Summary
Biz hızlı bakteri bulunması ve belirlenmesi için bir elektrokimyasal sensör test yöntem açıklanmaktadır. Tahlil, ribozomal RNA (rRNA) türe özgü dizileri için DNA oligonükleotid probları yakalama fonksiyonuna sahip bir sensör dizisi içerir. Yakalama prob ve yaban turpu peroksidaz bağlı DNA oligonükleotid dedektör prob ile hedef rRNA Sandwich melezleme ölçülebilir bir amperometrik akım üretir.
Abstract
Elektro kimyasal sensörler yaygın olarak kan şekeri hızlı ve doğru bir ölçüm için kullanılan ve bir analitler çeşitli saptanması için adapte edilebilir. Elektrokimyasal sensörler yararlı bir elektrik sinyali bir biyolojik tanıma olay iletici çalışır. Sinyal transdüksiyonu bir amperometrik elektrot bir biçimde bir redoks enzim aktivitesi bağlanmasıyla gerçekleşir. Sensör özgüllük doğal bir enzimin özelliği, bir glikoz sensörü durumunda glukoz oksidaz veya enzim ve bir antikor veya prob arasındaki bağlantı bir ürün ya da bir.
Burada, doğrudan tespit etmek ve bakteri belirlemek için bir elektrokimyasal sensör test yöntem açıklanmaktadır. Her durumda, burada tarif edilen sondalar DNA oligonükleotitleri vardır. Bu yöntem, hedef RNA (rRNA) ile yakalama ve dedektör probları sandviç hibridizasyona dayanır. Dedektör prob saat bağlı iken yakalama prob, sensör yüzeyine tutturulduğuorseradish peroksidaz (HRP). Örneğin 3,3 ', 5,5'-tetrametilbenzidin (TMB) gibi bir alt-tabaka yüzeyine bağlı yakalama hedef dedektörlü kompleksleri ile bir elektrot ilave edildiğinde, alt tabaka, HRP ile oksitlenir ve çalışan elektrot ile azaltılır. Elektrot akım üreten elektrottan HRP alt tabaka ile elektronların mekik Bu redoks döngüsü ile sonuçlanır.
Introduction
Bakteriyel saptanması ve tanımlanması için bir hedef molekülü olarak rRNA kullanılması bir takım avantajları bulunmaktadır. Bakteriyel hücrelerde rRNA bolluğu hedef amplifikasyon 1 için gerek kalmadan mililitre başına 250 bakteri gibi düşük bir duyarlılık sınırı için içerir. Bakteriyel rRNA DNA probları ile hibridizasyon için erişilebilir benzersiz türe özgü dizileri içerir. Sonuç olarak, elektrokimyasal sensör dizisi her bir sensör farklı bir türe spesifik yakalama prob ile işlevlendirilmektedir bilinmeyen bir bakteri, tespit etmek için kullanılabilir. Pozitif kontrol sensörleri "köprü" yakalama ve dedektör probları dahili kalibrasyon sinyali oluşturmak için bir sentetik oligonükleotid hedef için dahil edilmelidir.
Elektrokimyasal sensörler temel ve yorumsal araştırmalar geniş bir uygulama yelpazesi var. Örneğin, tahlil, tam E. etkisini ölçmek için burada açıklanan kullanılmıştır rrn üzerinde coli büyüme aşamasındaBakteriyel fizyolojisi 2 ile ilgilenen araştırmacılara büyük ilgi olan A ve ön rRNA kopya sayıları,. Elektrokimyasal sensör tahlilin hassasiyetini gürültü oranı sinyal ile belirlenir. Sinyal güçlendirme ve gürültü azaltma yöntemleri çeşitli araştırılmıştır. Biz sensör yüzeyinin kimyası geliştirmek dedektör prob ve / veya HRP enzimin spesifik olmayan bağlanma azaltmak için önemli olduğunu bulmak. Özellikle, alkanedithiols ve mercaptohexanol oluşan karışık bir hedef tek tabaka melezleştirme 3 için yakalama probunun yönelik koruyarak daha tam olarak elektrot yüzeyi kapsayan arka planı azaltmak için tespit edilmiştir. Bu yüzey kimyası tedaviler karmaşık biyolojik örnekler içeren deneyleri için özellikle önemlidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Elektrokimyasal Sensörler işlevsellik
- 300 uM 0.05 uM'lik bir konsantrasyonda thiolated yakalama prob hazırlamak 1,6-hexanedithiol (HDT), 10 mM Tris-HCI, pH 8.0, 0.3 M NaCI, 10 dakika boyunca oda sıcaklığında, karanlıkta, 1 mM EDTA ve inkübe . HDT ile thiolated yakalama probunun İnkübasyon daha tutarlı sonuçlar ile sonuçlanan, yakalama prob üzerindeki tiyol grubu azalır sağlar.
