Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

Optimerade färgning och spridning modelleringsmetoder för celldelning övervakning med hjälp Färgämnen Cell Tracking

doi: 10.3791/4287 Published: December 13, 2012

Summary

Framgångsrik användning av färgämnen cell tracking för att övervaka immunceller funktion och förökning involverar flera viktiga steg. Vi beskriver metoder för: 1) få ljusa, enhetlig, reproducerbar etikett-ning med membran färgämnen, 2) välja fluorokromer och data villkor förvärv och 3) val av en modell för att kvantifiera cellproliferation baserad på färg utspädning.

Abstract

Fluorescerande celler spårning färgämnen i kombination med flöde och bild cytometri, är kraftfulla verktyg som man kan studera interaktioner och öden olika celltyper in vitro och in vivo. 1-5 Även om det finns bokstavligen tusentals publikationer som använder sådana färgämnen, några av de vanligast förekommande cell tracking applikationer inkluderar övervakning av:

  1. stam och stamcellstransplantation inaktivitet, proliferation och / eller differentiering 6-8
  2. antigen-driven membran överföring 9 och / eller prekursor cellproliferation 3,4,10-18 och
  3. immun reglerande och effektorcell funktion 1,18-21.

Kommersiellt tillgängliga cell spårning färgämnen varierar mycket i sina kemiska och fluorescens egenskaper men den stora majoriteten hänföras till en av två klasser baserat på deras mekanism för cellmärkning. "Membrane färgämnen", kännetecknas av PKH26, är mycket lipofila färgämnen thatt partition stabilt men icke kovalent till cellmembran 1,2,11. "Protein färgämnen", kännetecknas av CFSE är amino-reaktiva färgämnen som bildar stabila kovalenta bindningar med cellproteiner 4,16,18. Varje klass har sina egna fördelar och begränsningar. Nyckeln till deras framgångsrika användningen, särskilt i multicolor studier där flera färgämnen används för att spåra olika celltyper, är därför att förstå de kritiska frågorna som möjliggör optimal användning av varje klass 2-4,16,18,24.

Protokollen ingår här lyfta fram tre vanliga orsaker till dåliga eller varierande resultat när du använder cell-spårning färgämnen. Dessa är:

  1. Underlåtenhet att uppnå ljusa, likformig, reproducerbar märkning. Detta är en nödvändig utgångspunkt för någon cell tracking studien men kräver uppmärksamhet till olika variabler när du använder membran färgämnen än vid användning av protein färgämnen eller jämviktsbindning reagens såsom antikroppar.
  2. Suboptimala fluorokrommängder kombinationer enND / eller underlåtenhet att inkludera kritiska ersättning kontroller. Spårning färgämnesfluorescens är typiskt februari 10 - mars 10 gånger ljusare än antikroppar fluorescens. Det är därför viktigt att kontrollera att förekomsten av spårning färg inte äventyrar möjligheten att upptäcka andra prober som används.
  3. Underlåtenhet att erhålla en bra passform med maximal modellering programvara. Sådan programvara kan kvantitativ jämförelse av proliferativa svar på olika populationer eller stimuli baserade på föregångare frekvens eller annan statistik. Skaffa en bra passform, kräver dock uteslutande av död / döende celler som kan snedvrida dye utspädning profiler och matchning av de antaganden som ligger modellen med egenskaperna hos observerade färgen utspädning profil.

Exemplen här illustrerar hur dessa variabler kan påverka resultatet vid användning av membran och / eller färgämnen protein för att övervaka cellproliferation.

Protocol

1. Allmän Membran märkning med PKH26 Cell Tracking Dye (ref. 25, figur 1)

  1. Använd steril teknik för steg från 1,1 till 1,9. Förbered ~ 10 7 humana perifera mononukleära blodceller eller lymfocyter (hPBMC, HPBL) använder laboratoriets standardmetoden med tillsats av en slutlig 300 xg centrifugering för att minimera kontamination blodplättar. Resuspendera celler vid 10 7 / ml i HBSS +1% BSA och plats på is, reservera en 500 pl alikvot (5x10 6 celler) för användning i steg 2.
  2. Placera 5x10 6 celler (500 pl) i en 12 x 75 mm koniskt polypropenrör. Tvätta en gång med 3,5 ml HBSS. Försiktigt aspirera supernatanten och lämnar inte mer än 15-25 il resterande vätska, men se till att inte ta bort celler. Använd detta rör för att framställa en 2x cellsuspension i steg 1,4.
  3. Under cellen tvätt i steg 1,2, tillsätt 0,5 ml diluent C-märkning fordon (från PKH26GL satsen) till ett 12 x 75 mm koniskt polypropenrör. Använd detta rör prepär en 2x PKH26 lösning i steg 1,5.
  4. Tillsätt 0,5 ml utspädningsmedel C-märkning fordon till den tvättade cellpelleten från steg 1,2 och aspirera och dispensera 3-4 gånger för att erhålla en enkelcellsuspension (2x celler). Undvik bubbelbildning och överdriven blandning, vilket kan minska cellviabiliteten och återhämtning.
  5. Omedelbart efter beredning av 2x cellsuspensionen i steg 1,4, förbereda en 2x (4 pM) färgämneslösningen genom att tillsätta 2,0 | il av 1,0 mM PKH26 färgämne lager i etanol (från PKH26GL satsen) till diluent C-röret som framställts i Steg 1,3 och skaka till dispergera jämnt.
  6. Omedelbart efter beredning av 2x färgämneslösningen i steg 1,5, snabbt Pipettera 2x cellsuspensionen från steg 1,4 till 2x färglösningen och samtidigt aspirera och dispensera 3-4 gånger för att helt skingra celler i färg Gör inte:. Tillsätt 1,0 mM färgen direkt celler, häll 2x celler till 2x färg, eller lägga 2x celler till 2x färg under virvling. Eftersom färgning är nästan ögonblicklig, sådana metoder ger mindreenhetliga stödnivåer än den rekommenderade metoden (figur 2).
  7. Efter 1 minut, tillsätt 1,0 ml värmeinaktiverat serum eller HBSS +5% BSA för att stoppa färgämnesupptagning i cellmembranen. Underlåtenhet att använda tillräckligt med protein riskerar bildande av färgämnet aggregat, som kan pelleten med celler under tvättningsstegen och orsaka oavsedd märkning av andra celler närvarande i ett experiment. Om mediet med 10% värmeinaktiverat serum (CM) eller HBSS +1% BSA skall användas som stoppreagens, utför färgning i en 15 ml koniskt polypropylenrör och lägga till minst 5,0 ml stoppreagens för att säkerställa adsorption av alla unincorporated färgämne.
  8. Centrifugera märkta cellerna under 5 min @ ~ 400 x g.. Försiktigt aspirera supernatanten utan att ta bort celler. Tvätta pelleten två gånger med 4 ml av CM eller HBSS +1% BSA, dispergera pelleten väl före återcentrifugering. För att minimera överföring av färgämne adsorberas på rörväggarna och maximera tvätteffekt, överföra cellerna till ett nytt polypropenrör efter fiRST resuspension. Obs: tillräckligt färgade celler uppvisar en tydlig rosa skiftning i pelleten.
  9. Resuspendera den tvättade cellpelleten i 1,0 ml HBSS +1% BSA. Räkna cellerna, bestämma cellutvinning och justera volymen för erhållande av en slutlig koncentration av 10 7 / ml. Med noggrann aspiration bör cellutvinning vara ≥ 85%. Om cellen återhämtning är <70%, fastställa orsaken innan du går vidare. Återkalla en 150 ul alikvot (1.5x10 6 celler) och placera på is för användning i steg 2.

