Summary
Vi beskriver en elektrokemisk metod sensor analys för snabb bakteriell detektion och identifiering. Analysen omfattar en sensor array med funktionella fånga DNA oligonukleotidsonder för ribosom RNA (rRNA) artspecifika sekvenser. Sandwich hybridisering av mål-rRNA med infångningsproben och en pepparrotsperoxidas-länkad DNA oligonukleotid detektorsonden ger en mätbar amperometriskt ström.
Abstract
Elektrokemiska sensorer används ofta för snabb och noggrann mätning av blodglukos och kan anpassas för detektion av en mängd olika analyter. Elektrokemiska sensorer fungerar genom att överföra en biologisk erkännande händelse till en användbar elektrisk signal. Signaltransduktion sker genom koppling av aktiviteten av ett redox-enzym till en amperometrisk elektrod. Sensor specificitet är antingen en inneboende egenskap av enzymet, glukosoxidas i fallet med en glukossensor, eller en produkt av bindning mellan enzymet och en antikropp eller prob.
Här beskriver vi en elektrokemisk metod sensor analys för att direkt upptäcka och identifiera bakterier. I varje fall de sonder som beskrivs här är DNA-oligonukleotider. Denna metod är baserad på sandwich-hybridisering av avskiljning och detektor sonder med målet ribosom RNA (rRNA). Den infångande sonden är förankrad till sensorytan, medan detektorn sonden är kopplad till horseradish peroxidas (HRP). När ett substrat, såsom 3,3 ', 5,5'-tetrametylbensidin (TMB) sätts till en elektrod med capture-target-detektor komplexen bundna till dess yta är substratet oxideras av HRP och reduceras av arbetselektroden. Denna redox körcykelresultat i shuttling av elektroner av substratet från elektroden till HRP, producerar strömflöde i elektroden.
Introduction
Använda rRNA som en målmolekyl för bakteriell detektion och identifiering har ett antal fördelar. Överflödet av rRNA i bakterieceller föreskrivs en känslighetsgräns så lite som 250 bakterier per milliliter utan behov av målamplifiering 1. Bakteriell rRNA innehåller unika artspecifika sekvenser som är tillgängliga för hybridisering med DNA-sonder. Följaktligen kan en uppsättning av elektrokemiska sensorer användas för att identifiera okända bakterier, där varje sensor är funktionaliserad med en annan artspecifik infångningsprob. Positiva-sensorer bör ingå för en syntetisk oligonukleotid mål som "broar" avskiljning och sonder detektor för att skapa en intern kalibrering signal.
Elektrokemiska sensorer har ett brett utbud av bastjänster och translationell forskning tillämpningar. Till exempel beskrivs analysen här har använts för att exakt mäta effekten av E. coli tillväxtfas på rrnA och pre-rRNA kopiera nummer, vilket är av stort intresse för forskare som är intresserade av bakteriell fysiologi 2. Känsligheten hos elektrokemiska sensorn analysen bestäms av signal-brusförhållandet. En mängd olika signalförstärkning och buller metoder minskning har utforskats. Vi finner att förbättra kemi sensorytan är nyckeln till att minska ospecifik bindning av detektorsonden och / eller HRP enzymet. I synnerhet, har en blandad monolager av alkanedithiols och mercaptohexanol befunnits reducera bakgrunden genom att täcka elektroden ytan mer fullständigt bibehållen tillgänglighet infångningsproben för mål hybridisering 3. Dessa ytkemi behandlingar är särskilt viktigt för analyser som inbegriper komplexa biologiska prover.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ett. Funktionalisering av elektrokemiska sensorer
- Förbered tiolerade infångningsproben vid en koncentration av 0,05 pM i 300 ^ M 1,6-hexanditiol (HDT), 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,3 M NaCl, 1 mM EDTA och inkubera i mörker vid rumstemperatur under 10 min . Inkubation av tiolerade infångningsproben med HDT säkerställer att tiolgruppen på infångningsproben reduceras, vilket resulterar i mer konsekventa resultat.
- Applicera en kväveström för att nakna guld 16 sensoruppsättning chip (er) för 5 sekunder för att avlägsna fukt och / eller partiklar.