- Nem ve / veya partikülleri çıkarmak için 5 saniye boyunca açık altın 16 dizi sensör çipi (ler), bir nitrojen akışı uygulanır.
- Sensör dizisi tüm 16 sensörlerin çalışma elektrot için HDT-thiolated yakalama prob karışımı 6 ul uygulayın ve 4 ° C gecede de kapalı bir Petri kabındaki sensör çip (ler) saklayın. Thiolated yakalama probları çıplak altın elektrot doğrudan bağlamak ve HDT yakalama probları overpacking önlemek ve hedef ile melezleme teşvik uzun bir uyum içinde tutmak için hareket eder.
- günün ardından, 5 saniye boyunca bir nitrojen akışı altında 2-3 saniye ve kuru için deiyonize H2O sensör çipi yıkayın.
- 10 mM Tris-HCI, pH 8.0, 0.3 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM tüm sensörler 16 ve 50 dakika süre ile inkübe çalışan elektrot ve 6-merkapto-1-hekzanol (MCH) 6 ul uygulanır. Bu ve daha sonraki tüm sensör çipi inkübasyonlar oda sıcaklığında kapalı bir Petri kabındaki gerçekleştirilir. MCH thiolated yakalama prob veya HDT elektrot yüzeyinde bulunan olmayan herhangi bir boşlukları doldurma, engelleyici bir ajan olarak hareket eder.
2. Numune Hazırlama
- 5 dakika boyunca 16.000 xg bir mikrosantrifüj tüp ve santrifüj büyüme log fazı (≈ 0.1 OD 600) bakteri kültürü 1 ml aktarın. Kültür süpernatantı. Bakteriyel pelet hemen işleme veya -80 ° C daha sonra kullanılmak üzere saklanabilir.
- İyice bot pipet uygulanarak, 1 M NaOH içinde 10 ul bakteriyel pelletinimikrosantrifüj tüp ve birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleme tom. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında süspansiyona inkübe edin.
- , 1 M fosfat tampon, pH 7.2 50 ul ekleyerek bir floresein-değiştirilmiş detektör probu% 2.5 büyükbaş hayvan serum albümini (BSA) ve 0.25 mM ile bakteriyel lizat nötralize eder. Oda sıcaklığında 10 dakika süre ile nötralize lizat inkübe edin. Floresein-modifiye dedektörü problar bakteriyel rRNA hedef molekülü ile melezleşir.
3. Elektrokimyasal sensör olup Deneyi
- 5 saniye boyunca bir nitrojen akışı altında 2-3 saniye ve kuru için deiyonize H2O ile sensör çip MCH yıkayın.
- 14 sensörlerin her birinin çalışan elektrot ile nötralize edilmiş bakteriyel lizat 4 ul uygulayın ve 15 dakika boyunca inkübe edilir. Hedef-dedektör prob kompleksleri hareketsiz thiolated yakalama probları için melezleşme.
- % 2.5 BSA ve 0.25 ve ihtiva eden, 1 M fosfat tampon, pH 7.2 'de, 1 nM oligonükleotid köprü 4 ul uygulayınmu, M floresan-modifiye dedektör prob 2 pozitif kontrol sensörleri (sinyal normalleşmesi için kullanılır) ve 15 dakika inkübe.
- 5 saniye boyunca bir nitrojen akışı altında 2-3 saniye ve kuru için deiyonize H2O sensör çipi yıkayın.
