Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

Optimeret farvning og spredning modelleringsmetoder for celledeling Overvågning ved hjælp cellesporing Farvestoffer

doi: 10.3791/4287 Published: December 13, 2012

Summary

Succesfuld brug af cellesporing farvestoffer til at overvåge immun celle funktion og proliferation involverer flere kritiske trin. Vi beskriver metoder til: 1) opnåelse af lys, ensartet og reproducerbar etiket-ning med membran farvestoffer, 2) udvælgelse af fluorokromer og dataopsamling betingelser, og 3) at vælge en model til at kvantificere celleproliferation baseret på farvestof fortynding.

Abstract

Fluorescerende cellesporing farvestoffer, i kombination med flow og image cytometri, er stærke redskaber til at undersøge samspillet og skæbne af forskellige celletyper in vitro og in vivo. 1-5 Selv om der er bogstaveligt talt tusindvis af publikationer ved hjælp af sådanne farvestoffer, hvoraf nogle de hyppigst forekommende celle tracking applikationer omfatter overvågning af:

  1. stamceller og progenitorceller ubevægelighed, proliferation og / eller differentiering 6-8
  2. antigen-driven membran transfer 9 og / eller precursor celleproliferation 3,4,10-18 og
  3. immunregulatoriske og effektorcelle-funktion 1,18-21.

Kommercielt tilgængelige cellesporing farvestoffer varierer meget i deres kemiske og fluorescensegenskaber, men størstedelen falder i en af ​​to klasser baseret på deres den celle-mærkning. "Membrane farvestoffer", typisk kendetegnet ved PKH26, er yderst lipofile farvestoffer that partition stabilt, men ikke-covalent til cellemembraner 1,2,11. "Protein farvestoffer", typisk kendetegnet ved CFSE, er amino-reaktive farvestoffer, der danner stabile covalente bindinger med celleproteiner 4,16,18. Hver klasse har sine egne fordele og begrænsninger. Nøglen til deres succesfulde anvendelse, især i flerfarvet undersøgelser, hvor flere farvestoffer anvendes til at spore forskellige celletyper, er derfor at forstå de kritiske spørgsmål muliggør optimal udnyttelse af hver klasse 2-4,16,18,24.

De protokoller, der er medtaget her fremhæve tre almindelige årsager til dårlig eller varierende resultater, når du bruger celle-tracking farvestoffer. Disse er:

  1. Manglende opnåelse af lys, ensartet og reproducerbar mærkning. Dette er et nødvendigt udgangspunkt for enhver cellesporing undersøgelse, men kræver opmærksomhed på forskellige variabler ved brug membran farvestoffer end ved anvendelse af protein farvestoffer eller ligevægtsbinding reagenser, såsom antistoffer.
  2. Suboptimal fluorochrom kombinationer ennd / eller manglende omfatte kritiske kompensation kontrol. Sporing farvestoffluorescens er typisk 10 februar - 10 marts gange lysere end antistof fluorescens. Det er derfor vigtigt at verificere, at tilstedeværelsen af ​​sporing farvestof ikke forringer evnen til at påvise andre prober, der anvendes.
  3. Manglende opnåelse af god pasning med peak modeling software. Sådan software giver mulighed for kvantitativ sammenligning af proliferative reaktioner på tværs af forskellige populationer eller stimuli baseret på precursor frekvens eller andre målinger. Opnåelse af en god pasform, kræver imidlertid udelukkelse af døde / døende celler, der kan forvride farvestof fortynding profiler og matchning af de antagelser modellen med karakteristika observerede farvestof fortynding profil.

Eksemplerne her illustrerer, hvordan disse variabler kan påvirke resultaterne ved brug membran og / eller protein farvestoffer til overvågning af celleproliferation.

Protocol

1. Generelt Membran Mærkning med PKH26 Cell Tracking Dye (ref. 25, figur 1)

  1. Brug steril teknik for trin fra 1,1 til 1,9. Forbered ~ 10 7 humane perifere mononukleære blodceller eller lymfocytter (hPBMC, HPBL) ved hjælp af laboratoriets standardmetoden med tilsætning af en endelig 300 xg centrifugering for at minimere blodplade-kontaminering. Resuspender cellerne ved 10 7 / ml i HBSS + 1% BSA og anbring på is, reservere en 500 pi portion (5x10 6 celler) til anvendelse i trin 2.
  2. Place 5x10 6 celler (500 ul) i en 12 x 75 mm konisk polypropylenrør. Vask en gang med 3,5 ml HBSS. Forsigtigt sug supernatanten, så ikke mere end 15-25 ul residualvæske, men pas på ikke at fjerne celler. Brug dette rør til fremstilling af en 2x cellesuspension i trin 1.4.
  3. I cellen vask i trin 1.2, tilsættes 0,5 ml Diluent C mærkning køretøj (fra PKH26GL kit) til et 12 x 75 mm konisk polypropylenrør. Brug dette rør til preper en 2x PKH26 opløsning i trin 1.5.
  4. Tilsæt 0,5 ml Diluent C mærkning køretøj til den vaskede cellepellet fra trin 1.2 og opsuge og udlevere 3-4 gange til opnåelse af en enkelt cellesuspension (2x celler). Undgå dannelse af luftbobler og overdreven blanding, som kan reducere cellelevedygtigheden og nyttiggørelse.
  5. Umiddelbart efter fremstilling af 2x cellesuspension i trin 1.4, udarbejde et 2x (4 uM) farveopløsning ved tilsætning af 2,0 pi 1,0 mM PKH26 dye stamopløsning i ethanol (fra PKH26GL kit) til Diluent C røret fremstillet i trin 1.3 og vortex til spredes jævnt.
  6. Umiddelbart efter fremstilling af 2x farveopløsning i trin 1,5, pipetteres hurtigt 2x cellesuspension fra trin 1,4 til 2x farveopløsning og samtidig Sug og dispensere 3-4 gange for helt at sprede celler i farvestof må ikke:. Tilføje 1,0 mM farvestof direkte til celler, hæld 2x celler i 2x farvestof, eller tilføje 2x celler til 2x farvestof medens der blev hvirvelbehandlet. Idet farvningen er næsten øjeblikkelig, sådanne metoder giver mindreensartede intensiteter end den anbefalede metode (figur 2).
  7. Efter 1 min, tilsæt 1,0 ml af varmeinaktiveret serum eller HBSS + 5% BSA til at stoppe farvestofoptagelse i cellemembraner. Hvis der ikke anvendes tilstrækkeligt protein risikerer dannelse af farvestof-aggregater, der kan pellet med celler under vasketrinene og forårsage utilsigtet mærkning af andre celler til stede i et eksperiment. Hvis medium med 10% varmeinaktiveret serum (CM) eller HBSS +1% BSA skal anvendes som stopreagens, foretager farvning i et 15 ml konisk polypropylenrør, og der tilsættes mindst 5,0 ml stopreagens for at sikre adsorption af alle ikke-inkorporeret farvestof.
  8. Centrifuger de mærkede celler i 5 min @ ~ 400 x g. Forsigtigt sug supernatanten uden at fjerne celler. Vask pelleten to gange med 4 ml CM eller HBSS + 1% BSA, dispergering pelleten længe før recentrifugering. For at minimere overførsel af farvestof adsorberes på rørvæggene og maksimere vaskeeffektiviteten, overfører cellerne til et frisk polypropylenrør efter first resuspension. Bemærk: tilstrækkeligt farvede celler vil udvise en udpræget rosa skær i pelleten.
  9. Resuspendere det vaskede cellepellet i 1,0 ml HBSS + 1% BSA. Tæl cellerne, bestemme celleindvinding, og justere volumen til opnåelse af en slutkoncentration på 10 7 / ml. Med omhyggelig aspiration, bør celleindvinding være ≥ 85%. Hvis celle opsving er <70%, fastslå årsagen før du går videre. Træk en 150 gl alikvot (1.5x10 6 celler) og sted på is til brug i trin 2.