- Applicera 6 pl av HDT-tiolerade infångningssökfragmentet mix till arbetselektroden för alla 16 sensorer av sensoruppsättningen och lagra sensorchipet (er) i en täckt petriskål vid 4 ° C över natten. Tiolerad infångningsprober binder direkt till den nakna guldelektroden och HDT verkar för att förhindra overpacking av infångningsproberna och hålla dem i en utsträckt konformation som främjar hybridisering med målet.
- Denefter dag, tvätta sensorchipet med avjoniserat H2O under 2-3 sek och torka under en ström av kväve under 5 sek.
- Applicera 6 pl av 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,3 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM 6-merkapto-1-hexanol (MCH) till arbetselektroden för alla 16 sensorer och inkubera i 50 min. Detta och alla efterföljande inkubationer sensor chip utförs i en täckt petriskål vid rumstemperatur. MCH fungerar som en blockerande medel, fylla i eventuella luckor där tiolerade infångningsproben eller HDT inte är närvarande på elektrodens yta.
2. Provberedning
- Överför 1 ml bakteriell kultur i logfas av tillväxt (OD 600 ≈ 0,1) till ett mikrocentrifugrör och centrifugera vid 16.000 xg under 5 min. Avlägsna odlingssupernatanten. Den bakteriella pelleten kan behandlas omedelbart eller lagras vid -80 ° C för senare användning.
- Grundligt resuspendera den bakteriella pelleten i 10 | il av 1 M NaOH genom att tillämpa pipettspetsen till bottenTom i mikrocentrifugrör och pipettera upp och ned flera gånger. Inkubera suspensionen vid rumstemperatur under 5 min.
- Neutralisera bakterielysatet genom att tillsätta 50 | il av 1 M fosfatbuffert, pH 7,2, innehållande 2,5% bovint serumalbumin (BSA) och 0,25 mM av en fluorescein-modifierad detektorsonden. Inkubera den neutraliserade lysatet under 10 min vid rumstemperatur. Fluorescein-modifierade detektor hybridiserar med bakteriella molekyler rRNAs.
Tre. Elektrokemisk sensor-analys
- Tvätta MCH från sensorn chip med avjoniserat H2O under 2-3 sek och torka under en ström av kväve under 5 sek.
- Applicera 4 pl av neutraliserad bakterielysat till arbetselektroden av vardera av 14 sensorer och inkubera i 15 min. Target-detektorsonden komplex hybridiserar till immobiliserade tiolerade infångningsprober.
- Applicera 4 pl av 1 nM överbryggande oligonukleotid i 1 M fosfatbuffert, pH 7,2, innehållande 2,5% BSA och 0,25 &mu, M fluorescein-modifierad detektorsonden till 2 positiva kontroll sensorer (används för signal normalisering) och inkubera i 15 min.
- Tvätta sensorchipet med avjoniserat H2O under 2-3 sek och torka under en ström av kväve under 5 sek.
- Applicera 4 pl av 0,5 U / ml anti-fluorescein-HRP i 1 M fosfatbuffert, pH 7,2, innehållande 0,5% kasein till arbetselektroden för alla 16 sensorer och inkubera i 15 min. Den anti-fluorescein-HRP binder till de immobiliserade fluorescein-modifierade detektor prober.
- Tvätta sensorchipet med avjoniserat H2O under 2-3 sek och torka under en ström av kväve under 5 sek.
- Applicera en film väl klistermärke till ytan av sensorchipet och belastning in sensorchipet mount. Pipettera 50 | il av TMB-substratet på alla 16 sensorer och stänga sensorchipet mount.