- , 1 M fosfat tampon, pH 7.2 'de 0.5 U / ml anti-Floresein-HRP 4 ul geçerli olan tüm 16 sensörlerinin Çalışan elektrot için% 0.5 kazein içeren ve 15 dakika boyunca inkübe edilir. Anti-Floresein-HRP hareketsizleştirilmiş floresein-değiştirilmiş dedektör probları bağlanır.
- 5 saniye boyunca bir nitrojen akışı altında 2-3 saniye ve kuru için deiyonize H2O sensör çipi yıkayın.
- Sensör çipi monte içine sensör çipi ve yük yüzeyi ile bir etiket de filmin uygulanır. Pipet 50 Tüm 16 sensörler üzerine TMB substrat ul ve sensör çip montaj kapatın.
- Helios Chip Reader kullanan tüm 16 sensörler için amperometri ve dönüşümlü voltametri ölçümleri alın. Amperometrik mevcut TMB r oranı ile orantılıdırSensör yüzeyinde eduction (bkz. Şekil 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu bir sandviç ELISA ile benzer şekilde yapılandırılmıştır bir elektrokimyasal analiz tarif eder. Şekil 1, bu detektör probu üzerinde 3 'floresein bağlantısına bağlamak Anti-florosin antikor fragmanlarına HRP konjuge tarafından katalize edilen bir redoks reaksiyonu tarafından geliştirilen yakalama ve dedektör probları ile hedef RNA (rRNA) hibridizasyon gösterilmiştir. Test hassasiyeti önemli bir bileşeni altın elektrot yüzeyi kimyası olduğunu. Biz thiolated yakalama problar mercaptohexanol ve hexanedithiol oluşan üçlü bir tek tabaka önemli muhabir Protein, 3 bağlayıcı spesifik olmayan arka plan azaltarak sinyal-gürültü oranını iyileştirir bulduk. Deneyleri Şekil 2'de gösterildiği gibi, bir 16 GeneFluidics sensör çip dizisi kullanır tanımlanmıştır. Dizideki sensörler her çip 4 kenarında temas noktaları var üç elektrot, çalışma, referans ve yardımcı, içerir. Çip okumaker temas noktaları her bağlantı zıp işaretçilerine vardır. Çip okuyucu bir bilgisayar algoritması tarafından kontrol edilen bir potansiyometre ile sensör dizisi için bir arayüz olarak hizmet vermektedir.
Elektrokimyasal sensör akım örnekler Şekil 3 'de gösterilmiştir. Amperometrik ölçümler okuyucu algoritması başlatmadan sensör yüzeyine TMB uygulamadan süre içinde çünkü okside yüzey birikimi başladıktan sonra sensörler akım ilk birkaç saniye boyunca yapay yüksektir. Akım hızlı bir şekilde kararlı duruma ulaşır ve doğru sensör okumaları güvenilir altmış saniye içinde elde edilebilir. Sensör deneyleri tipik olarak sensör değişkenlik için bir iç kontrol olarak iki kopya halinde gerçekleştirilir. Bu sensör ile sensör değişkenlik nispeten sabittir, bu yüzden 16-algılayıcı çip dizisi GeneFluidics üzerinde paralel olarak 16 farklı sensör deneyleri gerçekleştirmek mümkün olduğunu bulduk. Pozitif ve negatif kontroller essen olanFark sıcaklık. Bir pozitif kontrol olarak, yakalama ve dedektör probları ile hibridize ve hem de bilinen bir konsantrasyonda sentetik bir hedef olarak hizmet veren, sentetik bir "köprü" DNA oligonükleotid içerir. Bu şekilde, sonuç çip talaşa varyasyonu en aza indirmek için bir iç kontrol olarak kalibrasyon köprü oligonükleotid fonksiyonları kullanarak elde edilmektedir.