2. Beredning av instrument och analys Setup Kontroller (tabell 1)

  1. Alikvotera 50 pl (5x10 5) av ofärgade celler från cellsuspensionen sparade i steg 1,1 i vardera av fem 1,8 ml Eppendorf-rör: 1, 3, 4, 5, och 7. Alikvotera 50 ^ (5x10 5) av PKH26 pos celler från steg 1,9 till var och en av tre rör: 2, 6 och 8.
  2. Tillsätt 10 | il IgG blocket (100 pg / rör av IgG, se tabell av reagens) till rören 1-8och inkubera i 10 min vid omgivande temperatur (20-25 ° C).
  3. Lägg en mättande mängd av antikroppen (er) som anges i tabell 1 till Rör 4, 5, 7, och 8 och inkubera alla prover (Rör 1-8) för 30 min vid omgivande temperatur och skyddas från ljus.
  4. Lägg 1,5 ml HBSS +1% BSA till alla prover, pelletera cellerna genom centrifugering (5 min @ 400 xg) och tvätta en gång med 1,5 ml HBSS +1% BSA, med noggrann strävan att undvika cellförlust.
  5. Återsuspendera varje prov i 500 | il HBSS +1% BSA. Om så krävs för prover som skall analyseras på cytometer, överföring till ett 12 x 75 mm rund botten rör. Tillsätt 10 | il av 100 | ig / ml 7-AAD dagliga arbetstiden lager (se tabell av reagens) till rören 3, 6, 7 och 8 såsom visas i tabell 1. Inkubera på is under 30 min före användning i flödescytometern installation och färgning verifiering (steg 3).

3. Flödescytometern installation och färgning Verifiering

  1. Kontrollera att flödet cytomeTER fungerar korrekt, med hjälp av laboratoriets etablerade procedurer för daglig kvalitetskontroll. Kontrollera att signaler kan lätt detekteras i varje spektral fönster som skall användas, och att detektorns respons är linjärt proportionell mot signalintensitet i fönstret som ska användas för spridning övervakning 14.
  2. Förvärva FSC vs SSC data för Rör 1 med linjära display skalor. Justera varje detektor har förstärkning så att lymfocytpopulationen faller i nedre vänstra kvadranten av punktdiagram, inte utanför skalan i antingen parameter och inte avbryts på grund av tröskeleffekt. Samla ungated FSC vs SSC data för alla proverna i steg från 3,3 till 3,7.
  3. Förvärva data för Rör 1, med ingen färg ersättning och logaritmiska skalor display för alla 4 fluorescens detektorer. Justera varje detektor höga spänning (HV) för att placera autofluorescens av ofärgade lymfocyter på skalan med få / inga celler ansamlas i den första kanalen. Ställ en analys gräns för varje histogrammotsvarar den ljusaste 2% av ofärgade celler.
  4. Använda ingen färg ersättning och de HV inställningar etablerade i steg 3,2 och 3,3, skaffa data för Rör 2, samla FSC, SSC och signaler i alla 4 fluorescens detektorer. För detektorn används för att övervaka PKH26 fluorescens, kontrollera att alla PKH26 pos celler visas på skalan som en enda symmetrisk topp i den 3: e -4: e decennium, med få / inga celler i den sista kanalen. Om det finns flera toppar eller topp form är skev, upprepa steg 1 med noggrann uppmärksamhet på salt minimering och blanda teknik (figur 2). Justera vid behov färgämneskoncentration.
  5. Använda inställningar etablerade i steg 3,3, skaffa data för Rör 3, samla FSC, SSC och signaler i alla 4 fluorescens detektorer. För detektorn för att övervaka 7-AAD fluorescens, kontrollera att 7-AAD pos celler faller över 2% gräns fastställts i steg 3,3 (dvs att icke livsdugliga celler är väl lösasfrån livskraftiga 7-AAD neg celler).
  6. Använda inställningar etablerade i steg 3,3, skaffa data för Rör 4, samla FSC, SSC och signaler i alla 4 fluorescens detektorer. Kontrollera att CD8 pos celler väl löses från ofärgade celler (dvs. faller över 2% gräns fastställts i steg 3,3 för FITC detektorn). Upprepa med rör 5 och kontrollera att CD8 pos celler väl löses från ofärgade celler (dvs. faller över 2% gräns fastställts i steg 3,3 för APC detektorn).
  7. Använda inställningar etablerade i steg 3,3, skaffa data för Tubes 6, 7 och 8, samla FSC, SSC och signaler i alla 4 fluorescens detektorer.
  8. Använd listan Filer läget som samlats in för Rören 1-5 och din färg kompensation programvara för att skapa en färg överlappar matris för varje fluorokrom i detektorerna som används för att övervaka de tre övriga fluorokromer. Tillämpa denna matris till listan läget filen för prov 6 och kontrollera att förekomsten av PKH26 labEling ändrar inte förmågan att upptäcka 7-AAD pos celler.
  9. Applicera färgen överlappar matrisen från steg 3,8 till listan läget filen för prov 7 och kontrollera att: a) 3 väl upplösta subpopulationer (CD3 neg CD4 neg, CD3 pos CD4 neg och CD3 pos CD4-pos) kan identifieras på ett FITC vs APC punktdiagram, och b) förekomst av anti-CD3-FITC och anti-CD4-APC ändrar inte förmågan att upptäcka 7-AAD pos celler. Om förekomst av anti-CD3-FITC ändrar övre 2% gränsen för uppgifter som samlats in på PKH26 detektorn justera gränsen behov.
  10. Applicera färgen överlappning matrisen från steg 3,8 till listan läget filen för prov 8. Om förekomst av PKH26 märkning förändrar 2% gränsen för FITC, 7-AAD eller APC detektorer från dem som använder autofluorescens kontroll i steg 3,3, justera gränsen (er) som behövs med hjälp Tube 7 i tabell 1 och kontrollera att den är fortfarande möjligt att distinguish CD3 pos CD4 pos, CD3 pos CD4 neg och CD3 neg CD4 neg celler med den justerade gränsen (er).

