre de la sonda | Subunidad ribosomal y ubicación * | Secuencia |
| KE Cap 10m | 16S 74 | 5'-S-AGCTCTCTGT |
| KE Det 11m | 16S 63 | 5'-GCTACCGYTCG-F |
| EK Cap 15m | 23S 1492 | 5'-AGCCTTGATTTTCCG-S |
| EK Det 15m | 23S 1507 | 5'-F-TCGTCATCACACCTC |
| EL Cap 17m | 23S 1507 | 5'-AGCGTTAAAAGGTACCG-S |
| EL Cap 18m | 23S 1507 | 5'-AGCGTTAADAAGGTACCG-S |
| EL Det 15m | 23S 1492 | 5'-F-TCGTCATCACACCTC |
| EB Cap 23m | 16S 1275 | 5'-S-ACTTTATGAGGTCCGCTTGCTCT |
| EB Det 23m | 16S 1252 | 5'-CGCGAGGTCGCCTTCCTTTGTAT-F |
| PM Cap 15m | 16S 183 | 5'-S-TTTGGTCCGTAGACA |
| PM Det 17m | 16S 166 | 5'-TTATGCGGTATTAGCCA-F |
| PA Cap 11m | 16S 453 | 5'-S-ACTTACTGCCC |
| PA Det 14m | 16S 439 | 5'-TTCCTCCCAACTTA-F |
| UE GN Cap 19m | 16S 1502 | 5'-S-GTTCCCCTACGGTTACCTT |
| UE Det 18m | 16S 1484 | 5'-GTTACGACTTCACCCCAG-F |
| UE BROL 37m | 5'-CTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAACCGTAGGGGAAC |
Tabla 2. Las secuencias de ADN de oligonucleótidos sonda par. Sondas de captura (Cap) se sintetizan con enlaces tiol (S). Sondas Detector (Det) son sintetizados con modificaciones fluoresceína (F). Tenga en cuenta que cualquiera de los dos pares de sondas implican una sonda 5'-tiolada de captura y una sonda detectora 3'-fluoresceína-modificado o una sonda de captura 3'-tiolado y una sonda de detector de 5'-fluoresceína-modificado. Las dos sondas de captura EL se mezclan antes de su uso. Para simplificar el ensayo, sondas detectoras se pueden aplicar a cada sensor como una mezcla sin reactividad cruzada significativa. KE - Klebsiella y Enterobacter, EK - E. coli y K. pneumoniae, EL - E. cloacae, EB - familia Enterobacteriaceae, PM - P. mirabilis, PA - P. aeruginosa, EU - eubacterial, BROL - oligonucleótido puente. * - Location number se refiere a la distancia desde el principio de los genes 16S o 23S.
| Especies bacterianas | Pares de sondas reactivas |
| Escherichia coli | EK + EB |
| Klebsiella pneumoniae | KE + EK + EB |
| Proteus mirabilis | PM + EB |
| Pseudomonas aeruginosa | Pensilvania |
| Especies de Enterobacter | KE + EB o EL + EB o KE + EL + EB |
Tabla 3. El reconocimiento de las especies bacterianas por pares de la sonda.
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Discussion
El ensayo de sensor electroquímico descrito aquí permite la rápida detección de dianas de ácido nucleico. La sensibilidad y la especificidad dependen en parte de la energía libre de hibridación diana-sonda, que a su vez depende de la longitud y contenido de GC de la captura y sondas detectoras. Normalmente realizamos los pasos de hibridación a temperatura ambiente (~ 20 ° C) 5, 6. Sin embargo, las etapas de hibridación (3.2 y 3.3) también se puede realizar a temperaturas más elevadas en un horno de hibridación si el chip se coloca en una cámara cubierta que contiene papel de filtro humedecido para evitar la evaporación 7, 8. Señal óptima se obtiene con pares de sondas de captura-detector que se hibridan a los sitios adyacentes en el ácido nucleico diana sin una brecha entre los sitios de hibridación 8. Esta mejora de la señal se cree que actúa de base par apilado y por el aumento de la accesibilidad de hibridación de las regiones adyacentes, conocido como "sonda helper" efecto. Prob Capture-detectore hibridación a los sitios adyacentes también es importante porque la lisis alcalina de los resultados de las bacterias en la fragmentación de la rRNA diana 5. Este método se puede aplicar a la detección de ARN o dianas de ADN, con una amplia variedad de aplicaciones clínicas y de investigación. Por ejemplo, debería ser posible utilizar este método para estudiar las funciones celulares que son regulados por pequeños RNAs o para detectar objetivos de genes de resistencia a antibióticos, ya sea como ADN o ARNm. Pre-amplificación puede ser necesario para detectar objetivos presentes en bajo número de copias. Además, deberían añadirse inhibidores de ARNasa durante la preparación de la muestra para evitar la degradación de las dianas de ARN potencialmente inestables.