Yakalama ve dedektör problar test ederken, tespit limiti bilinen bir konsantrasyonda bir örnek seri seyreltme ile belirlenmelidir. Şekil 4 'de gösterildiği gibi, örnek konsantrasyonu ve tahlilin dinamik aralık üzerinden sinyal çıkışı arasında doğrusal bir log-log bir ilişki vardır. Tespit limiti arka plan sinyalleri 5 ortalama standart sapma 3,29 daha yüksek olan bir sinyal oluşturmak için gereken hedef konsantrasyonu olarak tanımlanır. Bilinmeyen bir örnek bakterilerin tanımlanması için, uygun yakalama ve dedektör, prob çiftlerinin bir panel seçilir. Probların seçimi Is örnekleme belirli bir tür şüpheli bakteri türleri tarafından belirlenir. Tabii ki, olağandışı bakteri bazen herhangi bir örnek bulunabilir, bu yüzden bir eubacterial sonda çift herhangi bir bakteri korunmuş rRNA bölgelere melezleşme kapasitesine sahip olduğu yer öneririz. Şekil 5 E. içeren örnekler için temsilcisi sonuçları gösterir coli ve K. Sık sık idrar yolu enfeksiyonu olan hastaların idrarında bulunan pneumoniae. Sensörlerin çoğu için sinyaller, düşük ve benzer olacaktır ve bu olumsuz sonuçlar arka plan sinyali olarak toplanmış olabilir.
Şekil 1. Elektrokimyasal sensör tahlilinde şematik diyagramı. Altın elektrod mercaptohexanol ve hexanedithiol ile kaplanmış ve thiolated DNA oligonükleotid probları yakalama (mavi) ilavesi ile işlevlendirilmektedir. Sandviç hDNA oligonükleotid yakalama sistemi ve floresein-etiketli DNA oligonükleotid detektör probu ile hedef 16S rRNA ybridization (kırmızı), Anti-florosin ilavesi ile tespit edilir, bir kompleks içinde sonuçları - yaban turpu peroksidaz (HRP) konjuge ve TMB substrat. Amperometrik mevcut redoks döngüsü ile oluşturulur, bu da HRP ve elektrottan elektronlar tarafından TMB indirgenmesi ile TMB oksidasyonu sonucunda ortaya çıkar.
Şekil 2. . Merkezi bir çalışma elektrot, bir çevresel referans elektrot ve sinyal istikrar için yardımcı bir elektrot: bakteri tanımlama sensör dizisi ve yonga montaj Dizideki her sensör üç elektrot oluşur. Dizideki her sensörün çalışma elektrotları biz (bkz. Tablo 3) Çevrede bulunan bakteri türleri için özel yakalama probları bir panel ile fonksiyonelleştirilmiş vardır Tüm bakteriyel 16S rRNA molekülleri ve Brol "köprü" oligonükleotid sinyali kalibrasyon için pozitif kontrol olarak bu işlevlerine hibritlenen bir AB (eubacterial) yakalama prob olarak ll. Sinyal pogo iğneli bir çip okuyucu dizi yerleştirerek ölçülür sensör elektrot temas noktaları ile arayüzü.
Şekil 3,. Ölçüm sırasında Amperometrik akım çıkışı. Amperometrik akımı dizideki tüm 16 sensörler için paralel olarak ölçülür. Akım başlangıçta nedeniyle önce çip okuyucuya dizi bağlantı ve ölçüm başlayan okside TMB birikimine son derece olumsuz olduğunu. Bundan sonra, mevcut hızlı stabilize ve sensör okumaları 60 sn kaydedilir. Büyük negatif akım ile Elektrotlar en yüksek sinyalleri var.
"Şekil 4" src = "/ files/ftp_upload/4282/4282fig4.jpg" />
Şekil 4. E. Seri on kat inceltilmiş Tespit limiti belirlemek için coli. Sensörler E., bilinen bir konsantrasyonunun on kat seri seyreltme ile iki kopya halinde test edildi coli lizat. Gözlenen sinyal okuma, siyah daireler olarak çizilir idealize edilmiş bir sinyal eğrisi tahmin için kullanılmıştır. Tüm standart sapmalar çoğaltır ve en hedef konsantrasyonda bir arka plan sinyali arka plan üzerinde 3.29 standart sapma olarak tanımlanır algılama (mavi çizgi), sınır hesaplamak için kullanıldı.
