Summary
Klinisk relevante dyremodeller for intracerebral blødning (ICH) er nødvendige for at udvide kendskabet til hæmoragisk slagtilfælde og til at undersøge nye terapeutiske strategier. I denne undersøgelse beskriver vi og vurdere to ICH-modeller, der implementerer ensidige injektioner af enten autologt blod eller bakteriel collagenase i de basale ganglier (corpus striatum) af mus.
Abstract
Spontan intracerebral blødning (ICH) definerer en potentielt livstruende neurologiske sygdom, der tegner sig for 10-15% af alle slagtilfælde-relaterede indlæggelser og for hvilke der ikke effektive behandlinger er tilgængelige til dato 1,2. På grund af de uensartede ICH hos mennesker er forskellige prækliniske modeller for at grundigt undersøge potentielle terapeutiske strategier 3. Eksperimentel ICH almindeligvis induceres hos gnavere ved intraparenchymal injektion af enten autologt blod eller bakteriel collagenase 4. Den passende model vælges på basis af patofysiologien af blødning induktion og skade progression. Blod injektion model efterligner en hurtigt fremadskridende blødning. Alternativt kan bakteriel collagenase enzymatisk forstyrrer den basale lamina i hjernen kapillærer, hvilket forårsager en aktiv blødning, der almindeligvis udvikler sig over flere timer 5. Resulterende perihematomal ødem og neurofunctional underskud kan kvantificeres from begge modeller. I denne undersøgelse beskrev vi og evalueres en modificeret dobbelt injektion model af autologt blod 6 samt et ICH injektion model af bakteriel collagenase 7, som begge target de basale ganglier (corpus striatum) af mandlige CD-1 mus. Vi vurderede neurofunctional underskud og hjerneødem ved 24 og 72 timer efter ICH induktion. Intrastriatal injektion af autologt blod (30 pl) eller bakteriel collagenase (0.075U) forårsagede reproducerbare neurofunctional underskud hos mus og signifikant forøget hjerne-ødem 24 og 72 timer efter kirurgi (p <0,05). Som konklusion, udbytte begge modeller konsistente hæmorrhagiske infarkter og repræsenterer grundlæggende metoder til præklinisk ICH forskning.
Protocol
Alle procedurer blev udført i overensstemmelse med NIH Guide til Pleje og anvendelse af forsøgsdyr og godkendt af Animal Care og brug Udvalg på Loma Linda University.
1. Presurgical Forberedelser
Aseptiske teknikker anbefales til alle kirurgiske procedurer. Desinficér stereotaktisk apparat og fremstille sterile kirurgiske redskaber forud for operationen. Bær personlige værnemidler (PPE) under hele håndtering af dyr. Bruge en varmepude under kirurgi for at opretholde dyrets fysiologiske kropstemperatur.
- Vejes 8-12 uger gamle mus med en tredobbelt stråle dyr skala.
- Co-injicere ketamin (100 mg / kg) og xylazin (10 mg / kg) intraperitonealt derefter tillade 7-10 min for anæstesi med virkning (monitor for en tilstrækkelig sedation).
- Placer musen på en termisk tæppe og barbere hovedbunden.
- Påfør oftalmisk salve til begge øjne.
- Fastgørluftvejene, ved forsigtigt at bevæge tungen sideværts, og omhyggeligt sikre musen hoved på stereotaktisk apparat. Bemærk: Hovedet skal være fastgjort vandret ud fra det stereotaktiske ramme.
- Desinficere det kirurgiske område med Betadine, og skyl med 70% ethanol. Gentag skiftevis anvendelser af Betadine og 70% ethanol i i alt tre gange. Bomuld tippes applikatorer kan anvendes til dette formål.
2. Blood Injection Model
- Gøre en 1 cm lang midtlinieincision i hovedbunden med en nr. 10 skalpelblad.
- Anvende bomuld tippes applikatorer for at fjerne det bløde væv, der dækker skallen med henblik på at blotlægge den vinkelrette skæringspunktet af den koronale og sagittale sutur (bregma).
- Monter Hamilton-sprøjte (250 ul) på indsprøjtningspumpen, og stereotaksisk lede nålen (26 Gauge) over bregma.
- Derefter justeres det stereotaktiske manipulator arme til at positionere nålen 0,2 mm anterior og 2mm lateralt til højre. Ved disse koordinater lave et lille kraniel borehul under anvendelse af en variabel hastighed boremaskine med en 1 mm bor.
- Suspender dyrets hale og desinficere sin nedre overflade med 70% ethanol.
- Punktere centrale halearterien med en steril kanyle (fx 26 gauge), og samle det arterielle blod ind i en unheparinized kapillarrør.
- Overfør blodet hurtigt fra kapillarrøret i glascylinderen af Hamilton-sprøjte, og sæt derefter stemplet.
- Sæt nu 30 gl eller mere af arterielt blod indeholdende Hamilton-sprøjte på indsprøjtningspumpen og kanylen (med skrå kant vender den sagittale sutur) gennem det finnede hul lige indtil dens affasning ikke længere er synlig.
- Fra dette punkt forhånd nålen 3 mm ventralt og injicere 5 pi autologt blod med en hastighed på 2 pl / min.
- Efter afslutning af den første injektion forhånd nålen 0.7 mm yderligere i dybden.
- Vent på5 min og derefter injicere 25 ul blod ind i den højre striatum.
- Ved afslutningen af den anden injektion lade nålen på plads for yderligere 10 minutter, inden der udtages den ved en hastighed på 1 mm / min.
- Forsegl borehullet med ben voks og sutur i huden.
- For postoperativ analgesi injicere 0,05 mg / kg af buprenorphin subkutant i foropvarmede væske (normalt saltvand).
3. Collagenase Injection Model
- Efter de presurgical præparater, Gentag trin 1-4 som beskrevet for blod injektion model.
- Fyld Hamilton-sprøjte (10 pi) med 0.075U af bakteriel (klostridial) collagenase VII-S opløst i 0,5 pi af saltvand. Undgå dannelsen af luftbobler.
- Sæt Hamilton-sprøjte på indsprøjtningspumpen og stik nålen (26 Gauge), gennem borehullet lige indtil sin facet er ikke længere synlig.
- Før nålen 3,7 mm ventralt og sprøjt 0.075U af collagenase into højre striatum med en hastighed på 2 pl / min.
- Efter afslutning af injektionen, lade nålen på plads for yderligere 10 minutter, inden der udtages den ved en hastighed på 1 mm / min.
- Forsegl borehullet med ben voks og sutur i huden.
- Injicere 0,05 mg / kg af buprenorphin subkutant i foropvarmede postoperative fluider.
4. Skinoperation
- Efter de presurgical præparater, Gentag trin 1-4 som beskrevet for blod injektion model.
- Sæt nålen (26 Gauge) 3,7 mm ventralt gennem borehullet. Nålen skal forblive på plads i 10 minutter, før de trækkes tilbage med en hastighed på 1 mm / min.
- Forsegl borehullet med ben voks og sutur i huden.
- Injicere 0,05 mg / kg af buprenorphin subkutant i foropvarmede postoperative fluider.
5. Repræsentative resultater
Eksperimentel intrastriatal blødning fremkalder morfologiske somsamt adfærdsændringer hos gnavere. Disse ændringer kan evalueres for at sikre en passende udførelse af fremgangsmåden, eller at undersøge virkningerne af potentielle behandlinger. Generering af bløder i en målrettet hjerne område (f.eks basalganglierne) er mest afgørende for en reproducerbar metode, og kan verificeres på bruttoafkast eller histologisk plettet hjerne sektioner (Figur 1-2). Skade til basalganglierne resultater i sensomotoriske mén, som kan kvantificeres via forskellige adfærdsmæssige vurderinger. Resultaterne af hjørnet turn test viste, at der efter eksperimentel højresidig ICH, mus viste signifikant oftere ipsilaterally og bort fra nedsat kontralaterale (venstre) side, end skinopererede dyr ved 24 og 72 timer efter operation (fig. 3 A). Endvidere rens evne til at placere nedsat (venstre) forlem på en overflade, efter vibrissae stimulering, blev evalueret via musens forben placere prøven. Ved 24 og 72 timer efter operationen, sub musning fremskrives til højresidig ICH viste signifikant færre placeringer end skinopererede dyr. Måling af hjerneødem ofte anvendes til at kvantificere omfanget af hjerneskade efter eksperimentel ICH. Intracerebrale injektioner af autologt blod (30 pl) eller bakteriel collagenase (0,075 U) førte til en betydelig stigning i hjernens vandindhold i den ipsilaterale cortex og basale ganglier ved 24 (fig. 4 A) og 72 timer (figur 4 B) efter kirurgi ( sammenlignet med sham). Resultatet af adfærd tests (figur 3) og omfanget af hjerneødem (figur 4) viste ingen forskel mellem blodet og collagenase injektion modeller på givne mængder.
Figur 1. Modeling ICH i mus. (A) En forenklet skematisk afbildning af en koronal hjerne afsnit 0.2 mm anterior til bregma illustrerer proposed placering af autologt blod eller collagenase injektion. Den laterale ventrikel er mærket LV. CPu står for nucleus caudatus-putamen, en del af striatum, og GP identificerer globus pallidus. Både, striatum og globus pallidus tilhører en gruppe af subcorticale kerner, også kendt som basalganglierne. (B) repræsentativt mikrofotografi af et koronale hjerne sektion 0.2mm forreste af bregma, opnået ved 24 timer efter intrastriatal injektion af autologt blod.
Figur 2. Histologisk manifestation af hæmatom. Repræsentant hematoxylin og eosin (H & E) stained coronal kryosektion (10 um) i en musehjerne, illustrerer hæmatom størrelse på 24 timer efter intrastriatal injektion af bakteriel collagenase (0,075 U). LH = venstre hjernehalvdel, RH = højre hjernehalvdel.
< img alt = "Figur 3" src = "/ files/ftp_upload/4289/4289fig3.jpg" />
Figur 3. Neurofunctional vurderinger efter eksperimentel ICH i mus. Intrastriatal injektion af autologt blod (30 pl) eller bakteriel collagenase (0,075 U) forårsagede reproducerbare neurofunctional underskud. (A) mus efter eksperimentel ICH viste signifikant mere højresving end skinopererede dyr ved 24 og 72 timer efter kirurgi. (B) forpote anbringe kapaciteten af det venstre ben var svækket efter ICH ved 24 og 72 timer efter kirurgi. Værdier blev udtrykt som gennemsnit ± SEM og analyseret med Kruskal-Wallis One vejs variansanalyse på rækker, efterfulgt af Student-Newman-Keuls metode. AP værdi på <0,05 blev betragtet som statistisk signifikant, n = 6-12 per gruppe, * P <0,05 sammenlignet med sham. Klik her for at se større figur .
igur 4 "src =" / files/ftp_upload/4289/4289fig4.jpg "/>
Figur 4. Evaluering af hjernens vandindhold efter eksperimentel ICH i mus. Intracerebral injektion af autologt blod (30 pl) eller bakteriel collagenase (0,075 U) førte til væsentlig forøgelse af hjernens vandindhold i den ipsilaterale cortex og basale ganglier ved 24 (A) og 72 timer (B) efter ICH-induktion. Værdier blev udtrykt som middelværdi ± SEM og analyseret med One Way Variansanalyse, efterfulgt af Tukey post hoc test. AP værdi på <0,05 blev betragtet som statistisk signifikant, n = 6-10 pr gruppe, * P <0,05 sammenlignet med sham. Klik her for at se større figur .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dyremodeller for intracerebral blødning (ICH) bidrager i høj grad til en avanceret forståelse af sygdommens patofysiologi, og er almindeligt anvendt til at udvikle og evaluere nye terapeutiske strategier i en præklinisk indstilling. Intraparenkymal injektioner af autologt blod eller bakteriel collagenase, er veletablerede metoder til at generere ICH hos gnavere. Begge metoder er oprindelig udviklet i rotter, men på grund af den hurtigt stigende tilgængelighed af transgene og knockout-stammer, mus blev uundværlig for yderligere at belyse mekanismer af hæmoragisk hjerneskade 8.
Hos mennesker, tegner basalganglierne blødning for ca 50% af alle blødende slagtilfælde, og patienter overlever den indledende begivenhed ofte udvikler skadelige neurofunctional underskud 1. Følgelig eksperimentel ICH hos gnavere, der involverer basalganglierne, fremkalder sensomotoriske evner i dyrets kontralaterale ekstremiteter. TilHidtil har flere adfærd vurderinger blevet udviklet til at karakterisere disse svækkelser hos mus og rotter 9,10.
I den foreliggende undersøgelse beskrev vi og evalueres en modificeret dobbelt injektion model af autologt blod 6 samt et ICH injektion model af bakteriel collagenase 7, begge målrettet basalganglierne (corpus striatum) hos mus. Vi vurderede adfærdsmæssige mangler via hjørnet turn-og forlem placere test 9,11 og observeret øget sensomotoriske svækkelser i begge modeller ved 24 og 72 timer efter operation (fig. 3). På disse tidspunkter ingen signifikante forskelle blev fundet mellem de ICH grupperne, men tidligere undersøgelser antydet en langvarig skade progression efter collagenase injektion, hvilket gør det en mere passende model for langsigtede effektstudier 5. Hjerneødem (hjerne vandindhold) blev målt ved anvendelse wet-weight/dry-weight fremgangsmåde som tidligere rapporteret 12,13.Vore resultater viste en signifikant stigning i perihematomal hjerneødem ved 24 og 72 timer efter ICH induktion (figur 4). Alle mus udsat for eksperimentel ICH eller skinkirurgi overlevede indtil dag ofrer (dødelighed = 0%).
De to beskrevne ICH modeller anvender en stereotaktisk-assisteret kirurgi til at sikre præcise og reproducerbare injektioner af enten blod eller collagenase i det målrettede hjerne-området. En lille kraniotomi (1 mm borehul) er nødvendig til dette formål. Det er vigtigt at undgå perforering af dura af borekronen, idet denne unøjagtighed vil forværre skaden og resultere i tilbagestrømning af blod eller collagenase under injektionen.
Først blev blodet injektion model udviklet som en enkelt intracerebral injektion 14, men den ofte fører til uensartet udfald på grund af tilbagestrømning af blod langs nålen kanalen 15. For at minimere denne komplikation blev en dobbelt injektion metode udviklet, Hvor en lille mængde blod injiceres lige over målrettet hjerneområde, efterfulgt af en anden injektion af blod i de basale ganglier 6. Koaguleret blod fra den første indsprøjtning, forhindrer tilbagestrømning langs nålen tarmkanalen. Denne model efterligner en hastig udvikling hæmatom, men inducerer ikke den faktiske brud på cerebrale blodkar. En stor fordel ved den autologt blod injektion model er, at ingen forstyrrende faktorer, såsom exogene proteiner, anvendes til at inducere ICH. Alternativt kan den bakterielle collagenase model efterligner en spontan intracerebrale blødning, der udvikler sig over flere timer, som udstilles i omkring 30% af alle ICH patienter fem. Bakteriel collagenase er en protease, der lyserer den ekstracellulære matrix omkring den cerebrale kapillærer og svækker dem, hvilket fartøj brud og efterfølgende blod ekstravasation 16. Denne model er almindeligt anvendt til at undersøge mekanismerne for hæmatom udvidelsen, samt at udvikle udsigtenive behandlinger, som påvirker homøostase. Imidlertid bakteriel collagenase, kan forstærke den inflammatoriske respons og præsentere neurotoksiske virkninger ved høje doser 3. Endvidere kan omfattende blødninger efter intracerebral collagenase injektion producere - i modsætning til humant ICH patologi-en iskæmisk cerebral skade.
Interessant hunmus udsat for eksperimentel ICH viste en signifikant hurtigere genopretning af neurofunctional underskud end handyr 8. Lignende resultater er blevet gjort i iskæmisk slagtilfælde modeller, således hangnavere er mere almindeligt anvendes til undersøgelser af slagtilfælde patologi og behandling evaluering 17.
I disse forsøg anvendte vi intraperitoneale co-injektioner af bedøvelsesmidler ketamin (100 mg / kg) og xylazin (10 mg / kg) for begge ICH-modeller, men har tidligere undersøgelser rapporteret forekomsten af akut hyperglykæmi hos bedøvede gnavere, begyndende inden for 20 minutter efter ketamine og xylazin injektion 18. Endvidere kan ketamin, en N-methyl-d-aspartat (NMDA) receptor antagonist, muligvis reducere NMDA receptor-afhængig excitotoksicitet, og derfor forbedre resultaterne i hjerneskade modeller. Flygtige anæstetika, såsom isofluran, der alternativt anvendes i præklinisk ICH forskning og har enestående fordele i forhold til injicerbare stoffer, herunder en hurtig ændring af anæstesidybde og korte restitutionstider 19. Den største ulempe ved gas anæstesi er behovet for omfattende udstyr (vaporizer, strømningsmåler, maske respirationskredsløb) samt muligheden for menneskelige gas eksponering. Desuden har isofluran blevet rapporteret at reducere apoptotisk celledød efter hæmorrhagisk slagtilfælde hos mus 20. Den optimale anæstesi skal tilpasses afhængigt af længden af kirurgi, dyreart eller stamme, og resultatet målinger af interesse.
Vi beskrev og viste to ICH modeller, der har UNIQUe styrker og svagheder, mens repræsenterer specifikke ICH egenskaber. Hver modeller repræsentative egenskaber der skal tages i betragtning, når de anvendes i prækliniske ICH undersøgelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev delvist støttet af NIH tilskud RO1NS053407 til JH Zhang. Vi vil gerne takke hr. Damon Klebe for hans værdifulde bidrag.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereotactic Head Frame | Stoelting Co. | 51600 | |
| Nanomite Syringe Pump | Harvard Apparatus | PY2 70-2217 | |
| Hamilton Syringe | Hamilton Company | 1725RN (250 μl) 1701 RN (10 μl) |
26 Gauge needle for 250 μl and 10 μl syringes. |
| Microdrill | Fine Science Tools | 18000-17 | |
| Microdrill burr | Fine Science Tools | 19007-09 | 0.9 mm diameter |
| Collagenase Type VII-S | Sigma-Aldrich | C2399 | |
| Microhematocrit Capillary Tubes | Fisher Scientific | 22-362-574 | unheparinized |
| Bone Wax | Ethicon | W31 | |
| Suture | Ethicon | 1676G | |
| Ketamine | JHP Pharmaceuticals | 42023-115-10 | Ketalar |
| Xylazine | LLOYD Laboratories | 139-236 | AnaSed |
References
- Broderick, J. P. Guidelines for the management of spontaneous intracerebral hemorrhage: A statement for healthcare professionals from a special writing group of the Stroke Council, American Heart Association. Stroke. 30, 905-915 (1999).
- Qureshi, A. I., Mendelow, A. D., Hanley, D. F. Intracerebral haemorrhage. Lancet. 373, 1632-1644 (2009).
- MacLellan, C. L., Silasi, G., Auriat, A. M., Colbourne, F. Rodent models of intracerebral hemorrhage. Stroke. 41, 95-98 (2010).
- James, M. L., Warner, D. S., Laskowitz, D. T. Preclinical models of intracerebral hemorrhage: a translational perspective. Neurocrit Care. 9, 139-152 (2008).
- MacLellan, C. L. Intracerebral hemorrhage models in rat: comparing collagenase to blood infusion. J. Cereb. Blood Flow Metab. 28, 516-525 (2008).
- Belayev, L. Experimental intracerebral hemorrhage in the mouse: histological, behavioral, and hemodynamic characterization of a double-injection model. Stroke. 34, 2221-2227 (2003).
- Clark, W., Gunion-Rinker, L., Lessov, N., Hazel, K. Citicoline treatment for experimental intracerebral hemorrhage in mice. Stroke. 29, 2136-2140 (1998).
- Nakamura, T. Intracerebral hemorrhage in mice: model characterization and application for genetically modified mice. J. Cereb. Blood Flow Metab. 24, 487-494 (2004).
- Schallert, T. Behavioral tests for preclinical intervention assessment. NeuroRx. 3, 497-504 (2006).
- Hartman, R., Lekic, T., Rojas, H., Tang, J., Zhang, J. H. Assessing functional outcomes following intracerebral hemorrhage in rats. Brain Res. 1280, 148-157 (2009).
- Hua, Y. Behavioral tests after intracerebral hemorrhage in the rat. Stroke. 33, 2478-2484 (2002).
- Tang, J. Mmp-9 deficiency enhances collagenase-induced intracerebral hemorrhage and brain injury in mutant mice. J. Cereb. Blood Flow Metab. 24, 1133-1145 (2004).
- Ma, Q. Vascular adhesion protein-1 inhibition provides antiinflammatory protection after an intracerebral hemorrhagic stroke in mice. J. Cereb. Blood Flow Metab. , (2010).
- Bullock, R., Mendelow, A. D., Teasdale, G. M., Graham, D. I. Intracranial haemorrhage induced at arterial pressure in the rat. Part 1: Description of technique, ICP changes and neuropathological findings. Neurol Res. 6, 184-188 (1984).
- Yang, G. Y., Betz, A. L., Chenevert, T. L., Brunberg, J. A., Hoff, J. T. Experimental intracerebral hemorrhage: relationship between brain edema, blood flow, and blood-brain barrier permeability in rats. J. Neurosurg. 81, 93-102 (1994).
- Rosenberg, G. A., Mun-Bryce, S., Wesley, M., Kornfeld, M. Collagenase-induced intracerebral hemorrhage in rats. Stroke. 21, 801-807 (1990).
- Alkayed, N. J. Gender-linked brain injury in experimental stroke. Stroke. 29, 159-165 (1998).
- Saha, J. K., Xia, J., Grondin, J. M., Engle, S. K., Jakubowski, J. A. Acute hyperglycemia induced by ketamine/xylazine anesthesia in rats: mechanisms and implications for preclinical models. Exp Biol Med. (Maywood). 230, 777-784 (2005).
- Fujiwara, N. Effect of normobaric oxygen therapy in a rat model of intracerebral hemorrhage. Stroke. 42, 1469-1472 (2011).
- Khatibi, N. H. Isoflurane posttreatment reduces brain injury after an intracerebral hemorrhagic stroke in mice. Anesth Analg. 113, 343-348 (2011).