Este método tiene varias ventajas sobre otros métodos de detección e identificación de bacterias. Métodos de microbiología clínica estándar requieren el crecimiento bacteriano en medio de agar para la cuantificación y la aplicación de los métodos de identificación. El crecimiento de las bacterias a las colonias visibles implica típicamenteincubación durante la noche, lo que retrasa significativamente el tiempo de recogida de muestras para la presentación de informes de resultados. Hay un gran interés en el desarrollo de métodos más rápidos y moleculares de detección de patógenos, incluyendo biosensores electroquímicos 9. Sin embargo, poca atención ha sido dada a la realización de biosensores de ADN en muestras biológicas primas. El ensayo de sensor electroquímico se describe aquí se puede realizar directamente en muestras de suero y orina sin una pérdida significativa de la sensibilidad de 7. El uso de sondas de captura tiolados y la monocapa mixta se describe aquí hace que la superficie del sensor resistente a la absorción de la proteína no específica, retención de la sensibilidad en muestras biológicas primas, incluyendo suero o la orina 10. Como pocos como 1 célula bacteriana por sensor (250 bacterias por mililitro) son detectables, que es comparable a la sensibilidad de las técnicas de amplificación de PCR 1. Varios métodos de identificación de bacterias basados en la PCR se han descrito 11, 12. Aunque la PCR potencialmente puede detectar menos moléculas diana que el ensayo de sensor electroquímico se describe aquí, los métodos basados en PCR han logrado adopción limitada debido a la adquisición de equipos de alta y / o costes de reactivos, relativa a los métodos clínicos de microbiología clínica. Por el contrario, los sensores electroquímicos son relativamente baratos de producir. A pesar de que los electrodos se fabrican por pulverización catódica de oro, la cantidad de oro por chip es baja debido a que el espesor del electrodo es de sólo 1.000 angstroms.
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Disclosures
Todos los autores son los inventores de patentes relacionadas con los métodos descritos. Una de estas patentes se ha licenciado a Qvella Corporation. BMC y DAH tienen participación accionaria en Qvella Corporation. VG es el Presidente de GeneFluidics, que es el fabricante del chip de matriz de sensores electroquímicos, chip de montaje, y el lector de chip se describe en este documento.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado por la Cooperativa Premio Acuerdo AI075565 (al DAH) del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas y el Wendy y Ken Fondo Rubí a la Excelencia en Investigación Pediátrica Urología. BMC es la Judith y Robert Winston Cátedra de Urología Pediátrica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-mercapto-1-hexanol (MCH) | Sigma | 451088 | Store at room temperature |
| 1,6-hexanedithiol (HDT) | Sigma | H-12005 | Store at room temperature |
| Thiolated capture probes | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
| Fluorescein-modified detector probes | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
| Bridging Oligonucleotide | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
| Anti-Fluorescein-HRP, Fab fragments | Roche | 11 426 346 910 | Store at 4 °C |
| Helios Chip Reader | GeneFluidics | GFR-2009 | |
| Sensor Chip Mount | GeneFluidics | GFR-003 | |
| Film well sticker | GeneFluidics | Shipped with sensor chips | |
| Bare gold 16-sensor array chips | GeneFluidics | SC1000-16X-B | Store in 100% N2 at room temperature |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | Store at 4 °C |
| 1M Phosphate Buffer, pH 7.2 | 0.35M NaH2PO4, 0.65M K2HPO4, adjusted to pH 7.2 | ||
| Blocker Casein in PBS | Pierce | 37528 | Dilute with an equal volume of 1M Phosphate Buffer, pH 7.2, store at 4 °C |
| Table 1. Reagents and Equipment. | |||
References
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