Şekil 5,. Escherichia coli ve Klebsiella pneumoniae. E. için Temsilcisi elektrokimyasal sensör test sonuçları coli ve K. pneumonIAE Tablo 2 ve 3'te tarif edildiği prob çifti ile reaktivite açısından test edilmiştir. KE prob çifti ile tepkime K. ayırt E. pneumoniae coli. köprü oligonükleotid (Brol) pozitif kontrol ve iç kalibrasyon standart olarak hizmet vermektedir.
| Probe Adı | Ribozomal Altbirim ve Yer * | Dizi |
| 10m KE Cap | 16S 74 | 5'-S-AGCTCTCTGT |
| KE Det 11m | 16S 63 | 5'-GCTACCGYTCG-F |
| EK Cap 15m | 23S 1.492 | 5'-AGCCTTGATTTTCCG-S |
| EK Det 15m | 23S 1.507 | 5'-F-TCGTCATCACACCTC |
| EL Cap 17m | 23S 1507 | 5'-AGCGTTAAAAGGTACCG-S |
| EL Cap 18m | 23S 1.507 | 5'-AGCGTTAADAAGGTACCG-S |
| EL Det 15m | 23S 1.492 | 5'-F-TCGTCATCACACCTC |
| EB Cap 23m | 16S 1.275 | 5'-S-ACTTTATGAGGTCCGCTTGCTCT |
| EB Det 23m | 16S 1.252 | 5'-CGCGAGGTCGCCTTCCTTTGTAT-F |
| PM Cap 15m | 16S 183 | 5'-S-TTTGGTCCGTAGACA |
| PM Det 17m | 16S 166 | 5'-TTATGCGGTATTAGCCA-F |
| PA Cap 11m | 16S 453 | 5'-S-ACTTACTGCCC |
| 14m PA Det | 16S 439 | 5'-TTCCTCCCAACTTA-F |
| AB GN Cap 19m | 16S 1.502 | 5'-S-GTTCCCCTACGGTTACCTT |
| AB Det 18m | 16S 1.484 | 5'-GTTACGACTTCACCCCAG-F |
| AB Brol 37m | 5'-CTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAACCGTAGGGGAAC |
Tablo 2'de. DNA oligonükleotid dizi çiftlerini açıcı. Yakalama (Cap) probları, tiyol bağlantısı (S) ile sentezlenir. Dedektör (Det) probları, floresein (F) değişiklikler ile sentezlenir. Prob çiftleri bir 5'-thiolated yakalama prob ve bir 3'-floresan-modifiye dedektör prob veya 3'-thiolated yakalama prob ve bir 5'-floresan-modifiye dedektör prob ya içerdiğini unutmayın. İki EL yakalama probları kullanımdan önce karıştırılır. Tahlil basitleştirmek için, detektör problar çapraz reaktivite anlamlı olmayan bir karışım olarak her bir sensör için uygulanabilir. KE - Klebsiella ve Enterobacter, EK - E.coli ve K. pneumoniae, EL - E. cloacae, EB - Enterobacteriaceae ailesinin, AM - P. mirabilis, Pensilvanya - P. aeruginosa, AB - eubacterial, Brol - Bridging Oligonükleotid. * - Yer nkoyu kahverengi 16S veya 23S geninin başlangıcına kadar olan mesafeyi ifade eder.