2. Udarbejdelse af Instrument-og Assay Setup Controls (tabel 1)

  1. Portion 50 gl (5x10 5) af ufarvede celler fra cellesuspensionen gemt i trin 1,1 i hver af fem 1,8 ml Eppendorf-rør: 1, 3, 4, 5 og 7. Portion 50 gl (5x10 5) af PKH26 pos celler fra trin 1,9 i hvert af tre rør: 2, 6 og 8.
  2. Tilsæt 10 gl IgG blok (100 ug / rør af IgG, jf. tabel af reagenser) til rør 1-8og inkuberes i 10 minutter ved stuetemperatur (20-25 ° C).
  3. Tilføj en mættende mængde af antistoffet (e) angivet i tabel 1 til rørene 4, 5, 7 og 8 og inkuberes alle prøver (Rør 1-8) i 30 min ved omgivelsestemperatur og beskyttet mod lys.
  4. Tilsættes 1,5 ml HBSS + 1% BSA til alle prøver, pelletering af cellerne ved centrifugering (5 min @ 400 x g) og vaskes én gang med 1,5 ml HBSS + 1% BSA, med omhyggelig aspiration at undgå celletab.
  5. Resuspender hver prøve i 500 ul HBSS +1% BSA. Hvis det er nødvendigt, at prøver skal analyseres på din cytometer, overførsel til en 12 x 75 mm rund bund rør. Der tilsættes 10 pi af 100 ug / ml 7-AAD dagligt arbejdslager (se tabel af reagenser) til rør 3, 6, 7 og 8 som angivet i tabel 1. Der inkuberes på is i 30 minutter før anvendelse i flowcytometeret opsætning og farvning verifikation (trin 3).

3. Flow Cytometer Setup og Staining Verifikation

  1. Kontroller, at strømmen cytometer fungerer korrekt, ved hjælp af laboratoriets etablerede procedurer for daglig kvalitetskontrol. Kontrollere, at signaler let kan påvises i hver spektral vindue, der skal anvendes, og at detektorresponsene er lineært proportional med signalintensitet i vinduet skal anvendes til proliferation overvågning 14.
  2. Erhverve FSC vs SSC data for Tube 1 under anvendelse af lineære display skalaer. Justere hver enkelt detektors forstærkning, således at lymfocytpopulationen falder i den nedre venstre kvadrant af dot-plot, ikke uden for skalaen i enten parameter, og er ikke afbrudt på grund af tærskelværdiansættelse. Saml ungated FSC vs SSC data for alle prøver i Steps 3,3 til 3,7.
  3. Erhverve data for Rør 1 uden brug af farve-kompensation og logaritmiske displayskalaer for alle 4 fluorescens detektorer. Justere hver enkelt detektors højspænding (HV) for at placere autofluorescens af ufarvede lymfocytter i skala med nogle få / ingen celler akkumuleres i den første kanal. Indstil en analyse grænse for hvert histogramsvarende til den lyseste 2% af ufarvede celler.
  4. Brug ingen farve kompensation og HV-indstillingerne er etableret i trin 3,2 og 3,3, erhverve data for Tube 2, indsamling FSC, SSC og signaler i alle 4 fluorescens detektorer. For detektoren bruges til at overvåge PKH26 fluorescens, kontrollere, at alle PKH26 pos celler vises på skalaen som en enkelt symmetrisk spids i 3 rd -4 th årti med få / ingen celler i den sidste kanal. Hvis der er flere toppe eller topform er skæv, skal du gentage trin 1 med omhyggelig opmærksomhed på salt minimering og blanding teknik (figur 2). Hvis det er nødvendigt, justeres farvestof koncentration.
  5. Brug af indstillinger, der er etableret i trin 3,3 erhverve data for Tube 3, indsamle FSC, SSC og signaler i alle 4 fluorescens detektorer. For detektoren anvendes til at overvåge 7-AAD fluorescens, kontrollere, 7-AAD pos celler falder over 2% grænsen er etableret i trin 3.3 (dvs., at ikke-levedygtige celler er godt afklaretfra levedygtige 7-AAD neg celler).
  6. Brug af indstillinger, der er etableret i trin 3,3 erhverve data for Tube 4, indsamle FSC, SSC og signaler i alle 4 fluorescens detektorer. Kontroller, at CD8 pos celler godt løses fra ufarvede celler (dvs. falder over 2% grænsen er etableret i trin 3,3 til FITC detektor). Gentag med Tube 5 og kontrollere, at CD8 pos celler godt løses fra ufarvede celler (dvs. falder over 2% grænsen er etableret i trin 3,3 til APC detektor).
  7. Brug af indstillinger, der er etableret i trin 3,3 erhverve data for Tubes 6, 7 og 8, indsamling FSC, SSC og signaler i alle 4 fluorescens detektorer.
  8. Brug listningsmåde filer indsamlet for Tubes 1-5 og din farve kompensation software til at etablere en farve overlapper matrix for hver fluorokrom i detektorerne, der anvendes til at overvåge de tre andre fluorochromer. Anvend denne matrix til listen inodefilen for Prøve 6 og kontroller, at tilstedeværelsen af ​​PKH26 labeling ændrer ikke kan detektere 7-AAD pos celler.
  9. Påfør farven overlapper matrix fra trin 3,8 til listen inodefilen for prøve 7 og kontrollere, at: a) 3 godt opløste undergrupper (CD3 neg CD4 neg, CD3 pos CD4 neg og CD3 pos CD4 pos) kan identificeres på et FITC vs APC dot plot, og b) tilstedeværelsen af anti-CD3-FITC og anti-CD4-APC ændrer ikke kan detektere 7-AAD pos celler. Hvis tilstedeværelsen af ​​anti-CD3-FITC ændrer den øvre 2% grænse for data indsamlet på PKH26 detektoren, justere grænsen efter behov.
  10. Påfør farven overlap matrix fra trin 3,8 til listen inodefilen for prøve 8. Hvis tilstedeværelsen af PKH26 mærkning ændrer 2% grænse for FITC, 7-AAD eller APC detektorer fra dem, der ved hjælp af autofluorescens kontrol i trin 3,3, justere grænsen (e) efter behov ved hjælp Tube 7 i tabel 1 og kontroller, at den er stadig muligt at distinguish CD3 pos CD4 pos, CD3 pos CD4 neg, og CD3 neg CD4 neg-celler ved hjælp af justerede grænse (erne).