- Skaffa amperometri och cykliska mätningar voltammetri för alla 16 sensorer som använder Helios Chip Reader. Amperometrisk ström är proportionell mot graden av TMB reduction på sensorytan (se figur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi beskriver en elektrokemisk analys som är strukturerad på liknande sätt som en sandwich-ELISA. Såsom visas i figur 1, mål-ribosomalt RNA (rRNA) hybridisering med avskiljning och detektor prober är framtagen av ett redox-reaktion katalyserad av HRP konjugerad till anti-fluorescein-antikroppsfragment som binder till 3'-fluorescein länksystem på detektorn sonden. En viktig komponent i analyskänsligheten är ytkemin hos guldelektroden. Vi har funnit att en ternär monoskikt bestående av tiolerade infångningssonder, mercaptohexanol och hexanditiol signifikant förbättrar signal-till-brus-förhållandet genom att minska icke-specifik bakgrundsbindning av rapportörgenen protein 3. Analyserna som beskrivs här använder en GeneFluidics 16 chip avkännargrupp som visas i figur 2. Var och en av sensorerna i arrayen innehåller tre elektroder, arbetsgrupper, referens och extraanställda som har kontaktpunkter vid kanten av chipet 4. Chipet lästER har Pogo stift som ansluter med var och en av kontaktpunkterna. Chipet läsaren fungerar som ett gränssnitt för sensoruppsättningen med en potentiometer styrs av en dator algoritm.
Exempel på elektrokemisk sensor strömflödet visas i figur 3. Ström i sensorerna är konstlat högt under de första sekunderna efter amperometriska mätningar påbörjas på grund av ansamling av oxiderade substratet under tiden från tillämpningen av TMB till sensorytan att initiera läsaren algoritmen. Aktuellt flöde når snabbt ett stabilt tillstånd och korrekta sensoravläsningar tillförlitligt kan erhållas inom sextio sekunder. Sensor analyser utförs vanligen i två exemplar som en intern kontroll för sensor variabilitet. Vi har funnit att sensor-till-sensor variationen är relativt konstant, så det är möjligt att utföra 16 olika sensorer analyser parallellt på GeneFluidics 16-sensor array chip. Positiva och negativa kontroller är essential. Som en positiv kontroll, inkluderar vi en syntetisk "överbryggande" DNA-oligonukleotid som hybridiserar till både fångst och sonder detektor och fungerar som en syntetisk mål av känd koncentration. På detta sätt resultat erhölls med användning av de överbryggande oligonukleotid fungerar som en intern kalibrering kontroll för att minimera chip-till-chip variation.
Vid testning av avskiljning och sonder detektor, bör detektionsgränsen bestämmas genom seriell spädning av ett prov med känd koncentration. Såsom visas i figur 4, det finns ett linjärt log-log korrelation mellan provkoncentration och signalutgång över det dynamiska området för analysen. Detektionsgränsen definieras som den koncentration av mål som krävs för att generera en signal som är 3,29 standardavvikelser större än medelvärdet av bakgrundssignaler 5. För identifiering av bakterier i ett okänt prov, är en panel av relevant avskiljning och detektorpar sond vald. Valet av prober is bestäms av de typer av bakterier misstänks i en viss typ av prov. Naturligtvis kan ovanliga bakterier ibland hittas i något prov, så vi rekommenderar att en eubakteriell sond par ingå som har kapacitet att hybridisera till konserverade rRNA regioner av eventuella bakterier. Figur 5 visar representativa resultat för prover som innehåller E. coli och K. pneumoniae, som ofta finns i urinen hos patienter med urinvägsinfektion. Signaler för de flesta av sensorerna kommer att vara låg och liknande, och dessa negativa resultat kan slås samman som bakgrundssignal.
Figur 1. Schematisk beskrivning av elektrokemiska sensorn analysen. Guldet elektroden är belagd med mercaptohexanol och hexanditiol och funktionaliseras genom tillsats av tiolerade infångande DNA oligonukleotidsonder (blå). Sandwich hybridization av målet 16S rRNA med DNA oligonukleotidinfångningsprob och fluorescein-märkt DNA-oligonukleotid detektorsonden (röd), resulterar i ett komplex som detekteras genom tillsats av anti-fluorescein - pepparrotsperoxidas (HRP)-konjugat och TMB-substrat. Amperometrisk ström genereras av redox cykel som resulterar från oxidation av TMB genom HRP och reduktion av TMB genom elektroner från elektroden.
Figur 2. . Bakteriell identifieringssensor array och chip montering Varje sensor i uppställningen består av tre elektroder: en central arbetselektrod, en perifer referens elektrod och en extra elektrod för signal stabilisering. De arbetande elektroderna hos varje sensor i arrayen är funktionaliserade med en panel av infångningssonder specifik för bakteriearter av intresse (se tabell 3) som vi ll som EU (eubakteriell) infångningssond som hybridiserar till alla bakteriella 16S rRNA-molekyler och en Brol "överbryggande" oligonukleotid som fungerar som positiv kontroll för signal kalibrering. Signal mäts genom att placera array i ett chip läsare med Pogo stift som gränssnitt med de kontaktuppgifter sensorelektrod poäng.
Figur 3. Amperometrisk strömuttag under mätningen. Amperometrisk ström mäts parallellt för samtliga 16 givare i arrayen. Aktuellt flöde är initialt mycket negativt på grund av ansamling av oxiderad TMB substrat innan du ansluter arrayen till chip-läsare och starta mätningen. Därefter stabiliserar strömmen snabbt och sensoravläsningar redovisas till 60 sek. Elektroder med större negativ ström har de högsta signalerna.
"Figur 4" src = "/ files/ftp_upload/4282/4282fig4.jpg" />
Figur 4. Serial tiofaldig utspädning av E. coli att bestämma detektionsgränsen. Sensorer testades i duplikat med seriella tiofaldiga utspädningar av en känd koncentration av E. coli lysat. Den observerade signalen avläsningar, plottad som svarta cirklar, användes för att förutsäga en idealiserad signal kurva. Den poolade standardavvikelsen för alla replikat och bakgrunden signalen vid den lägsta målkoncentrationen användes för att beräkna detektionsgränsen (blå linje), definierad som 3,29 standardavvikelser över bakgrunden.
Figur 5. Representativa elektrokemiska sensor analysresultaten för Escherichia coli och Klebsiella pneumoniae. E. coli och K. pneumoniae testades med avseende på reaktivitet med probpar beskrivna i tabell 2 och 3. Reaktivitet med KE sonden paret skiljer K. pneumoniae från E. coli. Den överbryggande oligonukleotiden (Brol) tjänar som positiv kontroll och intern kalibrering standard.
| Probe Namn | Subenheten och ort * | Sekvens |
| KE Cap 10m | 16S 74 | 5'-S-AGCTCTCTGT |
| KE DET 11m | 16S 63 | 5'-GCTACCGYTCG-F |
| EK Cap 15m | 23S 1492 | 5'-AGCCTTGATTTTCCG-S |
| EK DET 15m | 23S 1507 | 5'-F-TCGTCATCACACCTC |
| EL Cap 17m | 23S 1507 | 5'-AGCGTTAAAAGGTACCG-S |
| EL Cap 18m | 23S 1507 | 5'-AGCGTTAADAAGGTACCG-S |
| EL DET 15m | 23S 1492 | 5'-F-TCGTCATCACACCTC |
| EB Cap 23m | 16S 1275 | 5'-S-ACTTTATGAGGTCCGCTTGCTCT |
| EB DET 23m | 16S 1252 | 5'-CGCGAGGTCGCCTTCCTTTGTAT-F |
| PM Cap 15m | 16S 183 | 5'-S-TTTGGTCCGTAGACA |
| PM DET 17m | 16S 166 | 5'-TTATGCGGTATTAGCCA-F |
| PA Cap 11m | 16S 453 | 5'-S-ACTTACTGCCC |
| PA DET 14m | 16S 439 | 5'-TTCCTCCCAACTTA-F |
| EU GN Cap 19m | 16S 1502 | 5'-S-GTTCCCCTACGGTTACCTT |
| EU DET 18m | 16S 1484 | 5'-GTTACGACTTCACCCCAG-F |
| EU Brol 37m | 5'-CTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAACCGTAGGGGAAC |
Tabell 2. DNA-oligonukleotidsond Pair sekvenser. Capture (Cap) sonder syntetiseras med tiol kopplingar (S). Detektor (DET) prober syntetiseras med fluorescein (F) modifieringar. Observera att probpar omfattar antingen en 5'-tiolerad infångningsprob och en 3'-fluorescein-modifierade detektor sond eller en 3'-tiolerad infångningsprob och en 5'-fluorescein-modifierad detektorsonden. De två EL infångningssonder blandas före användning. För att förenkla analysen kan detektor prober appliceras på varje sensor som en blandning utan signifikant korsreaktivitet. KE - Klebsiella och Enterobacter, EK - E.coli och K. pneumoniae, EL - E. cloacae, EB - Enterobacteriaceae familj, PM - P. mirabilis, PA - P. aeruginosa, EU - eubakteriella, Brol - Bridging Oligonucleotide. * - Plats numbra avser avståndet från början av 16S eller 23S-genen.
| Bakteriearter | Reaktiva probpar |
| Escherichia coli | EK + EB |
| Klebsiella pneumoniae | KE + EK + EB |
| Proteus mirabilis | PM + EB |
| Pseudomonas aeruginosa | PA |
| Enterobacter arter | KE + EB eller EL + EB eller KE + EL + EB |
Tabell 3. Erkännande av bakteriearter genom probpar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den elektrokemiska sensorn analys som beskrivs här möjliggör snabb upptäckt av nukleinsyramål. Känslighet och specificitet beror delvis på den fria energin för mål-sondhybridisering, vilket i sin tur beror på längden och GC-halten av avskiljning och sonder detektor. Vi utför typiskt hybridiserings stegen vid omgivande temperatur (~ 20 ° C) 5, 6. Däremot kan hybridisering stegen (3.2 och 3.3) även genomföras vid högre temperaturer i en hybridiseringsugn om chipset placeras i en täckt kammare innehållande fuktat filtrerpapper för att förhindra avdunstning 7, 8. Optimal signal erhålls med capture-detektor probpar som hybridiserar till intilliggande ställen på nukleinsyramål utan ett gap mellan de hybridiseringsställen 8. Denna signal förbättring är tänkt att fungera genom baspar stapling och genom att öka hybridisering tillgängligheten av angränsande regioner, känd som en "hjälpare sond" effekt. Capture-detektor probe hybridisering till angränsande områden är också viktigt eftersom alkalisk lys av bakterier resulterar i splittring av rRNAs 5. Denna metod kan tillämpas på påvisande av antingen RNA eller mål-DNA, med ett stort antal olika kliniska och forskning tillämpningar. Till exempel bör det vara möjligt att använda denna metod för att studera cellulära funktioner som regleras av små RNA eller att upptäcka antibiotiska mål resistensgen antingen som antingen DNA eller mRNA. Pre-amplifiering kan vara nödvändigt att upptäcka mål är närvarande vid låga kopietal. Dessutom bör RNAse hämmare tillsättas under provberedning för att förhindra nedbrytning av potentiellt instabila RNA-mål.
Denna metod har flera fördelar jämfört med andra metoder för att detektera och identifiera bakterier. Standard klinisk mikrobiologi metoder kräver bakterietillväxt på agar medium för kvantifiering och tillämpning av identifiering metoder. Tillväxt av bakterier till synliga kolonier involverar typisktinkubation över natten, avsevärt fördröja tiden från provtagning till rapportering av resultat. Det finns ett stort intresse för utveckling av snabbare, molekylära metoder för detektion av patogener, inklusive elektrokemiska biosensorer 9. Men, har lite uppmärksamhet ägnats åt utförandet av DNA biosensorer i raw biologiska prov. Den elektrokemiska sensorn analys som beskrivs här kan utföras direkt på serum-och urinprover utan en betydande förlust av känslighet 7. Användningen av tiolerade infångningssonder och den blandade monoskikt beskrivs här gör sensorytan resistent mot icke-specifik proteinabsorption, behålla känslighet i råa biologiska prover, inklusive serum eller urin 10. Så få som en bakteriecell per givare (250 bakterier per milliliter) är detekterbara, vilket är jämförbart med känsligheten hos PCR-amplifieringstekniker 1. Flera PCR-baserade bakteriell identifiering metoder har beskrivits 11, 12. Även om PCR kan potentiellt detektera färre målmolekyler än den elektrokemiska sensorn analys som beskrivs här, har PCR-baserade metoder uppnått begränsad antagande grund av den höga utrustning förvärv och / eller kostnader reagens, i förhållande till vanliga kliniska mikrobiologi metoder. Däremot elektrokemiska sensorer är relativt billiga att producera. Även om elektroderna är tillverkade av guld förstoftning, mängden guld per chip är lågt på grund av elektrodens tjocklek är bara 1000 Ångström.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alla författare är uppfinnare på patent som är relevanta för de beskrivna metoderna. En av dessa patent har licensierats till Qvella Corporation. BMC och DAH har ägarandel i Qvella Corporation. VG är ordförande GeneFluidics, vilket är tillverkaren av elektrokemisk sensor array chip, chip montering och chip-läsare som beskrivs i detta dokument.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av samarbetsavtal Award AI075565 (till DAH) från det nationella institutet för allergi och infektionssjukdomar samt av Wendy och Ken Rubin Fund for Excellence in Pediatric Urology Research. BMC är Judith och Robert Winston Stol i Pediatric Urology.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-mercapto-1-hexanol (MCH) | Sigma | 451088 | Store at room temperature |
| 1,6-hexanedithiol (HDT) | Sigma | H-12005 | Store at room temperature |
| Thiolated capture probes | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
| Fluorescein-modified detector probes | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
| Bridging Oligonucleotide | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
| Anti-Fluorescein-HRP, Fab fragments | Roche | 11 426 346 910 | Store at 4 °C |
| Helios Chip Reader | GeneFluidics | GFR-2009 | |
| Sensor Chip Mount | GeneFluidics | GFR-003 | |
| Film well sticker | GeneFluidics | Shipped with sensor chips | |
| Bare gold 16-sensor array chips | GeneFluidics | SC1000-16X-B | Store in 100% N2 at room temperature |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | Store at 4 °C |
| 1M Phosphate Buffer, pH 7.2 | 0.35M NaH2PO4, 0.65M K2HPO4, adjusted to pH 7.2 | ||
| Blocker Casein in PBS | Pierce | 37528 | Dilute with an equal volume of 1M Phosphate Buffer, pH 7.2, store at 4 °C |
| Table 1. Reagents and Equipment. | |||
References
- Wu, J., Campuzano, S., Halford, C., Haake, D. A., Wang, J. Ternary Surface Monolayers for Ultrasensitive (Zeptomole) Amperometric Detection of Nucleic Acid Hybridization without Signal Amplification. Anal. Chem. 82, 8830-8837 (2010).
- Halford, C., et al. Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing by Sensitive Detection of Precursor Ribosomal RNA Using a Novel Electrochemical Biosensing Platform. Antimicrob. Agents Chemother. 56, In Press (2012).
- Campuzano, S., et al. Ternary monolayers as DNA recognition interfaces for direct and sensitive electrochemical detection in untreated clinical samples. Biosens. Bioelectron. 26, 3577-3584 (2011).
- Gau, V., et al. Electrochemical molecular analysis without nucleic acid amplification. Methods. 37, 73-83 (2005).
- Patel, M., et al. Target Specific Capture Enhances Sensitivity of Electrochemical Detection of Bacterial Pathogens. J. Clin. Microbiol. 49, 4293-4296 (2011).
- Mastali, M., et al. Optimal probe length and target location for electrochemical detection of selected uropathogens at ambient temperature. J. Clin. Microbiol. 46, 2707-2716 (2008).
- Liao, J. C., et al. Use of electrochemical DNA biosensors for rapid molecular identification of uropathogens in clinical urine specimens. J. Clin. Microbiol. 44, 561-570 (2006).
- Liao, J. C., et al. Development of an advanced electrochemical DNA biosensor for bacterial pathogen detection. J. Mol. Diagn. 9, 158-168 (2007).
- Pedrero, M., Campuzano, S., Pingarron, J. M. Electroanalytical sensors and devices for multiplexed detection of foodborne pathogen microorganisms. Sensors (Basel). 9, 5503-5520 (2009).
- Kuralay, F., Campuzano, S., Haake, D. A., Wang, J. Highly sensitive disposable nucleic acid biosensors for direct bioelectronic detection in raw biological samples. Talanta. 85, 1330-1337 (2011).
- Ecker, D. J., et al. Ibis T5000: a universal biosensor approach for microbiology. Nat. Rev. Microbiol. 6, 553-558 (2008).
- Casalta, J. P., et al. Evaluation of the LightCycler SeptiFast test in the rapid etiologic diagnostic of infectious endocarditis. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 28, 569-573 (2009).