| Bakteriyel Türler | Reaktif Probe Çiftler |
| Escherichia coli | EK + EB |
| Klebsiella pneumoniae | KE + EK + EB |
| Proteus mirabilis | PM + EB |
| Pseudomonas aeruginosa | PA |
| Enterobacter türleri | KE + EB veya EL + EB veya KE + EL + EB |
Tablo 3. Probe Çiftler tarafından Bakteriyel Türlerin tanınması.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan elektrokimyasal sensör tahlilinde nükleik asit hedef hızlı tespit sağlar. Duyarlılık ve özgüllük da uzunluğu ve yakalama ve dedektör probları GC içeriğine bağlıdır hedef prob hibridizasyon, serbest enerji kısmen bağlıdır. Biz, tipik olarak ortam sıcaklığında (~ 20 ° C) 5, 6, hibridizasyon adımları. Bununla birlikte, melezleme adımları (3.2 ve 3.3) da chip içeren kapalı bir odaya yerleştirilir ise, bir hibridizasyon fırın içinde daha yüksek bir sıcaklıkta gerçekleştirilir buharlaştırılarak 7, 8 önlemek için filtre kağıdı nemlendirilmiş edilebilir. Optimum sinyal hibridizasyon sitelerinin 8 arasında bir boşluk olmadan bir nükleik asit hedef komşu bölgelerde hibridize yakalama dedektörlü prob çifti ile elde edilir. Bu sinyal geliştirme istifleme baz çifti tarafından ve bir "yardımcı prob" etkisi olarak bilinen komşu bölgelerin melezleme erişilebilirlik, artırarak çalışmaya düşünülmektedir. Yakalama-dedektör probkomşu bölgelerde e hibridizasyon rRNA hedef 5'te parçalanma bakteriler sonuç alkalin lisis için de önemlidir. Bu yöntem, klinik ve araştırma uygulamaları için bir çok çeşitli, RNA ya da DNA ya da hedeflerin tespiti için uygulanabilir. Örneğin küçük RNA'lar tarafından düzenlenir ya da DNA veya mRNA ya gibi antibiyotik direnç geni hedefleri tespit etmek için hücre fonksiyonlarını incelemek için bu yöntemi kullanmak mümkün olmalıdır. Ön amplikasyon düşük kopya sayıları mevcut hedefleri tespit etmek için gerekli olabilir. Buna ek olarak, RNaz inhibitörü potansiyel olarak kararsız RNA hedeflerinin bozulmasını önlemek için numune hazırlanması sırasında ilave edilmelidir.
Bu yöntem bakteri tespit ve belirleme diğer yöntemlere göre birçok avantajı vardır. Standart klinik mikrobiyoloji yöntemleri tanımlama yöntemlerinin kantitatif ve uygulama için agar ortamda bakteri üremesi gerektirir. Görünür koloniler bakteri Büyüme genellikle içerirgecelik inkübasyon, önemli sonuçların raporlanması için örnek toplama zamanı geciktirmek. Elektrokimyasal biyosensör 9 dahil olmak üzere patojen tespiti daha hızlı, moleküler yöntemler, geliştirilmesi büyük ilgi var. Ancak, az ilgi ham biyolojik örneklerin DNA biyosensör performansına verilmiştir. Elektrokimyasal sensör tahlilinde burada açıklanan duyarlılık 7 önemli bir kayıp olmaksızın, serum ve idrar numuneleri doğrudan gerçekleştirilebilir. Thiolated yakalama probları ve burada açıklanan karışık tek tabaka kullanımı serum veya idrarda 10 dahil olmak üzere ham biyolojik numunelerde hassasiyeti koruyarak, non-spesifik protein emilim dayanıklı sensör yüzeyi vermektedir. Sensör başına 1 bakteriyel hücre (mililitre başına 250 bakteri) olduğu kadar az algılanabilir olduğu için, bu PCR teknikleri 1. duyarlılığı ile karşılaştırılabilir. Çeşitli PCR tabanlı bakteri tanımlama yöntemleri 11, 1 tarif edilmiştir2. PCR potansiyel elektrokimyasal sensör testi burada açıklanan daha az hedef molekülleri tespit de, PCR tabanlı yöntemler nedeniyle yüksek ekipman satın alma ve standart klinik mikrobiyoloji yöntemlere göre / veya reaktif maliyetleri, sınırlı kabulü elde ettik. Bunun aksine, elektrokimyasal sensör üretmek için nispeten daha ucuzdur. Elektrotlar altın püskürtme, tarafından imal edilir olsa da elektrot kalınlığı sadece 1.000 angstrom çünkü yonga başına altın miktarı düşüktür.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Tüm yazarlar tarif edilen yöntemler ile ilgili patentlere mucitler vardır. Bu patentlerden biri Qvella Corporation lisanslı edilmiştir. BMC ve DAH Qvella Corporation sermaye ilgi var. VG elektrokimyasal sensör dizisi çip üreticisi GeneFluidics Başkanı, çip montaj, ve bu yazıda anlatılan çip okuyucu.
Acknowledgments
Bu çalışma, Alerji ve Enfeksiyon Hastalıkları Ulusal Enstitüsü'nden İşbirliği Anlaşması Ödülü AI075565 (DAH için) tarafından ve Wendy ve Pediatrik Üroloji Araştırma Mükemmellik Ken Ruby Fonu tarafından desteklenmiştir. BMC Judith ve Çocuk Ürolojisi Robert Winston başkanıdır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-mercapto-1-hexanol (MCH) | Sigma | 451088 | Store at room temperature |
| 1,6-hexanedithiol (HDT) | Sigma | H-12005 | Store at room temperature |
| Thiolated capture probes | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
| Fluorescein-modified detector probes | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
| Bridging Oligonucleotide | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
| Anti-Fluorescein-HRP, Fab fragments | Roche | 11 426 346 910 | Store at 4 °C |
| Helios Chip Reader | GeneFluidics | GFR-2009 | |
| Sensor Chip Mount | GeneFluidics | GFR-003 | |
| Film well sticker | GeneFluidics | Shipped with sensor chips | |
| Bare gold 16-sensor array chips | GeneFluidics | SC1000-16X-B | Store in 100% N2 at room temperature |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | Store at 4 °C |
| 1M Phosphate Buffer, pH 7.2 | 0.35M NaH2PO4, 0.65M K2HPO4, adjusted to pH 7.2 | ||
| Blocker Casein in PBS | Pierce | 37528 | Dilute with an equal volume of 1M Phosphate Buffer, pH 7.2, store at 4 °C |
| Table 1. Reagents and Equipment. | |||
References
- Wu, J., Campuzano, S., Halford, C., Haake, D. A., Wang, J. Ternary Surface Monolayers for Ultrasensitive (Zeptomole) Amperometric Detection of Nucleic Acid Hybridization without Signal Amplification. Anal. Chem. 82, 8830-8837 (2010).
- Halford, C., et al. Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing by Sensitive Detection of Precursor Ribosomal RNA Using a Novel Electrochemical Biosensing Platform. Antimicrob. Agents Chemother. 56, In Press (2012).
- Campuzano, S., et al. Ternary monolayers as DNA recognition interfaces for direct and sensitive electrochemical detection in untreated clinical samples. Biosens. Bioelectron. 26, 3577-3584 (2011).
- Gau, V., et al. Electrochemical molecular analysis without nucleic acid amplification. Methods. 37, 73-83 (2005).
- Patel, M., et al. Target Specific Capture Enhances Sensitivity of Electrochemical Detection of Bacterial Pathogens. J. Clin. Microbiol. 49, 4293-4296 (2011).
- Mastali, M., et al. Optimal probe length and target location for electrochemical detection of selected uropathogens at ambient temperature. J. Clin. Microbiol. 46, 2707-2716 (2008).
- Liao, J. C., et al. Use of electrochemical DNA biosensors for rapid molecular identification of uropathogens in clinical urine specimens. J. Clin. Microbiol. 44, 561-570 (2006).
- Liao, J. C., et al. Development of an advanced electrochemical DNA biosensor for bacterial pathogen detection. J. Mol. Diagn. 9, 158-168 (2007).
- Pedrero, M., Campuzano, S., Pingarron, J. M. Electroanalytical sensors and devices for multiplexed detection of foodborne pathogen microorganisms. Sensors (Basel). 9, 5503-5520 (2009).
- Kuralay, F., Campuzano, S., Haake, D. A., Wang, J. Highly sensitive disposable nucleic acid biosensors for direct bioelectronic detection in raw biological samples. Talanta. 85, 1330-1337 (2011).
- Ecker, D. J., et al. Ibis T5000: a universal biosensor approach for microbiology. Nat. Rev. Microbiol. 6, 553-558 (2008).
- Casalta, J. P., et al. Evaluation of the LightCycler SeptiFast test in the rapid etiologic diagnostic of infectious endocarditis. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 28, 569-573 (2009).