4. Spridning Modell Val för celldelning övervakning av Dye Spädning

  1. Bestäm avståndet mellan generationerna, som är beroende på antalet kanaler och logaritmiska decennier på din cytometer. För digitala instrument, är detta värde, typiskt 4 eller 5 decennier, bestäms av antalet fack i den digitala signalprocessorn. På analoga instrument, där antalet årtionden är sällan ett heltal, kräver noggrann modellering det exakta antalet decennier bestämmas experimentellt. För att göra detta, är data från en blandning av kalibrerade fluorescerande pärlor med tillverkarens tilldelade-relativa intensiteter förvärvats vid samma detektor hög spänning inställningar som används i experimentet. Positionen av vulsten topparna möjliggör kalibrering av logaritmisk skala i form av intensity sortiment per log decennium. Specifikt görs detta genom att plotta kanalnumret för varje pärltyp mot log av tillverkaren tilldelade-värdet. Lutningen av en bäst passande räta linjen för vulsten datavärden anger antalet relativa intensitet enheter per kanal. Multiplicerat med antalet kanaler kommer detta värde vara så att antalet log årtionden för full skala, där antalet kanaler som motsvarar en två-faldig minskning i intensitet (dvs. dotter generation mellanrum) kan beräknas 14.
  2. Bestäm om du vill använda en fast avstånd mellan generationer eller att låta avståndet flyta. En standard (fast) inställning kommer att använda generationerna avståndet värde som fastställts i steg 4,5 tilldela var varje generation och används vanligtvis när histogrammet saknar distinkta toppar. En flottör inställningen kan varje generationsskifte topp ståndpunkt fastställas av histogrammet formen och används vanligtvis när distinguishable generationerna toppar är uppenbara.
  3. Bestäm om du vill använda en fast topp bredd för alla generationer och en flytande bredd. En fast bredd använder SD beräknades för ostimulerade kontrollprovet att modellera alla generationer och väljs typiskt när provet saknar urskiljbara generationer toppar. En flytande bredd gör att programmet kan självständigt variera SD för varje generation och bäst med urskiljbara generationer toppar.
  4. Kör ett program som innehåller en modul spridning analys (här ModFit LT version 3,3). Fyll den stimulerade PKH26 pos-fil från data som ska analyseras (t.ex. en stimulerade 96 tim kultur av PKH26 pos celler motfärgades som för rör 8 i tabell 1).
  5. Välj parametrarna för analys, i detta fall PKH26 (585/42) gate livskraftig (7-AAD neg) CD3 pos lymfocyter och FSC vs SSC att utesluta små skräp och stora aggregat (Figur 3). Vid fastställandetdessa regioner vara noga med att inkludera höga framåtspridning där blaster finns normalt och notera att CD3 uttryck kan vara ner moduleras i stimulerade kulturer.
  6. Skapa en ny spridning modell med spridning guiden. Använda Öppna datafil (fliken Start), ladda ostimulerade PKH26 pos kontroll fil och definiera placeringen av högsta kanalen i föräldrarnas fördelning motsvarar odelade celler.
  7. Analysera filen för ostimulerade PKH26 pos kontroll, notera värdena för föräldrarnas topp position och bredd (standardavvikelse). Om en fast toppbredd (SD) önskas, kontrollera Lås SD.
  8. Ladda PKH26 neg kontroll (t.ex. en 96 HR kultur av PKH26 neg celler motfärgades som för Rör 7 i tabell 1). Justera antal generationer genom att toppen kanalen för dimmest generationen ovanför PKH26 neg kontroll. Detta bestämmer Number av dotter generationer modellen kan exakt passar och är typiskt 6-9 generationer.
  9. Öppna datafilen för den stimulerade provet (t.ex. en stimulerad 96 tim kultur av PKH26 pos celler motfärgades som för rör 8 i tabell 1) och bekräfta att regionerna för föräldrarnas topp position och SD som definieras i steg 4,7 oförändrade. Om fast generationsväxling avstånd önskas, välj Standardmodellen alternativ, annars väljer Flytande alternativet.
  10. Analysera varje experimentell fil i datamängden, enligt samma modell som definieras i steg 4,9. Mindre justeringar av föräldrarnas toppositionen kan vara nödvändig för de allra bästa passform som definieras både visuellt och genom den minskade chi square (RCS) värde.
  11. Spela de önskade spridning statistik följd av bästa passform för varje experimentell fil i datamängden. För en utförlig beskrivning av möjliga mått se Ref. 22.

Representative Results

Membran färgämnen som PKH26 fläck med nästan ögonblicklig uppdelning i cellmembranen snarare än genom kemisk reaktion (för CFSE) eller jämviktsbindning (för antikroppar). Bristande uppmärksamhet på de kritiska frågor som beskrivs i fig 1 kan resultera i svag eller heterogen färgning av den typ som visas i figur 2. Däremot användning av optimerade märkning förhållanden (Figur 1, Tabell 2) resulterar i ljusa homogena fördelningar lämpliga för en mängd olika tillämpningar cell spårning, inklusive celldelning övervakning baserad på färg utspädning (Figur 3). Död / döende celler förlorar varierande mängder spåra färg, som kan bredda och / eller skeva dotter intensitet produktion och komplicera spridning modellering baserad på färg utspädning 3,4,16,18. Användning av en bärkraft färg rekommenderas därför vid insamling färgämne utspädning uppgifter under förhållanden där ett betydande antal döda celler kan vara förvaldaskickas, såsom stimulerade kulturer (figur 3) eller äldre prov (Figur 4).

Eftersom spårning färg märkning vanligtvis ger fluorescensintensiteterna flera storleksordningar större än immunfenotypning, är det viktigt att inkludera lämpliga ersättning kontroller (tabell 1) och för att kontrollera att förekomsten av spårning färg inte påverkar förmågan att lösa antikroppar positiva och negativa celler (Figur 4). att undvika behovet av överdriven färgkompensation, är det föredraget att placera en ljus fluorokrom, eller en som inte hittas på celler av intresse, såsom ett färgämne uteslutits genom levande celler, i den spektrala kanalen (-erna) intill spårning färgämnet (Figur 4A & B vs. 4C & D). Vid användning av topp modellering programvara för att kvantifiera omfattningen av proliferation, få en bra passform kräver matchande antaganden i modellen som är utmärkande för färgen utspädning profiles analyseras (Figur 5 och tabell 3). Med lämpligt val av spårning färgämnen och reagens genomförbarhet, är det också möjligt att karakterisera proliferativa svar i flera lymfocytsubpopulationer samtidigt. Till exempel, såsom visas i figur 6, förenklar tillsats av en 2: a spårning färgämne diskriminering mellan regulatoriska T-celler (märkta med CellVue Claret) och högt prolifererade effektor-T-celler (märkta med CFSE) och ger mycket större detalj om deras interaktioner än vad som kunde erhållas användning av 3 H-tymidin märkning 18,27.

Figur 1
Figur 1. Allmän membran märkning protokoll för PKH26, PKH67 och CellVue färgämnen. Fördelning av dessa mycket lipofila färgämnen i cell MembraNES sker i huvudsak direkt efter blandning med celler när färgning utförs i saltfri Diluent C fordon som för att maximera färg löslighet och färgning effektivitet. Såsom sammanfattas i denna schematiska för allmän membran märkning med PKH26, är ljus, likformig och reproducerbar färgning därför lättast erhållits genom: 1) minimera mängden protein och / eller salter som är närvarande i steg färgning och 2) med användning av en blandningsteknik som försäkrar snabb homogen spridning av celler i färg (dvs. samtidigt utsätter alla celler i samma koncentration av färgämne).

Figur 2
Figur 2. Effekt av färgning förhållanden på PKH26 fluorescerande distributioner (omtryckt från ref. 18). Flera identiska prover av logaritmiskt växande, odlade U937 celler färgades med PKH26 (slutkoncentrationer: 1 x 10 7 celler / ml, 12 till 15 pM PKH26) under 3 min vid omgivande temperatur, med eller utan omedelbar blandning vid tillsats av 2x celler till 2x färgämne. Efter tvättning färgade celler analyserades på en Beckman Coulter CYAN flödescytometer med konstant instrumentinställningar Histogram 1:. Justeras för att placera alla celler på skalan i det första decenniet med få / inga celler ansamlas i den första kanalen ofärgade kontroll med PKH26 detektor spänning. Histogram 2: färgning vid 15 M färgämne med tillägg av 2x celler till 2x färg med omedelbar blandning resulterade i en ljus, homogent färgade, symmetrisk population av celler som placerats i den fjärde årtiondet med få / inga celler ansamlas i den sista kanalen (gMFI = . 2548, GCV = 26,2%) Histogram 3: färgning vid 15 M färgämne med tillägg av 2x celler till 2x färg men utan omedelbar blandning resulterade i en minskad intensitet och en bredare CV (gMFI = 505 , GCV = 116%) liksom en svagt färgade underpopulation, möjligen på grund av en minskning av celler dispenseras på väggen av röret snarare än in i 2x färglösningen Histogram 4:. En färgning fel ledde till 3 il koncentrerad etanolhaltig färgämne lager läggs direkt till 2x celler i spädmedel C utan ytterligare blandning i stället för att användas för att bereda en 2x färgämneslösning i diluent C. Detta resulterade i en slutlig färg koncentration av 12 M men gav mycket mörk och heterogena färgning (gMFI = 32,9, GCV = 1020%). Den observerade rätt skev sannolikt återspeglar de kombinerade effekterna av: i) dålig blandning på grund av vitt skilda cell och färgämnen volymer, och ii) det faktum att celler närmast färgen dispensering punkten skulle utsättas för en högre koncentration av färgämne än längre bort. Klicka här för att se större bild .

re 3 "src =" / files/ftp_upload/4287/4287fig3.jpg "FO: content-width =" 4.5IN "FO: src =" / files/ftp_upload/4287/4287fig3highres.jpg "/>
Figur 3. Användning av en bärkraft sond förenklar slussning av T-profiler cell proliferation hPBMC märktes med PKH26 (slutlig cellkoncentration: 3x10 7 / ml, slutlig färgkoncentration: 10 M).. Efter odling under 96 timmar i närvaro (stimulerad) eller frånvaro (ostimulerade) av anti-CD3 och IL-2, var cellerna motfärgades med anti-CD3-FITC, anti-CD19-APC och 7-AAD, och analyserades på en FACSCalibur flödescytometer (se referens 13 för detaljer). Färgkompensation utfördes vid datainsamling med hårdkodade ersättning kretsar. Omfattningen av spridningen modellerades enligt beskrivningen i steg 4 med spridning guiden i ModFit LT3.3. Data från PKH26 neg kontroll (tabell 1, Rör 7) är överlagrade för referens (grå fyllda histogram i kolumn 3). Livsduglighet för ostimulerade och STIackumulerade kulturer var 76% och 62% (ungated data för paneler A och B, respektive). Panel A. PKH26 färgade celler odlade under 96 timmar i medium var grindas till inkludera viabla (7-AAD neg) CD3 pos celler (R1). Förutom antikroppen integration och 7-AAD döda celler uteslutning grind, (SSC) en framåtspridning (FSC) versus sidospridning grind (R2) användes för att utesluta skräp och aggregat. Notera frånvaron av döda celler i sista tomt i denna panel. Bäst anpassade modellen för PKH26 spridning profilen (kolumn 3) gav en enda topp med RCS = 2,1 (donator 6, tabell 3), vilket indikerar god symmetri, och användes för att definiera den parentala positionen och starta toppbredden för analys av den stimulerade prov från denna datamängd (panel B). Panel B. En kopia alikvot av PKH26 färgade celler odlades med anti-CD3 och IL-2 för 96 timmar och gated på samma sätt som i panel A. En modell med flytande topp läge och flytande toppbredden gav den bästa passningen för denna data med RCS = 1,3 (donator 6, tabell 3). Panel C. Samma datafil som i panel A analyserades utan användning av 7-AAD uppgifter. När en primär FSC vs SSC användes för att partiellt utesluta döda celler och aggregat (R2) och en sekundär grind att välja CD3 positiva händelser (R3), förblev en liten kvarvarande population av döda celler (0,2% av gated händelser). Den bästa passform modell gav en enda topp med RCS = 2,2. Panel D. Samma datafil som i panel B var gated som i panel C. Notera den större kvarvarande populationen av döda celler i stimulerade provet (1,29% av gated händelser) för denna strategi gating. Den bästa passform modellen en med flytande topp position och flytande toppbredden (RCS = 1,3). Klicka här för att se större bild .

ig4.jpg "FO: content-width =" 5in "FO: src =" / files/ftp_upload/4287/4287fig4highres.jpg "/>
Figur 4. Effekt av fluorokrom val och färgämneskoncentration på förmågan att immunofenotyp lymfocyter märkta med PKH26. HPBMC isolerades från 24-tim gammalt blod och märkt med PKH26 såsom beskrivits i Steg 1, med undantag av att färgningen utfördes i 12 x 75 mm rund botten polystyrenrör snarare än 12 x 75 mm koniska polypropenrör. Omedelbart efter märkning med PKH26, cellerna motfärgades med de angivna immunophenotypic och lönsamhet reagens, och analyserades på en LSRFortessa flödescytometer med gating strategi fig. 3A och följande optiska konfiguration: 488 nm laser: FSC-A (488 nm); SSC -A (488/10 BP), FITC-A (530/30 BP), PKH26-A (575/26 BP), 7-AAD-A eller PerCP-A (695/40 BP). 640 nm laser: APC-A eller Topro-3-A (670/14 BP). Färgkompensation utfördes vid tidpunkten för datainsamling med hjälp av BD DiVa programvara. "Auto"indikerar autofluorescens av no-antikroppskontroll i relevant spektrala fönstret (APC för paneler A och B, PerCP för panelerna C och D). Data från PKH26 neg kontroll (tabell 1, Rör 7) är överlagrade för referens (grå fyllda histogram, kolumn 5). Efter färgning livsduglighet var liknande för alla prover (88-92%). Panel A. Celler märkta med PKH26 vid en slutlig koncentration av 2 | iM motfärgades med användning av anti-CD3-FITC, anti-CD4-APC, och 7-AAD ( röret 8 i tabell 3). Efter gating på livskraftiga (7-AAD neg) CD3 pos lymfocyter (kolumn 1) och uteslutning av skräp och aggregat baserade på FSC-och SSC (se figur 3A), var PKH26 intensitet utvärderades i kombination med APC CD4 (Kolumnerna 2 och 3). Vare okompenserade (kolumn 2) eller kompenserade (kolumn 3) ledde detta fluorokrom kombination i bra upplösning mellan CD4 pos T-celler och CD4 neg T-celler), vilket verifierats både genom en no-antibody, autofluorescerande kontroll (Rör 6 i tabell 1, kolumn 4) och två färger tomt på CD3 vs. CD4 (kolumn 6). Panel B. Använda samma fluorokrom kombination som i panel A, men ökar den slutliga PKH26 koncentrationen till 4 M inte negativt påverka förmågan att lösa CD4 pos T-celler från CD4 neg T-celler. Panel C. En replikat alikvot av celler oberoende märkta med PKH26 vid en slutlig koncentration av 2 | iM var motfärgades med användning av anti-CD3-FITC, anti-CD4-PerCP, och Topro-3. Efter gating på livskraftiga (Topro-3 neg) CD3 pos lymfocyter (kolumn 1) och uteslutning av skräp och aggregat baserade på FSC-och SSC (se figur 3A), var PKH26 intensitet utvärderades i kombination med anti-CD4-PerCP (kolumnerna 2 och 3). Betydande spektral överlappning av PKH26 till PerCP kanalen är tydligt i de okompenserade data (kolumn 2) och upplösning mellan PKH26 pos CD4 pos CD4 neg händelser är marginell efter ersättningar tillämpas (jämför kolumn 3 med no-antikroppen autofluorescerande kontroll som anges i kolumn 4). Panel D. När PKH26 koncentrationen ökas till 4 M, är det inte längre möjligt att använda fluorokromen kombinationen av Panel C. Spektrala överlapp från PKH26 till PerCP kanalen överskrider intensiteten av signalen från CD4 (kolumn 2) och CD4 pos pos PKH26 händelser inte längre kan lösas från CD4 neg PKH26 pos-T-celler (kolumn 3 vs. kolumn 4). Klicka här för att se större bild .

Figur 5
Figur 5. Effekt av spridning modellval på. godhet passar för färgämnes utspädning profiler hPBMC märktes med PKH26 (slutlig cellkoncentration: 3x10 7 / ml, slutlig färgkoncentration: 10 M). Efter odling under 96 timmar i närvaro (stimulerad) eller frånvaro (ostimulerade) av anti-CD3 och IL-2, cellerna skördades motfärgades med anti-CD3-FITC, anti-CD19-APC och 7-AAD och analyserades på en FACSCalibur flödescytometern (se referens 13 för detaljerade metoder). Färgkompensation utfördes vid tidpunkten för datainsamling med hårdkodade kretsar kompensation. Panel A. Det PKH26 intensitetsprofil från en ostimulerad 96 h kultur Donator 5, en moderat responder, var gated såsom visas i figur 3A och används för att tillhandahålla ModFit proliferation Wizard med en första uppskattning av position och bredd för toppen representerar odelade moderceller. Panel B. den PKH26 intensitet profil från en parallell stimulerad 96 h odling analyserades med hjälp av start uppskattningar frånPanel A och 4 olika kombinationer av "spridning Trollkarl inställningar, motsvarande fasta eller flytande toppintensiteter och fasta eller flytande toppbredd för successiva dotter generationer som visas. Som sammanfattas i Tabell 3, den modell som gav den bästa passformen till observerade data (lägsta minskad chi-, RCS) var "flytande / flytande" kombination som inte bara toppositioner utan också standardavvikelser av topparna dotter generationens fick att variera (RCS = 1,5). Samma modell gav den som passar bäst för Donator 6, en hög responder (Figur 3B och tabell 3).

Figur 6
Figur 6. Tillsats av en andra cell spårning färgämne förenklar diskriminering mellan effektor och reglerande T-celler i en flödescytometrisk analys undertryckande(Anpassad från ref 18.) Monocyt-utarmade lymfocyter framställda från Trima leukaferes filter färgades med anti-CD127-PE, anti-CD4-PE-Cy7, och anti-CD25-APC och flöde sorteras i populationer av effektor (Teff.; CD4 pos CD127 ljust CD25 dim), reglerande (Treg, CD4 pos CD127 dim CD25 POS), och tillbehör (CD4 neg) celler. Sorterade Treg celler märkta med CellVue Claret (slutlig cellkoncentration: 1x10 6 / ml, slutlig färgkoncentration: 1 M) och sorterade Teff märkt med CFSE (slutlig cellkoncentration: 5 × 10 7 / ml, slutlig färgkoncentration, 5 M) var sam-odlades vid varierande förhållanden i närvaro av anti-CD3, anti-CD28 och bestrålade accessoriska celler. Efter 96 timmar, kulturer skördades, motfärgades med anti-CD4-PE-Cy7 och LIVE / DEAD fastställbara Violet, och analyserades på en LSRII flödescytometer och färg kompensation utfördes vid tiden för uppgifter FÖRVÄRVn använda BD DiVa programvara (se referens 18 för detaljer inklusive ersättning kontroller). Spridningen Index för Teff och Treg modellerades som beskrivs i steg 4, med hjälp av spridning guiden i ModFit LT3.3. Datapunkter i panelerna B och C representerar medelvärdet ± 1 standardavvikelse för trefaldiga prover Panel A. Representativa data visas för ett av tre tredubbla prover på en Treg:. Teff förhållande av 0.25:1. LIVE / DEAD fastställbara Violet reagens användes för att utesluta döda celler (R1, övre vänstra tomt, accessoriska celler = rödbruna, icke viabla Teff = grå och icke viabla Treg = röd) från alla andra data tomter. CellVue Claret färgning användes för att särskilja livskraftig Treg (R4, center, höger tomt, blått) från livskraftiga men mycket frodats Teff (R5, center, höger tomt, grön). En enda parameter CFSE spridning profil för Teff (nedre vänstra tomt) genererades av gating på celler som var CFSE pos (R5), CD4 pos (R3), livskraftiga (inte R1), och hade lymfocyt SCAtter egenskaper (R2). En enda parameter CellVue Claret spridning profil för Treg genererades genom gating på celler som var CellVue Claret pos (R4), CD4 pos (R3), livskraftiga (inte R1), och hade lymfocyter scatter egenskaper (R2). Notera den generösa lymfocytområdet (R2) som definieras som lymfocytblaster. Notera även att antalet celler som skall samlas beror på den lägsta frekvensen populationen av intresse. I en cellproliferation experiment där populationen av intresse kan vara fördelade över ett brett intervall av intensiteter representerande upp till sju eller åtta generationer ett stort antal celler bör samlas för att noggrant modellera och beräkna antalet celler i varje generation. När man studerar sällsynta celler, kan det vara nödvändigt att helt enkelt köra provröret nästan torrt för att samla största möjliga antalet händelser. För provet som visas här, gör detta resulterade i totalt ~ 25.000 händelser, varav 11.923 var Teff (spridning Index 3,85) och 1.380 var Treg (proliferationsindex 1,83). Panel B. Som väntat ökar andelen tregs finns i samodlingar ledde till större undertryckande av Teff cellproliferation. Liknande resultat erhölls med både CellVue Claret-färgade (heldragen linje) eller ofärgade (streckad linje) Treg, vilket indikerar att färgning med CellVue Claret spårning färgämne inte påverkade Treg potens. Är relativt anergiska och, som väntat Panel C. Treg, gjorde inte prolifererar vid inkubation med anti-CD3, anti-CD28, och celler tillbehör i frånvaro av teff celler (Treg: Teff förhållande 1:0). Men eftersom andelen Teff finns i samodlingar ökat (dvs. som Treg: Teff talet minskade), ökade omfattningen av Treg spridning också. De generellt större felstaplar för dessa uppgifter åtminstone delvis återspeglar den begränsade omfattningen av spridningen, vilket leder till mindre antal insamlade händelser i förhållande till Teff och större osäkerTy vid modellering av antalet celler i varje generation. Klicka här för att se större bild .

Rör Nej (Syfte) PKH26 Antikropp (er) 7-AAD
1 (Setup, ersättning) - - -
2 (Inställning, ersättning) + - -
3 (Inställning, ersättning) - - +
4 (ersättning) - CD8-FITC b -
5 (ersättning) - CD8-APC b -
6 (ingen Ab-kontroll) + - +
7 (ingen spårning färgämne controll) - CD3-FITC CD4-APC eller CD19-APC c +
8 (T0 kontroll) + CD3-FITC CD4-APC eller CD19-APC c +

. Tabell 1 Instrumentinställning styr en A kontrollerar noterat är lämpliga för en 4-färg CD4 T-cellproliferation övervakning analys med:. PKH26 (proliferation färg), CD3-FITC (pan-T-cell markör), CD4-APC (T-hjälparceller cellmarkör), 7-aminoactinomycin D (7-AAD, döda celler uteslutning) b Ljusare surrogat för CD3-FITC och CD4-APC (bättre förmåga att upptäcka ersättning fel) C Figur 3:.. CD3-FITC och CD19-APC. d. Figur 4: CD3-FITC och CD4-APC.

Celltyp Slutlig cellkoncentration Final färgkoncentration </ Strong> Referens
hPBMC B 1 x 10 7 / ml 2 iM PKH67 10,17
5 x 10 6 / ml 2 iM PKH26 12
3 x 10 7 / ml 10 iM PKH26 13
5 x 10 7 / ml 30 iM PKH26 18
1 x 10 6 / ml 1 M CellVue Claret c 18
3 x 10 7 / ml 4 M CellVue Claret 13
5 x 10 7 / ml 5 M CellVue Claret 18
Celler i kultur 5 x 10 5 / ml 0,1 pM PKH26 (1 ° mammarceller) 8
1 x 10 7 / ml 15 iM PKH26 (U937) 18
1 x 10 7 / ml 12,5 -15 iM PKH26 (U937) 15
1 x 10 7 / ml 1 iM PKH67 (K562) 18
1 x 10 7 / ml 1 iM PKH67 (T-cellinjer) 9
1 x 10 7 / ml 10 M CellVue Claret (YAC-1) 23

Tabell 2. Icke-störande membran-Dye färgning Villkor en. En anpassas och uppdateras från Ref. 18. B. En låg hastighet tvätt (300 xg) användes för att minimera kontaminering blodplättar. C Treg celler (flöde sorterade CD4 pos pos CD25 CD127 neg lymfocyter).

<td> 4,5
Modell Inställningar modellresultat
Donator Behandling Peak position SD Föräldrarnas position Föräldrarnas SD # Av Peaks Monterad RCS PI PF
5 Ostimulerade Float Float 209 4,5 1 5,1 1,0 0
5 Stimulerad Fast Fast 209 7 35 3,9 31
5 Stimulerad Float Fast 209 4,5 8 19 4,3 30
5 Stimulerad Fast Float 209 9,2 6 1,9 3,8 30
5 Stimulerad Float Float 209 9,0 7 1,5 3,7 29
6 Ostimulerade Float Float 205 4,0 1 2,1 1,0 0
6 Stimulerad Fast Fast 205 4,0 6 42 6,6 60
6 </ Td> Stimulerad Float Fast 205 4,0 7 12 7,4 60
6 Stimulerad Fast Float 205 8,6 6 6,9 6,8 62
6 Stimulerad Float Float 205 6,5 6 1,3 6,5 59

Tabell 3. Inverkan av spridning modell på Goodness of Fit (RCS) och Metrics spridning en. Ett prov färgning, datainsamling och slussning som beskrivs i figur 3A & B.

Discussion

De metoder som beskrivs här är de som finns i våra kombinerade laboratorier mest tillförlitligt ge optimala resultat för hPBMC märkning med membran färgämnen 13,16,18 och lymfocyter delmängd fenotypning och spridning spårning med antingen membranet eller färgämnen protein 2,11,13,16, 18. Såsom illustreras i figurerna 1 och 2, är ljus likformig märkning lättast uppnås genom att begränsa närvaron av fysiologiska salter och användning av en blandnings teknik som resulterar i snabb, homogen exponering av alla celler till samma koncentration av färgämne. Eftersom färgning med membran färgämnen sker genom uppdelning i lipiddubbelskiktet kan andra variabler som ändrar gratis färgkoncentration påverka även märkning effektivitet. Till exempel märkning i runda rör botten polystyren resulterar i mindre effektiv urtvättning av salter före återsuspension i Diluent C och även i minskad fri färgkoncentration grund att färga adsorption på rörväggar, i synnerhetvid lägre färgämneskoncentrationer. Båda faktorer tenderar att ge bredare färgning fördelningar än när märkningen utförs med koniska rör botten polypropen (figurerna 3, 4 och opublicerade resultat). Prov ålder och typ kan också påverka toppbredden även när optimerade färgningsprocedurer används. Till exempel CV för PKH26 pos lymfocyter isolerade från nytaget blod sträcker sig från 14-20% (figur 3, ref. 13 och opublicerade resultat), medan CV för lymfocyter isolerade från 24 tim gammal blodprov eller Trima filter pheresis rad 25 till 30 % (Figur 4 och Ref. 18).

Färgning enhetlighet och i vilken utsträckning icke-viabla celler kan uteslutas från analysen både påverka om urskiljbara dotter toppar är uppenbara i färgen utspädning profilen, vilket i sin tur påverkar valet av spridning modell för att passa de observerade data (fig 5 och 6 (figur 3, 5 och 6, tabell 3), andra programpaket innehåller också moduler för att analysera spridning uppgifter. Dessa inkluderar FCSExpress (de novo Software, Los Angeles, CA) och FlowJo (Träd Star, Inc., Ashland, OR). Alla dessa program använder en icke-linjär minsta kvadrat-analys för att iterativt hitta den som passar bäst till de rådata genom att ändra position, höjd och SD (eller bredd) på Gaussiska toppar som representerar sekventiella dotter generationer. Proliferativ Index (PI) och Prekursor Frekvens (PF) är de vanligaste åtgärderna för omfattning spridning. PI, såsom definieras av ModFit, är ett mått på ökningen av cellantalet under loppet av analysen, analogt med "stimuleringsindex" av en tymidinupptag. PF returnerar fraktionen av celler i det ursprungliga populatjon som svarade på stimulans genom prolifererande. Försiktighet rekommenderas dock när man läser litteratur sedan terminologin varierar något mellan programvarupaket (t.ex. FlowJo och ModFit använder olika definitioner och beräkningar för vad som menas med "spridning Index") 22.

De kritiska frågor som diskuterades här för märkning och spridning analys med membran färgämnen också stött vid användning protein färgämnen. Till exempel måste noggrann uppmärksamhet blandningsteknik också observeras, tillsammans med undantag av döda / döende celler, för att få enhetliga fördelningar och urskiljbara toppar dotter vid användning CFSE (Figur 6) 2-4,13,18,24. Lämpligt val av fluorokromer för fenotypning och livskraft bedömning är också viktigt att undvika alltför spektral överlappning och oförmåga att känna igen antikroppar positiva celler, särskilt med synliga färger avger protein som CFSE 2-4,11,13,16,18 (Figur 6). Slutligen, även membran färgämnen i allmänhet tenderar att uppvisa mindre toxicitet 11,26, är det möjligt att över-märka celler med antingen klass av färgämne. Det är därför alltid nödvändigt att kontrollera att koncentrationen av spåra använt färg inte har ändrat funktionaliteten hos de celler som skall spåras (Figur 6) 3,13,16,18.

Disclosures

K. Humphrey, JD Tario, Jr och PK Wallace har fått förkommersiella cell tracking reagenser för utvärdering av Life Technologies, Inc. och BD Biosciences. AD Bantly och JS Moore har fått förkommersiell cell tracking reagenser för utvärdering av Life Technologies, Inc. och finansiering från PTI Research, Inc. för förkommersiell karakterisering av olika CellVue cell tracking färgämnen. K. Muirhead är anställd av SciGro, Inc., som erbjuder konsulttjänster till Phanos Technologies, Inc. (ägare av PKH och CellVue färgämnen) och ger backup teknisk support för Sigma-Aldrich och Molecular Inriktning Technologies, Inc. (distributörer av dessa färgämnen).
Produktion och fri tillgång till denna artikel är sponsrad av Sigma-Aldrich.

Acknowledgments

Författarna vill särskilt tacka följande personer för deras tekniska och intellektuella bidrag till utvecklingen av dessa metoder genom åren: Bruce Bagwell (Verity Software House), Nadège Bercovici (IDM), Lizanne Breslin (Zynaxis Cell Science och PTI forskning) , Brian Gray (PTI Research), Jan Fisher (Dartmouth Medical School), Alice Givan (Dartmouth Medical School), Betsy Ohlsson-Wilhelm (SciGro, Inc.), och Mary Waugh (Dartmouth Medical School). De skulle också vilja tacka Bowdoin klassen 2006 från den årliga kurser i forskningsmetoder och tillämpningar av flödescytometri, vilket genererade de data som visas i figur 2.

Flödescytometri utfördes vid Roswell Park Cancer Institute: s flödescytometri Laboratory, som grundades delvis av utrustning anslag från NIH Delad Instrument Program och får stöd från Core Grant (5 P30 CA016056-29) från NationalCancer Institute i Roswell Park Cancer Institute, och vid Abramson Cancer Center flödescytometri och cellsortering Resource Laboratory vid University of Pennsylvania, som grundades delvis av utrustning anslag från NIH Delad Instrument Program och får stöd från NIH # 2P30 CA016520 från National Cancer Institute. Arbetet som visas i figur 3 och 5 fick också stöd delvis av SBIR bidrag EB00228 från National Institutes of Biomedical Imaging och bioteknik (NIBIB) tilldelas PTI Research, Inc.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Commercially Purchased
7-Aminoactinomycin D Sigma-Aldrich A9400
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A4503
Fetal bovine serum (FBS) Atlanta Biologicals S11150
Hanks balanced salt solution (HBSS) Life Technologies 14175-079 Calcium and magnesium free, without phenol red
Human IgG Cohn fraction II and III globulins Sigma-Aldrich G-4386
Mouse anti-human CD3-FITC BD Biosciences 349201 Saturating concentration as determined by laboratory titration
Mouse anti-human CD4-APC BD Biosciences 340672 Saturating concentration as determined by laboratory titration
Mouse anti-human CD4-PECy7 BD Biosciences 348799 Saturating concentration as determined by laboratory titration
Mouse anti-human CD8-FITC BD Biosciences 347313 Saturating concentration as determined by laboratory titration
Mouse anti-human CD8-APC Caltag (Life Technologies) MHCD0805 Saturating concentration as determined by laboratory titration
Mouse anti-human CD19-APC Caltag (Life Technologies) MHCD1905 Saturating concentration as determined by laboratory titration
Mouse anti-human CD25-APC BD Biosciences 340938 Saturating concentration as determined by laboratory titration
Mouse anti-human CD127-PE BD Biosciences 557938 Saturating concentration as determined by laboratory titration
Mouse anti-human CD3 eBiosciences 16-0037-85 1.0 mg/mL; azide free
Mouse anti-human CD28 eBiosciences 16-0289-85 1.0 mg/mL; azide free
PBS Gibco 21300-058
PKH26 red fluorescent cell linker kit containing 10-3M PKH26 in EtOH and Diluent C Sigma-Aldrich PKH26GL-1KT
or
MINI26-1KT
Procedures in Step 1 also apply to kits containing PKH67 or other CellVue dyes
CellVue Claret far red fluorescent cell linker kit containing 10-3M CellVue Claret in EtOH and Diluent C Sigma-Aldrich MINCLARET-1KT or MIDCLARET-1KT
5-(and-6)-carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester (CFDA-SE) Invitrogen (Life Technologies) C34554 Non-fluorescent; cleaved by membrane esterases to form fluorescent amino-reactive carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)
LIVE/DEAD Fixable Violet Invitrogen (Life Technologies) L34955
Sterile 12x75 mm conical
polypropylene tubes & caps
VWR 60818-102 Gives better membrane dye staining efficiency (reduced dye adsorption; less cell loss during supernatant aspiration)
12x75 mm round bottom
polystyrene tubes
Becton Dickinson 21008-936
Flow cytometer BD Bioscience FACSCalibur
LSRFortessa
Any cytometer able to detect FITC, PKH26, and 7-AAD (ex. 488 nm; em. 520 nm, 567nm, and 655nm, respectively) and APC ex. 633-640 nm; em. 660nm)
Flow cytometer Beckman Coulter LSRII CyAn Any cytometer able to detect FITC, PKH26, and 7-AAD (ex. 488 nm; em. 520 nm, 567nm, and 655nm, respectively) and APC ex. 633-640 nm; em. 660nm)
Laboratory Prepared
7-Aminoactinomycin D,
concentrated stock
NA NA 1 mg/mL in PBS. Freeze in aliquots and store at -20 °C.
7-Aminoactinomycin D,
working stock
NA NA 100 μg/mL in PBS; prepare daily from 1 mg/mL frozen stock.
IgG block NA NA HBSS + 10 mg/mL Human IgG Cohn fraction II and III globulins + 10 mg/mL BSA.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Poon, R. Y., Ohlsson-Wilhelm, B. M., Bagwell, C. B., Muirhead, K. A. Use of PKH Membrane Intercalating Dyes to Monitor Cell Trafficking and Function. Living Color: Flow Cytometry and Cell Sorting Protocols. Diamond, R. A., DeMaggio, S. Springer-Verlag. New York, NY. 302-352 (2000).
  2. Wallace, P. K., Muirhead, K. A. Cell Tracking 2007: A Proliferation of Probes and Applications. Immunol. Invest. 36, 527-562 (2007).
  3. Hawkins, E. D., Hommel, M., Turner, M. L., Battye, F. L., Markham, J. F., Hodgkin, P. D. Measuring lymphocyte proliferation, survival and differentiation using CFSE time-series data. Nat. Protoc. 2, 2057-2067 (2007).
  4. Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nat. Protoc. 2, 2049-2056 (2007).
  5. Bolton, D. L., Minang, J. T., Trivett, M. T., Song, K., Tuscher, J. J., Li, Y., Piatak, M., O'Connor, D., Lifson, J. D., Roederer, M., Ohlen, C. Trafficking, Persistence, and Activation State of Adoptively Transferred Allogeneic and Autologous Simian Immunodeficiency Virus-Specific CD8+ T Cell Clones during Acute and Chronic Infection of Rhesus Macaques. J. Immunol. 184, 303-314 (2010).
  6. Juopperi, T. A., Sharkis, S. J. Isolation of Quiescent Murine Hematopoietic Stem Cells by Homing Properties. Meth. Mol. Biol. 430, 21-30 (2008).
  7. Kusumbe, A. P., Bapat, S. A. Cancer stem cells and aneuploid populations within developing tumors are the major determinants of tumor dormancy. Cancer Res. 69, 9245-9253 (2009).
  8. Pece, S., Tosonim, D., Confalonieri, S., Mazzarol, G., Vecchi, M., Ronzoni, S., Bernard, L., Viale, G., Pelicci, P. G., Fiore, P. P. D. i Biological and Molecular Heterogeneity of Breast Cancers Correlates with Their Cancer Stem Cell Content. Cell. 140, 62-73 (2010).
  9. Gertner-Dardenne, J., Poupot, M., Gray, B. D., Fournié, J. -J. Lipophilic fluorochrome trackers of membrane transfers between immune cells. Immunol. Invest. 36, 665-685 (2007).
  10. Bercovici, N., Givan, A. L., Waugh, M. G., Fisher, J. L., Vernel-Pauillac, F., Ernstoff, M. S., Abastado, J. P., Wallace, P. K. Multiparameter precursor analysis of T-cell responses to antigen. J. Immunol. Methods. 276, 5-17 (2003).
  11. Givan, A. L., Fisher, J. L., Waugh, M. G., Bercovici, N., Wallace, P. K. Use of cell-tracking dyes to determine proliferation precursor frequencies of antigen-specific T cells. Methods Mol. Biol. 263, 109-124 (2004).
  12. Schwaab, T., Tretter, C. P., Gibson, J. J., Cole, B. F., Schned, A. R., Harris, R., Fisher, J. L., Crosby, N., Stempkowski, L. M., Heaney, J. A., Ernstoff, M. S. Tumor-related immunity in prostate cancer patients treated with human recombinant granulocyte monocyte-colony stimulating factor (GM-CSF). Prostate. 66, (6), 667-674 (2006).
  13. Bantly, A. D., Gray, B. D., Breslin, E., Weinstein, E. G., Muirhead, K. A., Ohlsson-Wilhelm, B. M., Moore, J. S. CellVue Claret, a New Far-Red Dye, Facilitates Polychromatic Assessment of Immune Cell Proliferation. Immunol. Invest. 36, 581-605 (2007).
  14. Givan, A. L. A flow cytometric assay for quantitation of rare antigen-specific T-cells: using cell-tracking dyes to calculate precursor frequencies for proliferation. Immunol. Invest. 36, 563-580 (2007).
  15. Tario, J. D., Gray, B. D., Wallace, S. S., Muirhead, K. A., Ohlsson-Wilhelm, B. M., Wallace, P. K. Novel lipophilic tracking dyes for monitoring cell proliferation. Immunol Invest. 36, 861-885 (2007).
  16. Wallace, P. K., Tario, J. D. Jr, Fisher, J. L., Wallace, S. S., Ernstoff, M. S., ,, Muirhead, K. A. Tracking Antigen-Driven Responses by Flow Cytometry: Monitoring Proliferation by Dye Dilution. Cytometry. 73, 1019-1034 (2008).
  17. Barth, R. J., Fisher, D. A., Wallace, P. K., Channon, J. Y., Noelle, R. L., Gui, J., Ernstoff, M. S. A Randomized Trial of Ex vivo CD40L Activation of a Dendritic Cell Vaccine in Colorectal Cancer Patients: Tumor-Specific Immune Responses Are Associated with Improved Survival. Clin. Cancer Res. 16, 5548-5556 (2010).
  18. Tario, J. D., Muirhead, K. A., Pan, D., Munson, M., Wallace, P. K. Tracking Immune Cell Proliferation and Cytotoxic Potential Using Flow Cytometry. Meth. Mol. Biol. 699, 119-164 (2011).
  19. Fuse, S., Underwood, E. Simultaneous Analysis of In Vivo CD8+ T Cell Cytotoxicity Against Multiple Epitopes using Multicolor Flow Cytometry. Immunol. Invest. 36, 829-845 (2007).
  20. Schütz, C., Fleck, M., Mackensen, A., Zoso, A., Halbritter, D., Schneck, J. P., Oelke, M. Killer artificial antigen-presenting cells: a novel strategy to delete specific T cells. Blood. 111, 3546-3552 (2008).
  21. Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity. Expert Rev. Vaccines. 9, 601-616 (2010).
  22. Roederer, M. Interpretation of cellular proliferation data: Avoid the panglossian. Cytometry. 79A, 95-101 (2011).
  23. Quah, B. J. C., Parish, C. R. The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation. J. Vis. Exp. (44), e2259 (2010).
  24. PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kits for General Cell Membrane Labeling [Internet]. Sigma-Aldrich. Available from: http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/Sigma/Bulletin/mini26bul.Par.0001.File.tmp/mini26bul.pdf (2012).
  25. Houlihan, D. D., Newsome, P. N. Critical Review of Clinical Trials of Bone Marrow Stem Cells in Liver Disease. Gastroenterology. 135, 438-450 (2008).
  26. Brusko, T. M., Hulme, M. A., Myhr, C. B., Haller, M. J., Atkinson, M. A. Assessing the In Vitro Suppressive Capacity of Regulatory. T Cells. Immunol. Invest. 36, 607-628 (2007).
Optimerade färgning och spridning modelleringsmetoder för celldelning övervakning med hjälp Färgämnen Cell Tracking
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tario Jr., J. D., Humphrey, K., Bantly, A. D., Muirhead, K. A., Moore, J. S., Wallace, P. K. Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes. J. Vis. Exp. (70), e4287, doi:10.3791/4287 (2012).More

Tario Jr., J. D., Humphrey, K., Bantly, A. D., Muirhead, K. A., Moore, J. S., Wallace, P. K. Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes. J. Vis. Exp. (70), e4287, doi:10.3791/4287 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter