Summary
Diese Video-Präsentation zeigt ein Verfahren zur Ernte der beiden wichtigsten stark vaskuläre Strukturen, die Vorderhirn Funktion unterstützen. Sie sind die Hirnoberfläche (oberflächliche) Gefäßsystem zusammen mit den zugehörigen Hirnhäute (MAV) und der Plexus, die notwendig für die zerebrale Durchblutung und Liquor (CSF) Homöostase sind.
Abstract
Diese Video-Präsentation wurde geschaffen, um eine Methode der Ernte die beiden wichtigsten stark vaskulären Strukturen zu zeigen, die ihren Wohnsitz nicht im Gehirn richtig, dass die Unterstützung Vorderhirn Funktion. Sie sind die Hirnoberfläche (oberflächliche) Gefäßsystem zusammen mit den zugehörigen Hirnhäute (MAV) und der Plexus, die notwendig für die zerebrale Durchblutung und Liquor (CSF) Homöostase sind. Das Gewebe geerntet ist für biochemische und physiologische Untersuchungen, und der MAV wurde gezeigt, dass sie empfindlich gegen Beschädigungen durch Amphetamin und Hyperthermie 1,2 hergestellt. Wie gut, sind die großen und kleinen zerebralen Blutgefäßverteilungen in MAV geerntet potenziell hohes Interesse bei der Untersuchung concussive Arten von Kopfverletzungen. Die MAV in dieser Präsentation seziert besteht aus der Pia-und einige der Arachnoidea (weniger Dura) der Hirnhaut und der großen und kleinen Hirnoberfläche Gefäßsystem. Der Plexus choroideus seziert ist die Struktur, in der l liegtateral Ventrikel von Oldfield und McKinley 3,4,5,6 beschrieben. Die Verfahren zum Ernten diese beiden Geweben verwendet erleichtern auch die Ernte von regionalen kortikalen Gewebe frei von Hirnhaut und größere Oberfläche zerebrale Gefäßsystem und ist kompatibel mit anderen Ernten Hirngewebe wie Striatum, Hypothalamus, Hippocampus, etc. Die Dissektion von den zwei Geweben dauert 5 bis 10 min insgesamt. Die Genexpressionsniveaus zur seziert MAV und Plexus choroideus, wie gezeigt und beschrieben in dieser Darstellung kann bei GSE23093 (MAV) und GSE29733 (Plexus choroideus) am NCBI GEO Repository. Diese Daten wurden, und wird verwendet, um weitere Verständnis der Funktionsweise des MAV und Plexus choroideus und wie neurotoxischen Ereignisse wie schwere Hyperthermie und AMPH beeinträchtigen ihre Funktion.
Protocol
Obwohl nicht in der Video gezeigt wurden Ratten erste eine Überdosis von 300 mg / kg Pentobarbital gegeben, was zu einer Anästhesie in weniger als 3 min, und dann durch Enthauptung getötet. Ihre Gehirne wurden dann schnell, aber vorsichtig aus dem Schädel entfernt und gekühlt in eiskaltem Kochsalzlösung für 5 min. Es ist wichtig, damit das Gehirn abkühlen dieser Zeitspanne vor Sezieren des MAV so dass der MAV von der Oberfläche der Rinde getrennt werden kann (der Oberseite der Schicht I). Das Hirn wurde dann in den Boden einer Petrischale Glas ruht auf Eis, das voll war (1 cm tief) eiskalter physiologischer Kochsalzlösung oder 0,1 M Natrium-Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung pH = 7,4 gestellt. Alle Präparation wird mit dem Gehirn zum größten Teil in Kochsalzlösung eingetaucht getan.
Ein. Die Entfernung der Zirbeldrüse
- Platzieren des Gehirns dorsalen Seite nach oben (bezogen auf den Boden der Petrischale). Die Zirbeldrüse liegt am kaudalen ventralen Bereich zwischen den beiden Hemisphären nur rostral t liegter Kleinhirn (pineal Vertiefung), und ist direkt unterhalb oder an der Oberfläche der Hirnhaut über der Colliculi. Entfernen Sie die Zirbeldrüse erste mit zwei kleinen gebogenen Spitze Pinzette. Es ist rosa in der Farbe wie der Hirnrinde, wird aber oft in den Resten von Blut und Gefäßen verbleibende vom Gehirn entfernt umgeben.
2. Entfernen des MAV
- Flip das Gehirn über "upside down" und trennen Sie die A. vertebralis, kleineren Arterien und Meningen für den pons aus der Hirnhaut und Gefäßsystem des Vorderhirns. Entfernen des Vorderhirns MAV wird dann gestartet.
Es ist wichtig, ventral beginnen in der Dissektion Prozess. Die großen großen Arterien aus dem Kreis der Willis, Mitte Hirnarterien (MCA) und der vorderen Arterien sind die stärksten und dienen als "Gerüst", mit denen die kleineren oberflächlichen Arterien und Arteriolen des Pia- Membran kann dann aus dem Kortex der Rest der Hirnhaut entfernt werden. Siehe Überprüfung durch Scremin 7 für mErz visuelle Darstellungen und Details der Hirnoberfläche Gefäßsystem. - Beginnend mit beiden Hemisphären, verwenden Sie die kleine gebogene Spitze Pinzette die hintere kommunizieren Arterie unmittelbar hinter der A. carotis interna Stelle durchtrennen. So trennt die weitere vorderen und hinteren arteriellen Bäumen des Vorderhirns. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die kontralaterale Hemisphäre.
- Ergreifen der MCA und der vorderen Arterie mit der Zange, ziehen in einer anterioren-dorsaler Richtung, so dass der MAV Abdecken des ventralen vorderen Kortex (piriformis, Riechtuberkel) über und um den Riechbahn angehoben wird. Dadurch wird ein Großteil der MAV für den vorderen Kortex (vereinzelten und Orbital).
- Schalten Sie das Gehirn in einem 45 bis 90 ° Winkel zu der Petrischale. Die seitlichen, stärker vordere Bereiche des MAV umgebenden seitlichen kortikalen Regionen (Granulat abgeschottet sekundären somatosensorischen und auditorischen Cortex) kann aus der Rinde durch Ergreifen des MCA und zugehörigen arter befreities und vorsichtig dorsal entlang der Hirnrinde. Falls erforderlich, können die Enden der Zange zum Heben und befreien die großen Arterien aus der Rinde beim Präparieren werden.
- Entfernen Sie nun die weitere hinteren seitlichen Regionen des MAV. (Beachten Sie, dass es am besten, von einer Hemisphäre zur anderen wechseln während dieser Ernte, um sicherzustellen, dass die MAV kalt und hydratisiert bleibt. Auch wenn der Widerstand bei der Befreiung der MAV aus der Rinde auf einer Hemisphäre Schalter auf der kontralateralen Hemisphäre gestoßen vorübergehend und gehen Sie dann wieder auf den ursprünglichen Hemisphäre später.)
- Um die am dorsalen Bereiche des MAV umgebenden primären somatosensorischen entfernen und motorischen Kortex des Gehirns drehen dorsalen Seite nach oben (bezogen auf den Boden der Petrischale). Um endlich befreien die MAV aus dem Gehirn, verwenden Sie die Enden der Zange entlang der sagittalen Sinus.
Dieser Teil des geernteten MAV kann entweder temporär beibehalten werden in eiskalter Kochsalzlösung bis zur Prüfung und Analyse eingefroren oder für eine spätere Verarbeitung. Oftdie MAV, welche die populärsten posterior / kaudalen Regionen des Kortex (entorhinalen, visuellen und auditiven Kortex meisten caudal) bleibt an der Hirnrinde. Seiner Entnahme wird später im Video, wenn die zwischen dem MAV retrosplenialen Cortex und die über den Colliculi seziert gezeigt.
3. Entfernen der Aderhaut Plexus
- Positionieren Sie das Gehirn Dorsalseite und halten Sie ihn mit den größeren Pinzette Drücken Sie die kleineren Pinzette nach unten durch die Mittellinie zwischen den Hemisphären und dann die Enden Punktion durch die Rinde und Corpus callosum (≈ -3,3 mm bregma) in der Spitze die Mittellinie des Hippocampus.
- Verwenden Sie die Zange, um den Kortex mit callosum wegziehen aus dem dorsalen Hippocampus und Septum, Aussetzen meisten der Seitenventrikel. Der Plexus geortet und identifiziert werden durch die rote Wellenlinie Abgrenzung der Hauptverkehrsader, die ihre Länge läuft. Mit den beiden Enden der Zange, um die Seitenwände des dritten ven hebelntricle und vergrößern Sie es am meisten kaudalen Ende (≈ -4,3 mm bregma 8).
- Mit den kleinen Zange, ziehen Sie dieses Ende des Plexus kostenlos. Dann die sehr Frontzahnbereich zwischen Septum und caudatus / Putamen (die meisten rostral Umfang ≈ 1,6 mm von Bregma) gehen und mit der Zange Vergrößern diesen Abschnitt des Ventrikels und ziehen Sie den Plexus kostenlos. Führen Sie den gleichen Vorgang auf der kontralateralen Hemisphäre, um den zweiten verbleibenden Plexus erhalten.
Auch dieses Gewebe kann entweder temporär beibehalten werden in eiskaltem Kochsalzlösung bis zur Prüfung und Analyse oder gefroren für eine spätere Verarbeitung.
4. Beseitigung der verbleibenden MAV im 3. Ventrikel Über der Thalamus und die Colliculi ebenso wie die auf die mehr Caudal Regionen des Cortex einschließlich retrosplenialen, auditiven und visuellen Cortex
- Entfernen Sie den gesamten Hippocampus aus beiden Hemisphären Aussetzen der MAV über den Thalamus und colliculi. Die Entfernung vondieser Teil des MAV ist viel weniger schwierig als die Entfernung von MAV über den Kortex.
- Ziehen Sie diesen Teil der MAV frei durch Ergreifen des größeren Gefäßen, die über dem vorderen Teil des Thalamus und vorsichtig kaudal. Das Gefäßsystem an die supra collicular Netzwerk verbunden und liefert Blut in den dorsalen Hippocampus und dorsalen Thalamus Netzwerk. Wegziehen kaudal und allmählich frei die supracollicular Netzwerk bis zum Erreichen der letzten Teile der Schwanzflosse arteriellen Kreis Gefäßsystem.
An diesem Punkt muß mehr darauf geachtet werden, alle verbleibenden hinteren ventralen MAV auf der Oberfläche des körnigen retrosplenialen, primären akustischen und visuellen Kortex zu entfernen. Wie bei dem anderen Abschnitt des MAV Abdecken der mehreren vorderen Teile des Cortex, kann dieses Gewebe entweder temporär beibehalten werden in eiskalter Kochsalzlösung bis zur Prüfung und Analyse eingefroren oder für eine spätere Verarbeitung. Ein verbleibender hinteren ventralen MAV mit diesem zweiten MAV Abschnitt geerntet sollte ein entfernt werdend hinzugefügt, um die erste seziert MAV Abschnitt über die Hirnrinde, wenn sie getrennt analysiert werden.
5. Repräsentative Ergebnisse
Wenn die Dissektion korrekt ausgeführt wird, sollten die resultierenden MAV Geweben in zwei intakten Entitäten Wiegen etwa 35 bis 45 mg insgesamt sein. Die zunächst seziert MAV Umgebung die meisten der Cortex sollte etwa 25 mg und der MAV für den Thalamus wiegen, sollten colliculi und okzipitalen Kortex wiegen etwa 15 mg. Es sollte leicht rosa in der Farbe von der Restblut im Gefäßsystem. Die bilaterale Plexus choroideus geernteten sollte in zwei intakten Gewebeproben mit jedem Wägevorgang 1 bis 2 mg liegen. Obwohl überschüssiges Wasser aus dem MAV entfernt werden vor der Lagerung oder Verarbeitung mit einem Papiertaschentuch, wie sie in der Linse Reinigung verwendet, um Gewebe zu vermeiden ist es nicht eine gute Idee, um überschüssiges Wasser aus dem seziert Plexus zu entfernen. Abbildung 1 wurde für generierte Vergleichen der Expression profil es in drei Regionen (Striatum, parietalen Kortex und MAV) unter kontrollierten Bedingungen mit Agilent-014.879 Whole Rat Genome 4x44K 60mer Oligonukleotid-Arrays (G4131F, Agilent Technologies, Palo Alto, CA; NCBI GEO Accession # GPL7294; GSE23093 und GSE29733, die anwesend sind, der NCBI GEO-Repository). Die beiden Kurven in der Figur zeigen die Expression bildlich in 1) das Striatum des parietalen Kortex verglichen und 2) der MAV der Parietalkortex verglichen. Es ist klar, dass das Striatum und Parietalkortex viel enger beieinander liegen als der MAV verwandt sind. Die Daten Vergleich der Plexus mit der MAV wird in einer zukünftigen Veröffentlichung vorgelegt. Jedoch ist es wahrscheinlich, dass die Profile in der Expression und MAV Plexus choroideus näher aneinander als sie an das Striatum und Parietalkortex sind verwandt. Abbildung 2 zeigt die differentielle Genexpression als Reaktion auf Hyperthermie (EIH) versus AMPH im Vergleich MAV zu kontrollieren und zu einander.
Inhalt "> Die Genexpression von mehr als 11.000 Gene, die mit offiziellen NCBI-Gen Symbole in MAV von Kontrolltieren wurde die im Striatum und parietalen Kortex aufgenommen verglichen. Über 2000 dieser Gene hatten ein 2,5-fach oder mehr unterschiedlichen Ausdruck in der MAV im Vergleich zu den zwei neuronale-reiche Gewebe und 550 Gene hatte eine 10-fach größere Differenz in Ausdruck. Etwas mehr als 40% (253) von diesen waren Gene mit einer verringerten Expression von 10-fach oder mehr in MAV und wurden bzgl. neuronale Funktion. Es gab 343 Genen mit über eine 10-fache oder größer Expression in MAV gegenüber Parietalkortex und Striatum. Diese Liste von Genen als Startpunkt, mit denen wurde verwendet, um Gene mit einer sehr hohen Anreicherung im MAV bestimmen. Tabelle 1 listet die Gene mit mehr als 15-fach, um die Expression in MAV Parietalkortex und Striatum verglichen und kategorisiert sie hinsichtlich Funktion. Viele dieser Gene an das vaskuläre System und / oder das Immunsystem verwandt waren. Diese Types von Genen sollte etwa 5 angereichert werden - bis 10 - fach bis wegen der erhöhten Vaskulatur selbst und Blut darin. Aber auch für Gene mit bekannten allgemeinen vaskulären Funktionen, eine Erhöhung über 15-fach zeigt Anreicherung in MAV. Es gab auch Anzahlen von Genen, die mit sehr großer fach Veränderungen waren: 1) Proteine der extrazellulären Matrix (nicht spezifisch an Vaskulatur Verwandte), 2) gelösten Transportern und 3) Lipid und Retinsäuremetabolismus. Wie gut, einige Wachstum und Differenzierung Gen oder Transkriptionsfaktoren gefunden.
Abbildung 1. Vergleich der Genexpression in MAV mit parietalen Kortex und Striatum. Volcano Plot Vergleich der Genexpression des parietalen Kortex und Striatum (oben plot) und dem parietalen Kortex und MAV (unten Plot). Die roten Symbole bezeichnen die Gene, die signifikant betwe sinden Regionen p <0,05 und eine 1,5-fache oder mehr unterschiedliche Expression zwischen den Regionen. Die schwarzen Symbole repräsentieren Gene, die nicht wesentlich zwischen den Regionen unterscheiden (p> 0,05) und weniger als das 1,5-fache, die sich in Ausdruck. Die rosa Symbole zeigen Gene mit weniger als einer 1,5-fachen Unterschied in der Expression, aber statistisch signifikant bei p <0,05. Die gelben Symbole Identifizierung von Genen, die eine 1,5-fache oder mehr Ausdruck haben, aber diese Änderung ist nicht statistisch signifikant bei p <0,05.
Abkürzungen
AMPH Amphetamin
EIH umwelt-induzierte Hyperthermie
MAV Hirnhäute und zugehörige zerebrale Gefäßsystem
Norm normothermen steuert
Abbildung 2. Auswirkungen der Hyperthermie und Amphetamin auf die Genexpression in MAV. Volcano Parzellen verglichenGenexpressionsniveaus im MAV nach Kochsalzlösung, EIH oder AMPH an der 3 hr Zeitpunkt. Die roten Symbole deuten die Gene, die als nicht signifikant unterschiedlich, während die schwarzen Punkte / Kreise Genen, die nicht signifikant zwischen Regionen unterscheiden repräsentieren. Zusätzliche statistische Analyse wurde verwendet, um zu überprüfen, welche die Expression Unterschiede zwischen der Kontrolle und Behandlung in der Tat statistisch signifikant waren.
| MAV Expression Gehirn Expression | NCBI Gene Symbole | Tissue Spezifität oder gemeldet Funktion (en) |
| > 50-fach | ANXA2 a, Col8a1, Des, ESM1, Glycam1, Kl a, Lect1, LEPR, Lum, MYH11, Ogn, Tagln, Thbs2, TNNT2 | Gefäßsystem & Heart |
| > 50-fach | CCL19, CD74 a, Defb1, Lrrc21, MGL1, Mrc1, Msln, Pla2g5, PRG4, RT1-Bb, RT1-Da | Immune System |
| > 50-fach | Adh1, Aebp1, Aldh1a2, GSTM2 | Retinsäure & Lipid-Verarbeitung |
| > 50-fach | Cdh1, COL3A1, COL1A2, Colec12, Cpxm2, CPZ, DCN, Emp3, GPC3, Nupr1, OMD, Pcolce Slamf9, Tmem27, TSPAN8 | Extrazellulären Matrix & Zell-Zell-Verbindungen |
| > 50-fach | AQP1, Asgr1, Kcnj13, Slc5a5, Slc6a13, Slc6a20, Slc22a6, Sned1, Ttr | Ion & Solute Homöostase |
| > 50-fach | AlX3, CDKN1C, FOXC2, IGFBP2, Ifitm1, Ifitm2, Nkx6-1, OSR1, Prrx2, sFRP1, TBX15. Upk1b, Wisp2, Wnt6 | Development & Transcription Verordnung |
| > 50-fach | Gpha2, Mfap5, Mpzl2 Plac8, Scgb1c1, Sostdc1, Steap1 | Unknown & Sonstiges |
| 30 bis 50-fache ANXA1 a, Angpt2, C6 a, GJB2, Ptgis, Thbd, TIMP1 | Gefäßsystem & Heart | |
| 30 bis 50-fache | Casp12, CCL2, Ccr1, CD14, CXCL10 Ifitm3, Klra5, LGALS1, LGALS3, Ms4a4a, Ms4a7, Plscr1, SPP1, XCL1 | Immune System |
| 30 bis 50-fache | Col6a3, Cpxm1, EFEMP1, Fmod, MGP, NID2 | Extrazellulären Matrix & Zell-Zell-Verbindungen |
| 30 bis 50-fache | Cp, CUBN, GCGR, S100A6, Scn7a, Sct, Slc4a5, Slc16a11, Slco1a5 | Ion & Solute Homöostase |
| 30 bis 50-fache | Cfd, CH25H, CRABP2, Rarres2 | Retinsäure & Lipid-Verarbeitung |
| 30 bis 50-fache | BMP6, Casp12, DAB2 Folr1, Igf2, Msx1, Tbx18, TWIST1, Wnt5b | Development & Transcription Verordnung |
| 30 bis 50-fache | Cela3b, CLN6, C1qtnf7, Copz2, Dhrs7c, Gng11, Prss23, Srpx, Vim | Unknown & Sonstiges |
| 15 bis 30-fache | Adm, Angpt1, Angptl2, BGN, Cklf a, CNN1, Cox8h, Ctsk, F13a1, GJA5, Klf4, Lox, Lyz, Myl9, Procr, PROS1, RT1-Ba, Serpinb10, SERPING1, Serpinf1, Tgm2, Tnmd, Trim63, Txnip a, Vamp5, Vtn | Gefäßsystem & Heart |
| 15 bis 30-fache | Ada a, BST2, Ccl6, CD40, CD68, CTSC, Dap, Faim3, Fkbp9, Fxyd5, FMO1, GLIPR1, IER3, Ifi47, Igsf6, Msc, Nfatc4, RT1-Db1, Serpinb1a, TiR4, Tubb6 | Immune System |
| 15 bis 30-fache | Adamtsl4, COL1A1, Crb3, Dpt, Egfl3, FBN1, Fbln1, FBLN5, Fn1, ITGB4, Lama2, Lgals3bp, Loxl1, Mfap4, MMP14, Mmp23, PPIC, SERPINH1, TIMP3 | Extrazellulären Matrix & Zell-Zell-Verbindungen |
| 15 bis 30-fache | Cybrd1, Selenbp1, SLC2A4, Slc9a2, Slc13a3, Slc16a4, Slc22a8, Slc22a18 | Ion & Solute Homöostase |
| 15 bis 30-fache | AGPAT2, Bdh2, CYP26B1, Lpar3, Ltb4dh, Olr1, PON3, RBP1, RBP4 | Retinsäure & Lipid-Verarbeitung |
| 15 bis 30-fache | ATF3, DKK4, Eya2, Ifitm7, LTBP1, Mustn1, Nr2f2, PTRF, SphK1, TGFBI, Tcea3 Tcfap2b, Wnt2b, Wnt5a, ZIC1 | Development & Transcription Verordnung |
| 15 bis 30-fache | Adamts12, Adamtsl3, C1r, Crispld2, Crygn, CYP1B1, DSE, Enpep, Enpp2, Epn3, FLNA, FMO3, GNMT, Gprc5c, HSPB1, Klc3, KRT18, Krt19, MDK, Mesp1, Ms4a6a, Ms4a6b, Ms4a11, Net1, Pdlim2, Phactr2, PLP2, Ppp1r3b, Pqlc3, RIN3, Spag11, SULT1A1, Tmem106a, Wfikkn2 | Unknown & Sonstiges |
* Genes in der Tabelle enthalten sind sowohl mehr als 15-fach über Expression im Striatum und Pariet seinal Cortex und 5-fach über dem Hintergrund Ebenen. Das untere der beiden Verhältnissen (MAV / Striatum oder MAV / parietalen Cortex) für jedes Gen wurde für die Gruppierung verwendet.
a Gene werden in Endothelzellen gefunden, aber auch wahrscheinlich eine wichtige Rolle bei der Vermittlung Immunantworten.
Tabelle 1. Genes mit einem 15-fach * oder mehr erhöhte Expression in MAV im Vergleich zum Striatum und parietalen Kortex.
Discussion
Technische Aspekte der MAV und Plexus Dissektion
Es ist kritisch, während der Dissektion der MAV, damit das Gehirn "eingetaucht" die meiste Zeit in dem normalen Kochsalzlösung oder Natriumphosphat-gepufferte Kochsalzlösung. So dass die MAV und Kortex beim Präparieren austrocknen wird in der MAV Einhaltung eng an Rindenschicht I. Dies die Menge des kortikalen Gewebes mit der MAV und / oder das Ergebnis in der Unfähigkeit, diese Einhaltung MAV Abschnitte aus der Rinde zu entfernen geerntet erhöhen führen. Außerdem ist Geduld erforderlich beim Präparieren. Noch einmal, wenn begegnet man gewissen Widerstand beim Entfernen des MAV vom Kortex in einer Hemisphäre beim Präparieren, auf die andere Halbkugel umzuschalten und gehen später wieder zu der Seite, wo Widerstand angetroffen wurde. Diese Methode dauert einige Übung, um perfekte und erfordert etwa 5 bis 15 "Praxis" Dissektionen, bevor eine konsequent einheitliche Ernte von MAV Gewebe erreicht. Das Verfahren zum Starten der Dissektion und removal des MAV am arteriellen Kreis an der Unterseite des Gehirns erleichtert die Entfernung der Hirnhaut mit dem größeren Gefäßsystem als Träger "Gerüst".
Ein Großteil des ursprünglich im Blut MAV Gefäßsystems nach der Tötung sollte während der Dissektion ausgestoßen werden, und weniger als 5% der RNA aus MAV geerntet sollte von Blut Ursprungs sein. Es ist möglich, fast alles Blut durch Perfusion des Tieres mit 50 bis 70 ml Kochsalzlösung, mittels histologischer Techniken, vor Dekapitation und Gehirn Entfernung zu entfernen. Allerdings ist es dann wesentlich schwieriger, die MAV Geweben beim Präparieren visualisieren. Die drei wahrscheinlichsten Quellen von "Verunreinigung" der MAV Gewebe sind die Zirbeldrüse, kortikale Schicht I Gewebe und restliches Riechkolben Gewebe aber es ist auch möglich, Hypophyse Gewebe bei der Herstellung zu erhalten. Pineal Kontamination in der MAV erhält MAV enthaltend ein rund 1 bis 2 mm Durchmesser, die farbige Kugel dunkelrot ist nachgewiesen. Die primäre Funktionder Zirbeldrüse wird normalerweise als völlig verschieden von der MAV. Seine primäre Funktion ist es, Melatonin, das Aspekte des zirkadianen Rhythmus 9 regelt, und in Lipoxygenierung 10 von Lipidvorstufen produzieren. Obwohl das Gen Lox, die Lipoxygenase-Aktivität reguliert, wurde angenommen, dass in erster Linie im Erwachsenen Zirbeldrüse 10 zeigen unsere Ergebnisse, dass es auch konsequent anwesend signifikante Niveaus in MAV. Restliches kortikalem oder Riechkolben Kontamination Ergebnisse im pinkish stegartige MAV Gewebe mit etwa 1 bis 2 mm dichteren Geweben, die viel heller in der Farbe in ihr eingeschlossen sind. Dies kann durch "schwimmt" der MAV auf der Oberfläche des Puffers, und dann Entfernen der schwereren kortikalen oder Birne Geweben unter Verwendung der beiden Dissektionszange gesichtet werden.
Bei Verunreinigungen des MAV aus Rindenschicht Ich Gewebe, Hypothalamus Gewebe oder die Zirbeldrüse vorhanden ist, dann mehrere Gene haben eine signifikantdeutlich mehr Ausdruck als das, was normalerweise in einem "sauberen" dissection vorhanden. Kontamination des MAV mit Zirbeldrüse wird höhere Expression Arylalkylamin-N-acetyltransferase (AANAT), die für Melatoninsynthese ist resultieren. Leider wenn pineal Verunreinigung tritt während MAV Dissektion, werden die Niveaus der Lox in MAV möglicherweise nicht genau bestimmt werden. Kontamination des MAV mit kortikalen Gewebe wird höhere Expression von Neuron-spezifische Gene wie hippocalcin (HPCA), Parvalbumin (Pvalb) und / oder neuronalen Pentraxin Rezeptor (Nptxr) führen. Kontamination MAV mit hypothalamischen Gewebe wird im höheren Expression des Wachstumshormons 1 (GH1), Proopiomelanocortin (POMC) führen. Für den Fall, dass einige Verunreinigungen existiert in den geernteten Geweben können die meisten dieser Gene identifiziert und nicht in Genexpressionsanalyse verwendet. Dies ist besonders wichtig für Gene, die in der zirkulierenden blood, die noch vorhanden sein können, in MAV oder der Aderhaut Plexus.
Interpretting Genexpression Daten aus geernteten MAV und Plexus
Der zerebrale Oberfläche (oberflächlich) Gefäßsystem zusammen mit den zugehörigen Hirnhäute (MAV) und der Plexus sind notwendig für die zerebrale Durchblutung und Liquor (CSF) Homöostase 4,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17. Das Gewebe Ernte ist geeignet für biochemische und physiologische Untersuchungen, und der MAV wurde gezeigt, dass sie empfindlich gegen Beschädigungen durch Amphetamin und Hyperthermie 1,2 durch Genexpressionsanalyse hergestellt. Diese Ergebnisse sind angemessen mit dem, was auch über schwere Hyperthermie und Exposition gegenüber Amphetaminen an das Gehirn Gefäßsystem im Allgemeinen 18,19,20 bekannt. Menschliche klinische Daten stützen die Überzeugung, dass die subduralen Gefäßsystem empfindlich auf durch Amphetamin und Methamphetamin 21,22 beschädigen. Wie gut, darunter die großen und kleinen zerebralen BlutgefäßverteilungenING die in der Pia-Schicht der Hirnhäute, die in MAV geerntet werden, sind potenziell hohes Interesse bei der Untersuchung concussive Arten von Kopfverletzungen 23,24 25. Die aktuelle Genexpressionsprofil ergab aus der MAV bedeutet, dass der Pia und möglicherweise die Arachnoidea Meningen kann eine größere Rolle als bei der Regulierung CSF Zusammensetzung erwartet spielen. In der Zukunft durch die Verwendung von Techniken Präpariermikroskop, kann es möglich sein, eine weitere Aufteilung der Gewebe umfassend den MAV so dass die pialen und Arachnoidea Membranen vom größeren arteriellen Gefäßsystem vorliegenden und ggf. voneinander getrennt werden können. Dies ermöglicht eine bessere Interpretation der Funktion eines jeden dieser drei Bestandteile des geernteten MAV.
Disclosures
Wir haben nichts zu offenbaren. Die hier vorgestellte Arbeit kann nicht notwendigerweise die Meinung der Food and Drug Administration.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von NCTR / FDA finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Normal Saline (9 grams saline/ 1 Liter H2O) | In-house | Dissection buffer | |
| 0.1 M Sodium Phosphate pH 7.4 | In-house | Dissection buffer | |
| Bone Rongeurs | Roboz | RS-8300 | Skull bone removal |
| Forceps-bent tip (4" long & 0.8 mm wide tip) | Roboz | RS-5135 or RS-5137 | Dissecting forceps |
| Forceps-straight tip (5.5" long ) | Roboz | RS-8124 or RS-8104 | Thumb Dressing forceps |
References
- Thomas, M., George, N. I., Patterson, T. A., Bowyer, J. F. Amphetamine and environmentally induced hyperthermia differentially alter the expression of genes regulating vascular tone and angiogenesis in the meninges and associated vasculature. Synapse. 63, 881-894 (2009).
- Thomas, M., et al. Endoplasmic reticulum stress responses differ in meninges and associated vasculature, striatum, and parietal cortex after a neurotoxic amphetamine exposure. Synapse. 64, 579-593 (2010).
- Ek, C. J., Dziegielewska, K. M., Habgood, M. D., Saunders, N. R. Barriers in the developing brain and Neurotoxicology. Neurotoxicology. , (2012).
- Oldfield, B. J. M., Michael, J. The Rat Nervous System. Paxinos, G. 2, Academic Press. San Diego. 391 (1995).
- Johanson, C. E., Stopa, E. G., McMillan, P. N. The blood-cerebrospinal fluid barrier: structure and functional significance. Methods Mol. Biol. 686, 101-131 (2011).
- Johanson, C. E. Multiplicity of cerebrospinal fluid functions: ? challenges in health and disease. Cerebrospinal Fluid Res. 5, (2008).
- Scremin, O. U. The Rat Nervous System. Paxinos, G. 2, Academic Press. San Diego. 3 (1995).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. San Diego. (1995).
- Johnston, J. D. Photoperiodic regulation of prolactin secretion: changes in intra-pituitary signalling and lactotroph heterogeneity. J. Endocrinol. 180, 351-356 (2004).
- Catala, A. The function of very long chain polyunsaturated fatty acids in the pineal gland. Biochim. Biophys. Acta. 1801, 95-99 (2010).
- Burnstock, G. Neurogenic control of cerebral circulation. Cephalalgia. 5, Suppl 2. 25-33 (1985).
- Hamel, E. Perivascular nerves and the regulation of cerebrovascular tone. J. Appl. Physiol. 100, 1059-1064 (2006).
- Johanson, C. E., et al. Cognitive function and nigrostriatal markers in abstinent methamphetamine abusers. Psychopharmacology (Berl). 185, 327-338 (2006).
- Johnston, M., Papaiconomou, C. Cerebrospinal Fluid Transport: a Lymphatic Perspective. News Physiol. Sci. 17, 227-230 (2002).
- Johnston, M., Zakharov, A., Koh, L., Armstrong, D. Subarachnoid injection of Microfil reveals connections between cerebrospinal fluid and nasal lymphatics in the non-human primate. Neuropathol. Appl. Neurobiol. 31, 632-640 (2005).
- Johnston, M., et al. Evidence of connections between cerebrospinal fluid and nasal lymphatic vessels in humans, non-human primates and other mammalian species. Cerebrospinal Fluid Res. 1, 2 (2004).
- Kulik, T., et al. Regulation of cerebral vasculature in normal and ischemic brain. Neuropharmacol. 55, 281-288 (2008).
- Bowyer, J. F., Ali, S. F. High doses of methamphetamine that cause disruption of the blood-brain barrier in limbic regions produce extensive neuronal degeneration in mouse hippocampus. Synapse. 60, 521-532 (2006).
- Sharma, H. S., Westman, J., Nyberg, F. Pathophysiology of brain edema and cell changes following hyperthermic brain injury. Prog. Brain Res. 115, 351-412 (1998).
- Sharma, H. S., Sjoquist, P. O., Ali, S. F. Drugs of abuse-induced hyperthermia, blood-brain barrier dysfunction and neurotoxicity: neuroprotective effects of a new antioxidant compound H-290/51. 13, 1903-1923 (2007).
- Ho, E. L., Josephson, S. A., Lee, H. S., Smith, W. S. Cerebrovascular complications of methamphetamine abuse. Neurocrit. Care. 10, 295-305 (2009).
- Ohta, K., et al. Delayed ischemic stroke associated with methamphetamine use. J. Emerg. Med. 28, 165-167 (2005).
- Brenner, L. A. Neuropsychological and neuroimaging findings in traumatic brain injury and post-traumatic stress disorder. Dialogues Clin. Neurosci. 13, 311-323 (2011).
- Case, M. E. Inflicted traumatic brain injury in infants and young children. Brain Pathol. 18, 571-582 (2008).
- Maas, A. I., et al. Prognostic value of computerized tomography scan characteristics in traumatic brain injury: results from the IMPACT study. J. Neurotrauma. 24, 303-314 (2007).