4. Proliferation Model Selection for celledeling Overvågning af Dye Fortynding

  1. Bestemme afstanden mellem generationer, hvilket er afhængig af antallet af kanaler og logaritmiske årtier på din cytometer. For digitale apparater, er denne værdi, typisk 4 eller 5 årtier, bestemmes af antallet af beholdere i den digitale signalprocessor. På analoge instrumenter, hvor antallet af årtiers er sjældent et helt tal præcis modellering kræver det præcise antal årtier, der skal bestemmes eksperimentelt. For at gøre dette, er data fra en blanding af kalibrerede fluorescerende perler med producent-tildelt relative intensiteter erhvervet på samme detektor høj spænding, der bruges i forsøget. Positionen af ​​vulsten toppe tillader kalibrering af logaritmisk skala med hensyn til intensity interval pr log årti. Specifikt gøres dette ved at plotte kanalnummeret for hver perletype mod logaritmen af ​​producenten angivne værdi. Hældningen af ​​den bedst passende rette linie for vulsten dataværdier angiver antallet af relativ intensitet enheder pr kanal. Ganget med antallet af kanaler, vil denne værdi så være antallet af log årtier til fuld skala, hvorfra antallet af kanaler svarer til et to gange fald i intensitet (dvs. datter generation afstand) kan beregnes 14.
  2. Beslutte, om der skal bruges en fast afstand mellem generationerne eller tillade afstanden til at flyde. En Standard (fast) indstilling vil bruge generationsskiftet afstand værdi, der bestemmes i trin 4,5 til tildele placeringen af hver generation, og bruges typisk, når histogrammet mangler tydelige toppe. En Float indstilling tillader hver generationsskifte spidsposition, der fastsættes af histogrammet form og anvendes typisk, når distinguishable generationerne toppe er indlysende.
  3. Beslut om du vil bruge en fast topbredde for alle generationer, eller en flydende bredde. En fast bredde bruger SD beregnet for den ustimulerede kontrolprøve at modellere alle generationer og vælges typisk når prøven mangler skelnelige generationsskifte toppe. En flydende bredde giver programmet til selvstændigt variere SD for hver generation og er bedst bruges sammen med skelnelige generationsskifte toppe.
  4. Kør et program, der indeholder en spredning analyse modul (her ModFit LT Version 3,3). Indlæse den stimulerede PKH26 pos fil fra de datasæt, der skal analyseres (fx en stimuleret 96 timers kultur af PKH26 pos celler modfarvet som for røret 8 i tabel 1).
  5. Vælge parametrene til analyse, i dette tilfælde PKH26 (585/42) gatet på levedygtige (7-AAD neg) CD3 pos lymfocytter og FSC versus SSC at udelukke mindre affald og store aggregater (figur 3). Ved fastlæggelsendisse regioner være omhyggelig med at medtage den høje forward scatter område, hvor blaster findes typisk og bemærk, at CD3 ekspression kan være ned-moduleret i stimulerede kulturer.
  6. Opret en ny spredning model ved hjælp af spredning Wizard. Brug af Open Data File (Start fane), indlæse den ustimulerede PKH26 pos kontrol fil og definere placeringen af top kanal i forældrenes fordeling svarende til udelte celler.
  7. Analysere filen for den ustimulerede PKH26 pos kontrol, konstaterer værdierne for forældrenes peak position og bredde (standardafvigelse). Hvis en fast topbredde (SD) ønskes, tjek Lås SD.
  8. Indlæse PKH26 neg kontrol (fx en 96 timers kultur af PKH26 neg-celler modfarvet som for røret 7 i tabel 1). Justere antallet af generationer ved at indstille den maksimale kanal for dimmest generation over PKH26 neg kontrol. Det bestemmer Number af datter generationer modellen kan præcist passer og er typisk 6-9 generationer.
  9. Åbn datafilen for den stimulerede prøve (fx en stimuleret 96 timers kultur af PKH26 pos celler modfarvet som for Tube 8 i tabel 1), og bekræfter, at regionerne for forældrenes spidsposition og SD, som defineret i trin 4,7 forbliver uændrede. Hvis fast generationsskifte afstand ønskes, skal du vælge Standard model option, ellers vælge Floating mulighed.
  10. Analyser hver eksperimentel fil i datasættet, efter samme model som defineret i trin 4,9. Mindre justeringer af forældrenes spidsposition kan være nødvendig for den allerbedste pasform som defineret både visuelt og ved den reducerede chi kvadrat (RCS) værdi.
  11. Optag de ønskede spredning målinger som følge af best-fit for hver eksperimentel fil i datasættet. For en omfattende beskrivelse af mulige målinger se ref. 22.

Representative Results

Membran farvestoffer såsom PKH26 plet med næsten øjeblikkelig opdeling i cellemembraner og ikke ved kemisk reaktion (for CFSE) eller ligevægtsbinding (for antistoffer). Manglende opmærksomhed på de kritiske spørgsmål er skitseret i figur 1 kan resultere i slørede eller heterogene farvning af typen vist i figur 2. I modsætning hertil anvendelse af optimerede mærkning betingelser (figur 1, tabel 2) resulterer i lyse homogene fordeling er egnede til en lang række cellelinjer tracking applikationer, herunder celledeling overvågningen baseret på farvestof fortynding (figur 3). Dead / døende celler mister varierende mængder af sporing farvestof, som kan udvide og / eller skævt datter generation intensiteter og komplicere spredning modellering baseret på farvestof fortynding 3,4,16,18. Anvendelse af en levedygtighed farvestof anbefales derfor, når de indsamler farvestof fortyndings data under forhold, hvor et betydeligt antal af døde celler kan være præsendt, såsom stimulerede kulturer (figur 3) eller ældre prøver (figur 4).

Fordi sporing farvestof mærkning typisk giver fluorescensintensiteter flere størrelsesordener større end immunophenotyping, er det vigtigt at omfatte passende erstatning kontroller (tabel 1) og for at kontrollere, at tilstedeværelsen af sporing farvestof ikke påvirker evnen til at løse antistof-positive og negative celler (figur 4). For at undgå behovet for overdreven farvekompensation, foretrækkes det at placere en lys fluorochrom, eller en ikke findes på celler af interesse, såsom et farvestof udelukket ved levende celler, i det spektrale kanal (er) støder op til sporing farvestof (figur 4A & B vs. 4C & D). Når der anvendes peak modeling software til at kvantificere graden af ​​proliferation, at opnå en god pasning kræver tilsvarende antagelser inden for modellen af ​​arten af ​​farvestoffet fortynding profIles analyseres (figur 5 og tabel 3). Med passende valg af sporing farvestoffer og levedygtighed reagenser, er det også muligt at karakterisere proliferative responser i flere lymfocytsubpopulationer samtidigt. For eksempel, som vist i figur 6 tilsætning af en 2. sporing farvestof forenkler diskriminering mellem regulatoriske T-celler (mærket med CellVue Claret) og stærkt prolifererede effektor T-celler (mærket med CFSE) og tilvejebringer langt større detaljer om deres interaktioner, end der kunne opnås anvendelse af 3H-thymidin mærkning 18,27.

Figur 1
Figur 1. General membran mærkning af protokol for PKH26, PKH67 og CellVue farvestoffer. Partitionering af disse højlipofile farvestoffer i celle membraNes forekommer væsentlige øjeblikkeligt ved blanding med celler, når farvning udføres i saltfri Diluent C køretøj, forudsat at maksimere farvestof opløselighed og farvning effektivitet. Som sammenfattet i denne skematiske til almindelig membran mærkning med PKH26, lys, ensartet og reproducerbar farvning er derfor lettest opnås ved: 1) at minimere mængden af ​​protein og / eller salte til stede i farvningstrin og 2) under anvendelse af en blandingsteknik, der forsikrer hurtig homogen spredning af celler i farvestof (dvs. samtidigt udsætter alle celler i den samme koncentration af farvestof).

Figur 2
Figur 2. Effekt af farvning betingelser for PKH26 fluorescens distributioner (genoptrykt fra ref. 18). Gentagne prøver af logaritmisk voksende, dyrkede U937 celler blev farvet med PKH26 (slutkoncentrationer: 1 x 10 7 celler / ml, 12 til 15 pM PKH26) i 3 minutter ved omgivelsernes temperatur, med eller uden omgående blanding ved tilsætning af 2x celler til 2x farvestof. Efter vask blev farvede celler analyseret på en Beckman Coulter CYAN flowcytometer i faste instrumentindstillinger Histogram 1:. Ufarvet kontrol med PKH26 detektor spænding justeres til at placere alle celler på skala i det første årti med få / ingen celler akkumulere i den første kanal. Histogram 2: farvning ved 15 uM farvestof hjælp tilsætning af 2x celler til 2x farvestof med øjeblikkelig blanding resulterede i en lys, homogent farvede, symmetrisk population af celler placeret i det fjerde årti, med få / ingen celler ophobes i den sidste kanal (gMFI = . 2548, GCV = 26,2%) Histogram 3: farvning ved 15 uM farvestof med tilsætning af 2x celler til 2x farvestof, men uden øjeblikkelig blanding resulterede i en reduceret intensitet og en bredere CV (gMFI = 505 , GCV = 116%) såvel som en svagt farvet subpopulation, muligvis på grund af en dråbe af celler dispenseret på væggen af røret i stedet for til 2x farveopløsning Histogram 4:. En farvning fejl førte til 3 gl af koncentreret ethanolisk farvestof bestanden, der tilsættes direkte til 2x celler i diluent C uden yderligere blanding frem for at blive anvendt til fremstilling af en 2x farveopløsning i Diluent C. Dette resulterede i en endelig farvestof koncentration på 12 uM, men gav meget svagt og heterogene farvning (gMFI = 32,9, GCV = 1020%). Den observerede højre skrå sandsynligvis afspejler den kombinerede virkning af: i) dårlig blanding som følge af vidt forskellige celler og farvning mængder, og ii) det faktum, at celler tættest på farvestoffet udlægningspunkt ville blive udsat for en højere koncentration af farvestof end de længere væk. Klik her for at se større figur .

re 3 "src =" / files/ftp_upload/4287/4287fig3.jpg "fo: indhold-bredde =" 4.5in "fo: src =" / files/ftp_upload/4287/4287fig3highres.jpg "/>
Figur 3. Anvendelse af en levedygtighed probe forenkler gating af T-celleproliferation profiler hPBMC blev mærket med PKH26 (endelig cellekoncentration: 3x10 7 / ml, endelig farvestofkoncentration: 10 uM).. Efter dyrkning i 96 timer i nærvær (stimuleret) eller fravær (ikke-stimuleret) af anti-CD3 og IL-2 blev celler modfarvet med anti-CD3-FITC, anti-CD19-APC-og 7-AAD, og ​​blev analyseret på en FACSCalibur flowcytometer (se reference 13 for detaljer). Color kompensation blev udført på tidspunktet for dataindsamlingen ved hjælp hardwired kompensation kredsløb. Omfanget af proliferation blev modelleret som beskrevet i trin 4 under anvendelse af spredning guiden i ModFit LT3.3. Data fra PKH26 neg kontrol (tabel 1, Tube 7) er overlejret for reference (grå fyldt histogrammer i kolonne 3). Levedygtigheder for stimulerede og STIakkumulerede kulturer var 76% og 62% (ungated data for panel A og B, henholdsvis). Panel A. PKH26 farvede celler dyrket i 96 timer i medium var gated at inkludere levedygtige (7-AAD neg) CD3 pos celler (R1). Ud over antistoffet integration og 7-AAD døde celler udelukket gate, (SSC) en forward scatter (FSC) versus side scatter gate (R2) blev anvendt til at udelukke urenheder og aggregater. Bemærk den manglende døde celler i den sidste afbildning i dette panel. Den bedste pasform model for PKH26 proliferation profilen (kolonne 3) gav en enkelt top med RCS = 2,1 (Donor 6, tabel 3), hvilket indikerer god symmetri, og blev anvendt til at definere den parentale stilling og indkoblingsstrøm bredde til analyse af den stimulerede prøve fra dette datasæt (panel B). Panel B. En gengivelse portion af PKH26 farvede celler blev dyrket med anti-CD3 og IL-2 i 96 timer og gated på samme måde som i panel A. En model med variabel spidsposition og flydende topbredde gav den bedste pasform til disse data med RCS = 1,3 (Donor 6, tabel 3). Panel C. Den samme datafil som i panel A blev analyseret uden anvendelse af 7-AAD data. Når en primær FSC versus SSC blev anvendt til delvis udelukker døde celler og aggregater (R2) og en sekundær gate at vælge CD3-positive events (R3), en lille resterende population af døde celler forblev (0,2% af gatede hændelser). Den bedste pasform model gav en enkelt top med RCS = 2,2. Panel D. Den samme datafil som i panel B var gated som i panel C. Bemærk det store resterende population af døde celler i stimulerede prøven (1,29% af gatede hændelser) til denne gating-strategi. Den bedste fit model var en med flydende spidsposition og flydende topbredde (RCS = 1,3). Klik her for at se større figur .

ig4.jpg "fo: indhold-bredde =" 5in "fo: src =" / files/ftp_upload/4287/4287fig4highres.jpg "/>
Figur 4. Virkning af fluorokrom valg og farvestofkoncentration på evnen til immunofænotype lymfocytter mærket med PKH26. HPBMC blev isoleret fra 24 timers gamle blod og mærket med PKH26 som beskrevet i trin 1, med den undtagelse, at farvningen blev udført i 12 x 75 mm rundbundet polystyrenrør stedet for 12 x 75 mm koniske polypropylenrør. Umiddelbart efter mærkning med PKH26 blev celler modfarvet med de angivne immunophenotypic og levedygtighed reagenser, og analyseret på en LSRFortessa flowcytometer ved hjælp af gating strategi figur 3A og følgende optiske konfiguration: 488 nm laser: FSC-A (488 nm); SSC -A (488/10 BP), FITC-A (530/30 BP) PKH26-A (575/26 BP), 7-AAD-A eller PerCP-A (695/40 BP). 640 nm laser: APC-A eller TOPRO-3-A (670/14 BP). Color kompensation blev udført på tidspunktet for dataindsamlingen ved hjælp af BD DiVa software. "Auto"indikerer autofluorescensen af ​​no-antistofkontrol i den relevante spektrale vindue (APC for panel A og B, PerCP for Panel C og D). Data fra PKH26 neg kontrol (tabel 1, Tube 7) er overlejret for reference (grå fyldt histogrammer, kolonne 5). Efter farvning levedygtighed var ens for alle prøver (88-92%). Panel A. Celler mærket med PKH26 i en slutkoncentration på 2 uM blev modfarvet ved anvendelse af anti-CD3-FITC, anti-CD4-APC, og 7-AAD ( rør 8 i tabel 3). Efter gating på levedygtige (7-AAD neg) CD3 pos lymfocytter (kolonne 1) og udelukkelse af snavs og aggregater baseret på FSC og SSC (se figur 3A), blev PKH26 intensitet evalueret i kombination med APC CD4 (Kolonne 2 og 3). Om ikke-kompenseret (kolonne 2) eller kompenseres (kolonne 3), det fluorochrom kombination resulterede i god opløsning mellem CD4 pos T-celler og CD4 neg T-celler), som kontrolleret af både en no-antibody, autofluorescerende kontrol (Tube 6 i tabel 1, spalte 4), og to-farve-afbildning af CD3 vs. CD4 (kolonne 6). Panel B. Brug den samme fluorokrom kombination som i panel A, men at øge endelig PKH26 koncentrationen til 4 uM ikke påvirke evnen til at løse CD4 pos T-celler fra CD4 neg T-celler. Panel C. A gentagelse portion celler uafhængigt er mærket med PKH26 i en slutkoncentration på 2 uM blev modfarvet med anti-CD3-FITC, anti-CD4-PerCP, og TOPRO-3. Efter gating på levedygtige (TOPRO-3 neg) CD3 pos lymfocytter (kolonne 1) og udelukkelse af snavs og aggregater baseret på FSC og SSC (se figur 3A), blev PKH26 intensitet evalueret i kombination med anti-CD4-PerCP (Kolonne 2 og 3). Væsentlige spektral overlapning af PKH26 ind i PerCP kanal er tydeligt i de ukompenserede data (kolonne 2) og opløsning mellem PKH26 pos CD4 pos CD4 neg hændelser er marginal efter kompensation anvendes (sammenlign kolonne 3 med no-antistof, autofluorescerende kontrol i kolonne 4). Panel D. Når PKH26 koncentrationen forøges til 4 uM, er det ikke længere muligt at anvende fluorochrom kombination af Panel C. spektral overlapning fra PKH26 til PerCP kanalen overstiger intensiteten af signalet fra CD4 (kolonne 2) og CD4 pos PKH26 pos events ikke længere løses fra CD4 neg PKH26 pos T-celler (Kolonne 3 vs. kolonne 4). Klik her for at se større figur .

Figur 5
Figur 5. Effekt af spredning model selektion på. goodness of fit for farvning fortynding profiler hPBMC blev mærket med PKH26 (endelig cellekoncentration: 3x10 7 / ml, endelig farvestofkoncentration: 10 uM). Efter dyrkning i 96 timer i nærvær (stimuleret) eller fravær (ikke-stimuleret) af anti-CD3 og IL-2 blev celler høstet modfarvet med anti-CD3-FITC, anti-CD19-APC og 7-AAD og analyseret på en FACSCalibur flowcytometer (se reference 13 for detaljerede metoder). Farvekompensation blev udført på tidspunktet for dataopsamling med fastfortrådet kompensation kredsløb. Panel A. Den PKH26 intensitet profil fra en ikke-stimuleret 96 timer kultur for Donor 5, en moderat responder, blev gated som vist i figur 3A og anvendes til at tilvejebringe den ModFit Proliferation guiden med en første vurdering af position og bredde for spids, der repræsenterer udelte parentale celler. Panel B. Den PKH26 intensitetsprofil fra en parallel stimuleret 96 timer kulturen blev analyseret under anvendelse af udgangsforbindelserne estimater fraPanel A og 4 forskellige kombinationer af »spredning guiden 'indstillinger, svarende til faste og flydende topintensiteter og faste og flydende topbredder for successive datter generationer som vist. Som sammenfattet i tabel 3, den model, der gav den bedste tilpasning til de observerede data (lavest reduceret chi-kvadrat, RCS) var den "flydende / flydende" kombination, i hvilken ikke blot toppositioner men også standardafvigelser af datter generation toppe blev tilladt at variere (RCS = 1,5). Den samme model gav den bedste pasform til Donor 6 er en høj responder (fig. 3B og tabel 3).

Figur 6
Figur 6. Tilsætning af et andet cellesporing farvestof forenkler diskriminering mellem effektor og regulatoriske T-celler i et flow-cytometrisk suppression assay(Tilpasset fra Ref. 18). Monocyte-forarmet lymfocytter fremstillet ud fra Trima leukaferese filtre blev farvet med anti-CD127-PE, anti-CD4-PE-Cy7, og anti-CD25-APC og flow sorteret i populationer af effektor (Teff.; CD4 pos CD127 lyse CD25 dim), regulerende (Treg, CD4 pos CD127 dim CD25 POS), og tilbehør (CD4 neg) celler. Sorteret Treg celler mærket med CellVue Claret (endelig cellekoncentration: 1x10 6 / ml, endelig farvestofkoncentration: 1 uM) og sorteret Teff mærket med CFSE (endelig cellekoncentration: 5 × 10 7 / ml, endelig farvestofkoncentration, 5 uM) blev co-dyrket ved forskellige forhold i nærvær af anti-CD3, anti-CD28 og bestrålet accessoriske celler. Efter 96 timer, blev kulturerne høstet, modfarvet med anti-CD4-PE-Cy7 og LIVE / DEAD Fixable Violet, og analyseret på en LSRII flowcytometer og farvekompensation blev udført på tidspunktet for data KØBn bruge BD DiVa software (se reference 18 for detaljer, herunder kompensation kontroller). Spredning Indeks for Teff og Treg blev modelleret som beskrevet i trin 4, ved hjælp af spredning guiden i ModFit LT3.3. Datapunkter i panelerne B og C repræsenterer middelværdien ± 1 standardafvigelse af tredobbelte prøver Panel A. Repræsentative data er vist i en af tre tredobbelte prøver på en Treg:. Teff forhold på 0,25:1. LIVE / DEAD Fixable Violet reagens blev brugt til at udelukke døde celler (R1, øverste venstre plot, hjælperceller = rød-brun, ikke-levedygtig Teff = grå og levedygtige Treg = rød) fra alle andre data plots. CellVue Claret farvning blev brugt til at skelne levedygtig Treg (R4, center højre plot, blå) fra levedygtig, men meget spredt Teff (R5, center højre plot, grøn). En enkelt parameter CFSE proliferation profil for Teff (nederste venstre plot) blev genereret ved gating på celler, der var CFSE pos (R5), CD4 POS (R3), levedygtigt (ikke R1), og havde lymfocyt scAtter egenskaber (R2). En enkelt parameter CellVue Claret proliferation profil for Treg blev genereret ved gating på celler, der var CellVue Claret pos (R4), CD4 POS (R3), levedygtigt (ikke R1), og havde lymfocyt scatter egenskaber (R2). Bemærk den generøse lymfocyt region (R2) defineret til at omfatte lymfocyt blaster. Bemærk også, at det samlede antal celler, der skal indsamles, afhænger af den laveste frekvens population. I et celleproliferation eksperiment hvor populationen af ​​interesse kan fordeles over et bredt område af intensiteter repræsenterer op til syv eller otte generationer et stort antal celler bør indsamles for nøjagtigt modellere og beregne antallet af celler i hver generation. Når man studerer sjældne celler, kan det være nødvendigt at blot køre prøverøret næsten tør for at opsamle det størst mulige antal hændelser. For prøven er vist her, gør dette resulterede i en samlet ~ 25.000 hændelser, hvoraf 11.923 var Teff (Proliferation IVERSIGT 3,85) og 1380 var Treg (Proliferation Index 1,83). Panel B. Som forventet forøgelse af andelen af tregs stede i co-kulturer medførte større suppression af Teff celleproliferation. Lignende resultater blev opnået med både CellVue Claret-farvet (fast linie) eller ufarvede (stiplet linie) Treg, hvilket viser, at farvning med CellVue Claret sporing farvestof påvirkede ikke Treg virkningsstyrke. Panel C. Treg er relativt anergiske, og som forventet gjorde ikke prolifererer ved inkubation med anti-CD3, anti-CD28, og accessoriske celler i fravær af teff-celler (Treg: Teff forhold på 1:0). Da andelen af Teff stede i co-kulturer forøges (dvs. som Treg: Teff-forholdet faldt), omfanget af Treg proliferation også øget. Den generelt større fejllinjer til disse data i det mindste delvist afspejler den begrænsede omfang af spredning, hvilket fører til mindre antal indsamlede hændelser i forhold til Teff og større usikkerty i modellering af antallet af celler i hver generation. Klik her for at se større figur .

Tube Nej (Formål) PKH26 Antistof (fer) 7-AAD
1 (Setup, kompensation) - - -
2 (Setup, kompensation) + - -
3 (Setup, kompensation) - - +
4 (erstatning) - CD8-FITC b -
5 (erstatning) - CD8-APC b -
6 (ingen Ab kontrol) + - +
7 (ingen sporing farvestof control) - CD3-FITC CD4-APC eller CD19-APC c +
8 (T0 kontrol) + CD3-FITC CD4-APC eller CD19-APC c +

. Tabel 1 Instrument Setup Styrer en a Kontrol angivet er passende for en 4-farvet CD4 T-celleproliferation overvågning under anvendelse:. PKH26 (proliferation farvestof), CD3-FITC (pan-T-cellemarkør), CD4-APC (T-hjælper cellemarkør), 7-aminoactinomycin D (7-AAD, døde celler udelukket) b Lysere surrogater for CD3-FITC og CD4-APC (bedre evne til at opdage kompensation fejl) c Figur 3:.. CD3-FITC og CD19-APC. d Figur 4: CD3-FITC og CD4-APC.

Celletype Endelig cellekoncentration Endelige farvestofkoncentration </ Strong> Henvisning
hPBMC b 1 x 10 7 / ml 2 uM PKH67 10,17
5 x 10 6 / ml 2 uM PKH26 12
3 x 10 7 / ml 10 uM PKH26 13
5 x 10 7 / ml 30 uM PKH26 18
1 x 10 6 / ml 1 uM CellVue Claret c 18
3 x 10 7 / ml 4 uM CellVue Claret 13
5 x 10 7 / ml 5 uM CellVue Claret 18
Celler i kultur 5 x 10 5 / ml 0,1 uM PKH26 (1 ° mammae celler) 8
1 x 10 7 / ml 15 uM PKH26 (U937) 18
1 x 10 7 / ml 12,5 -15 pM PKH26 (U937) 15
1 x 10 7 / ml 1 uM PKH67 (K562) 18
1 x 10 7 / ml 1 uM PKH67 (T-cellelinier) 9
1 x 10 7 / ml 10 uM CellVue Claret (YAC-1) 23

Tabel 2. Ikke-forstyrrende Membrane-Dye farvningsbetingelser en. En tilpasset og opdateret fra ref. 18. B. lav hastighed vask (300 x g) blev anvendt for at minimere blodplade-kontaminering. C Treg celler (flow sorteret CD4 pos CD25 pos CD127 neg lymfocytter).

<td> 4,5
Model Indstillinger modelresultater
Donor Behandling Peak position SD Parental Position Parental SD # Af Peaks Monteret RCS PI PF
5 Ustimuleret Flyd Flyd 209 4,5 1 5,1 1,0 0
5 Stimuleret Fixed Fixed 209 7 35 3,9 31
5 Stimuleret Flyd Fixed 209 4,5 8 19 4,3 30
5 Stimuleret Fixed Flyd 209 9,2 6 1,9 3,8 30
5 Stimuleret Flyd Flyd 209 9,0 7 1,5 3,7 29
6 Ustimuleret Flyd Flyd 205 4,0 1 2,1 1,0 0
6 Stimuleret Fixed Fixed 205 4,0 6 42 6,6 60
6 </ Td> Stimuleret Flyd Fixed 205 4,0 7 12 7,4 60
6 Stimuleret Fixed Flyd 205 8,6 6 6,9 6,8 62
6 Stimuleret Flyd Flyd 205 6,5 6 1,3 6,5 59

Tabel 3. Indvirkning spredning Model for goodness of fit (RCS) og proliferation Metrics en. En prøve farvning, dataindsamling og gating som beskrevet i figur 3A & B.

Discussion

De metoder, der er beskrevet her, er dem, der findes i vores kombinerede laboratorier til mest pålideligt at give optimale resultater for hPBMC mærkning ved hjælp af membran farvestoffer 13,16,18 og for lymfocytdelmængde fænotypebestemmelse og spredning sporing ved hjælp af enten membran eller protein farvestoffer 2,11,13,16, 18. Som vist i figur 1 og 2, er lyse ensartet mærkning lettest opnås ved at begrænse tilstedeværelsen af fysiologiske salte og anvendelse af et blandings teknik, som resulterer i hurtig, ensartet eksponering af alle celler i den samme koncentration af farvestof. Fordi farvning med membran farvestoffer sker ved opdeling i lipiddobbeltlaget, kan andre variabler, som ændrer frit farvestof koncentration også påvirke mærkningseffekt. For eksempel mærkning i rundbundede polystyrenrør resulterer i mindre effektiv udvaskning af salte forud for resuspendering i Diluent C og også i reduceret frit farvestof koncentration på grund af farvning af adsorption på rørvæggene, isærved lavere farvestofkoncentrationer. Begge faktorer tendens til at give bredere farvning fordelinger end når mærkning udføres under anvendelse konisk bund polypropylenrør (figur 3, 4 og upublicerede resultater). Prøve alder og type kan også påvirke topbredde selv når optimerede farvningsprocedurer anvendes. For eksempel CV'er for PKH26 pos lymfocytter isoleret fra frisktappet blod spænder fra 14-20% (figur 3, ref. 13 og upublicerede resultater), mens CV'er for lymfocytter isoleret fra 24 hr gamle blodprøver eller TRIMA pheresis filtre spænder fra 25 til 30 % (figur 4 og ref. 18).

Farvning ensartethed og i hvilket omfang ikke-levedygtige celler kan udelukkes fra analysen både indflydelse på, om skelnelige afledte toppe tydelige i farvestoffet fortynding profil, som igen påvirker valget af en spredning model til at passe de observerede data (figur 5 og 6 (figur 3, 5 og 6, Tabel 3), andre software pakker indeholder også moduler til at analysere spredning data. Disse omfatter FCSExpress (De Novo Software, Los Angeles, CA) og FlowJo (Tree Star, Inc., Ashland, OR). Alle disse programmer bruger en ikke-lineær mindste kvadraters analyse til iterativt finde den bedst egnede til de rå data ved at ændre position, højde og SD (eller bredde) af gaussiske toppe, der repræsenterer sekventielle datter generationer. Proliferativ Index (PI) og Precursor Frequency (PF) er de mest almindeligt anvendte foranstaltninger omfang af spredning. PI, som defineret af ModFit, er et mål for stigningen i celleantallet i løbet af assayet, analogt med "stimulation index" af en thymidinoptagelsesassay. PF returnerer fraktion af celler i den oprindelige population, der reagerede på stimulus ved breder sig. Der bør udvises forsigtighed, men når man læser litteratur siden terminologi varierer noget blandt softwarepakker (f.eks FlowJo og ModFit bruger forskellige definitioner og beregninger for, hvad der menes med "spredning Index") 22.

De kritiske spørgsmål, der drøftes her for mærkning og spredning analyse med membran farvestoffer er også stødt på, når du bruger protein farvestoffer. For eksempel skal omhyggelig med blandeteknik også observeres sammen med udelukkelse af døde / døende celler, for at opnå ensartede fordelinger og skelnelige afledte toppe ved brug CFSE (fig. 6) 2-4,13,18,24. Passende valg af fluorochromer til fænotypebestemmelse og rentabilitetsvurderingen er også vigtigt at undgå for store spektral overlapning og manglende evne til at genkende antistof-positive celler, især med synlige emitterende protein farvestoffer, såsom CFSE 2-4,11,13,16,18 (figur 6). Endelig, selv membran farvestoffer generelt tendens til at udvise mindre toksicitet 11,26, er det muligt at over-mærkning af celler med enten klasse af farvestof. Det er derfor altid nødvendigt at kontrollere, at koncentrationen af sporing anvendte farvestof ikke har ændret funktionaliteten af cellerne, der skal spores (fig. 6) 3,13,16,18.

Disclosures

K. Humphrey, JD Tario, Jr. og PK Wallace har modtaget prækommercielle cellesporing reagenser til evaluering fra Life Technologies, Inc. og BD Biosciences. AD Bantly og JS Moore har modtaget prækommercielle celle sporing reagenser til evaluering fra Life Technologies, Inc. og finansiering fra PTI Research, Inc. for prækommercielle karakterisering af forskellige CellVue celle sporing farvestoffer. K. Muirhead er ansat i SciGro, Inc., som leverer konsulentydelser til Phanos Technologies, Inc. (ejeren af ​​PKH og CellVue farvestoffer) og yder backup teknisk support til Sigma-Aldrich og Molekylær Targeting Technologies, Inc. (forhandlere af disse farvestoffer).
Produktion og fri adgang til denne artikel er sponsoreret af Sigma-Aldrich.

Acknowledgments

Forfatterne vil især gerne takke følgende personer for deres tekniske og intellektuelle bidrag til udviklingen af ​​disse metoder gennem årene: Bruce Bagwell (Verity Software House), Nadege Bercovici (IDM), Lizanne Breslin (Zynaxis Cell Science og PTI Research) , Brian Gray (PTI Research), Jan Fisher (Dartmouth Medical School), Alice Givan (Dartmouth Medical School), Betsy Ohlsson-Wilhelm (SciGro, Inc.), og Mary Waugh (Dartmouth Medical School). De vil også gerne takke Bowdoin klassen af 2006 fra de årlige Kurser i Research Methods and Applications af flowcytometri, som har frembragt de data, der er vist i figur 2.

Flowcytometri blev udført ved Roswell Park Cancer Institute Flowcytometri Laboratory, som blev etableret delvist af udstyr tilskud fra NIH Shared Instrument Program, og modtager støtte fra Core Grant (5 P30 CA016056-29) fra NationalCancer Institute til Roswell Park Cancer Institute, og på Abramson Cancer Center Flowcytometri og Celle Sortering Resource Laboratory ved University of Pennsylvania, som blev etableret delvist af udstyr tilskud fra NIH Shared Instrument Program, og modtager støtte fra NIH # 2P30 CA016520 fra National Cancer Institute. Arbejdet er vist i figur 3 og 5 blev også delvist understøttet af SBIR tilskud EB00228 fra National Institutes of Biomedical Imaging and Bioengineering (NIBIB) udstedt til PTI Research, Inc.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Commercially Purchased
7-Aminoactinomycin D Sigma-Aldrich A9400
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A4503
Fetal bovine serum (FBS) Atlanta Biologicals S11150
Hanks balanced salt solution (HBSS) Life Technologies 14175-079 Calcium and magnesium free, without phenol red
Human IgG Cohn fraction II and III globulins Sigma-Aldrich G-4386
Mouse anti-human CD3-FITC BD Biosciences 349201 Saturating concentration as determined by laboratory titration
Mouse anti-human CD4-APC BD Biosciences 340672 Saturating concentration as determined by laboratory titration
Mouse anti-human CD4-PECy7 BD Biosciences 348799 Saturating concentration as determined by laboratory titration
Mouse anti-human CD8-FITC BD Biosciences 347313 Saturating concentration as determined by laboratory titration
Mouse anti-human CD8-APC Caltag (Life Technologies) MHCD0805 Saturating concentration as determined by laboratory titration
Mouse anti-human CD19-APC Caltag (Life Technologies) MHCD1905 Saturating concentration as determined by laboratory titration
Mouse anti-human CD25-APC BD Biosciences 340938 Saturating concentration as determined by laboratory titration
Mouse anti-human CD127-PE BD Biosciences 557938 Saturating concentration as determined by laboratory titration
Mouse anti-human CD3 eBiosciences 16-0037-85 1.0 mg/mL; azide free
Mouse anti-human CD28 eBiosciences 16-0289-85 1.0 mg/mL; azide free
PBS Gibco 21300-058
PKH26 red fluorescent cell linker kit containing 10-3M PKH26 in EtOH and Diluent C Sigma-Aldrich PKH26GL-1KT
or
MINI26-1KT
Procedures in Step 1 also apply to kits containing PKH67 or other CellVue dyes
CellVue Claret far red fluorescent cell linker kit containing 10-3M CellVue Claret in EtOH and Diluent C Sigma-Aldrich MINCLARET-1KT or MIDCLARET-1KT
5-(and-6)-carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester (CFDA-SE) Invitrogen (Life Technologies) C34554 Non-fluorescent; cleaved by membrane esterases to form fluorescent amino-reactive carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)
LIVE/DEAD Fixable Violet Invitrogen (Life Technologies) L34955
Sterile 12x75 mm conical
polypropylene tubes & caps
VWR 60818-102 Gives better membrane dye staining efficiency (reduced dye adsorption; less cell loss during supernatant aspiration)
12x75 mm round bottom
polystyrene tubes
Becton Dickinson 21008-936
Flow cytometer BD Bioscience FACSCalibur
LSRFortessa
Any cytometer able to detect FITC, PKH26, and 7-AAD (ex. 488 nm; em. 520 nm, 567nm, and 655nm, respectively) and APC ex. 633-640 nm; em. 660nm)
Flow cytometer Beckman Coulter LSRII CyAn Any cytometer able to detect FITC, PKH26, and 7-AAD (ex. 488 nm; em. 520 nm, 567nm, and 655nm, respectively) and APC ex. 633-640 nm; em. 660nm)
Laboratory Prepared
7-Aminoactinomycin D,
concentrated stock
NA NA 1 mg/mL in PBS. Freeze in aliquots and store at -20 °C.
7-Aminoactinomycin D,
working stock
NA NA 100 μg/mL in PBS; prepare daily from 1 mg/mL frozen stock.
IgG block NA NA HBSS + 10 mg/mL Human IgG Cohn fraction II and III globulins + 10 mg/mL BSA.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Poon, R. Y., Ohlsson-Wilhelm, B. M., Bagwell, C. B., Muirhead, K. A. Use of PKH Membrane Intercalating Dyes to Monitor Cell Trafficking and Function. Living Color: Flow Cytometry and Cell Sorting Protocols. Diamond, R. A., DeMaggio, S. Springer-Verlag. New York, NY. 302-352 (2000).
  2. Wallace, P. K., Muirhead, K. A. Cell Tracking 2007: A Proliferation of Probes and Applications. Immunol. Invest. 36, 527-562 (2007).
  3. Hawkins, E. D., Hommel, M., Turner, M. L., Battye, F. L., Markham, J. F., Hodgkin, P. D. Measuring lymphocyte proliferation, survival and differentiation using CFSE time-series data. Nat. Protoc. 2, 2057-2067 (2007).
  4. Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nat. Protoc. 2, 2049-2056 (2007).
  5. Bolton, D. L., Minang, J. T., Trivett, M. T., Song, K., Tuscher, J. J., Li, Y., Piatak, M., O'Connor, D., Lifson, J. D., Roederer, M., Ohlen, C. Trafficking, Persistence, and Activation State of Adoptively Transferred Allogeneic and Autologous Simian Immunodeficiency Virus-Specific CD8+ T Cell Clones during Acute and Chronic Infection of Rhesus Macaques. J. Immunol. 184, 303-314 (2010).
  6. Juopperi, T. A., Sharkis, S. J. Isolation of Quiescent Murine Hematopoietic Stem Cells by Homing Properties. Meth. Mol. Biol. 430, 21-30 (2008).
  7. Kusumbe, A. P., Bapat, S. A. Cancer stem cells and aneuploid populations within developing tumors are the major determinants of tumor dormancy. Cancer Res. 69, 9245-9253 (2009).
  8. Pece, S., Tosonim, D., Confalonieri, S., Mazzarol, G., Vecchi, M., Ronzoni, S., Bernard, L., Viale, G., Pelicci, P. G., Fiore, P. P. D. i Biological and Molecular Heterogeneity of Breast Cancers Correlates with Their Cancer Stem Cell Content. Cell. 140, 62-73 (2010).
  9. Gertner-Dardenne, J., Poupot, M., Gray, B. D., Fournié, J. -J. Lipophilic fluorochrome trackers of membrane transfers between immune cells. Immunol. Invest. 36, 665-685 (2007).
  10. Bercovici, N., Givan, A. L., Waugh, M. G., Fisher, J. L., Vernel-Pauillac, F., Ernstoff, M. S., Abastado, J. P., Wallace, P. K. Multiparameter precursor analysis of T-cell responses to antigen. J. Immunol. Methods. 276, 5-17 (2003).
  11. Givan, A. L., Fisher, J. L., Waugh, M. G., Bercovici, N., Wallace, P. K. Use of cell-tracking dyes to determine proliferation precursor frequencies of antigen-specific T cells. Methods Mol. Biol. 263, 109-124 (2004).
  12. Schwaab, T., Tretter, C. P., Gibson, J. J., Cole, B. F., Schned, A. R., Harris, R., Fisher, J. L., Crosby, N., Stempkowski, L. M., Heaney, J. A., Ernstoff, M. S. Tumor-related immunity in prostate cancer patients treated with human recombinant granulocyte monocyte-colony stimulating factor (GM-CSF). Prostate. 66, (6), 667-674 (2006).
  13. Bantly, A. D., Gray, B. D., Breslin, E., Weinstein, E. G., Muirhead, K. A., Ohlsson-Wilhelm, B. M., Moore, J. S. CellVue Claret, a New Far-Red Dye, Facilitates Polychromatic Assessment of Immune Cell Proliferation. Immunol. Invest. 36, 581-605 (2007).
  14. Givan, A. L. A flow cytometric assay for quantitation of rare antigen-specific T-cells: using cell-tracking dyes to calculate precursor frequencies for proliferation. Immunol. Invest. 36, 563-580 (2007).
  15. Tario, J. D., Gray, B. D., Wallace, S. S., Muirhead, K. A., Ohlsson-Wilhelm, B. M., Wallace, P. K. Novel lipophilic tracking dyes for monitoring cell proliferation. Immunol Invest. 36, 861-885 (2007).
  16. Wallace, P. K., Tario, J. D. Jr, Fisher, J. L., Wallace, S. S., Ernstoff, M. S., ,, Muirhead, K. A. Tracking Antigen-Driven Responses by Flow Cytometry: Monitoring Proliferation by Dye Dilution. Cytometry. 73, 1019-1034 (2008).
  17. Barth, R. J., Fisher, D. A., Wallace, P. K., Channon, J. Y., Noelle, R. L., Gui, J., Ernstoff, M. S. A Randomized Trial of Ex vivo CD40L Activation of a Dendritic Cell Vaccine in Colorectal Cancer Patients: Tumor-Specific Immune Responses Are Associated with Improved Survival. Clin. Cancer Res. 16, 5548-5556 (2010).
  18. Tario, J. D., Muirhead, K. A., Pan, D., Munson, M., Wallace, P. K. Tracking Immune Cell Proliferation and Cytotoxic Potential Using Flow Cytometry. Meth. Mol. Biol. 699, 119-164 (2011).
  19. Fuse, S., Underwood, E. Simultaneous Analysis of In Vivo CD8+ T Cell Cytotoxicity Against Multiple Epitopes using Multicolor Flow Cytometry. Immunol. Invest. 36, 829-845 (2007).
  20. Schütz, C., Fleck, M., Mackensen, A., Zoso, A., Halbritter, D., Schneck, J. P., Oelke, M. Killer artificial antigen-presenting cells: a novel strategy to delete specific T cells. Blood. 111, 3546-3552 (2008).
  21. Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity. Expert Rev. Vaccines. 9, 601-616 (2010).
  22. Roederer, M. Interpretation of cellular proliferation data: Avoid the panglossian. Cytometry. 79A, 95-101 (2011).
  23. Quah, B. J. C., Parish, C. R. The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation. J. Vis. Exp. (44), e2259 (2010).
  24. PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kits for General Cell Membrane Labeling [Internet]. Sigma-Aldrich. Available from: http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/Sigma/Bulletin/mini26bul.Par.0001.File.tmp/mini26bul.pdf (2012).
  25. Houlihan, D. D., Newsome, P. N. Critical Review of Clinical Trials of Bone Marrow Stem Cells in Liver Disease. Gastroenterology. 135, 438-450 (2008).
  26. Brusko, T. M., Hulme, M. A., Myhr, C. B., Haller, M. J., Atkinson, M. A. Assessing the In Vitro Suppressive Capacity of Regulatory. T Cells. Immunol. Invest. 36, 607-628 (2007).
Optimeret farvning og spredning modelleringsmetoder for celledeling Overvågning ved hjælp cellesporing Farvestoffer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tario Jr., J. D., Humphrey, K., Bantly, A. D., Muirhead, K. A., Moore, J. S., Wallace, P. K. Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes. J. Vis. Exp. (70), e4287, doi:10.3791/4287 (2012).More

Tario Jr., J. D., Humphrey, K., Bantly, A. D., Muirhead, K. A., Moore, J. S., Wallace, P. K. Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes. J. Vis. Exp. (70), e4287, doi:10.3791/4287 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter