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Medicine

Modellazione emorragia intracerebrale in Mouse: iniezione di sangue autologo o collagenasi batterica

Published: September 22, 2012 doi: 10.3791/4289
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1, 1,3,4
1Department of Physiology and Pharmacology, Loma Linda University School of Medicine, 2College of Natural and Agricultural Sciences, University of California, Riverside, 3Department of Anesthesiology, Loma Linda University School of Medicine, 4Department of Neurosurgery, Loma Linda University School of Medicine

Summary

Modelli animali clinicamente rilevanti di emorragia intracerebrale (ICH) sono necessari per ampliare la nostra conoscenza di ictus emorragico e di esaminare nuove strategie terapeutiche. In questo studio, abbiamo descrivere e valutare due modelli ICH che implementano iniezioni unilaterali di ciascuna sangue autologo intero o collagenasi batterica nel gangli della base (corpo striato) di topi.

Abstract

Spontanea emorragia intracerebrale (ICH) definisce una malattia potenzialmente pericolosa per la vita neurologica che rappresenta il 10-15% di tutti i ricoveri legati a ictus e per i quali non sono disponibili trattamenti efficaci ad oggi 1,2. A causa della eterogeneità delle ICH negli esseri umani, diversi modelli preclinici sono necessari per esplorare a fondo i potenziali strategie terapeutiche 3. ICH sperimentale è comunemente indotta in roditori da iniezione intraparenchimale sia di sangue autologo o collagenasi batterica 4. Il modello appropriato viene selezionato in base alla fisiopatologia di induzione emorragie e lesioni progressione. Il modello di iniezione sangue imita una emorragia rapida progressione. In alternativa, collagenasi batterica enzimaticamente sconvolge la lamina basale dei capillari cerebrali, causando un sanguinamento attivo che si evolve in genere per diverse ore 5. Risultante edema perihematomal e deficit neurofunzionali possono essere quantificati from entrambi i modelli. In questo studio abbiamo descritto e valutato un modello modificato doppia iniezione di sangue intero autologo 6 così come un modello ICH iniezione di collagenasi batterica 7, entrambi bersaglio gangli della base (corpo striato) di maschi topi CD-1. Abbiamo valutato deficit neurofunzionali ed edema cerebrale a 24 e 72 ore dopo l'induzione ICH. Intrastriatal iniezione di sangue autologo (30 microlitri) o collagenasi batterica (0.075U) causata riproducibili deficit neurofunzionali in topi e edema cerebrale significativamente aumentata a 24 e 72 ore dopo l'intervento (p <0,05). In conclusione, entrambi i modelli producono consistenti infarti emorragici e rappresentano metodi di base per la ricerca preclinica ICH.

Protocol

Tutte le procedure sono state effettuate in conformità con la Guida NIH per la cura ed uso di animali da laboratorio e approvato dalla cura degli animali e del Comitato uso della Loma Linda University.

1. Preparazioni prechirurgica

Tecniche asettiche sono raccomandati per tutte le procedure chirurgiche. Disinfettare l'apparato stereotassico e preparare sterili strumenti chirurgici prima dell'intervento. Indossare dispositivi di protezione individuale (DPI) durante tutto il trattamento degli animali. Utilizzare una piastra elettrica durante l'intervento chirurgico per mantenere la temperatura fisiologica del corpo dell'animale.

  1. Pesare il 8-12 vecchio mouse settimana utilizzando una tripla scala animale fascio.
  2. Co-iniezione di ketamina (100 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg) per via intraperitoneale quindi consentire 7-10 minuti per l'anestesia abbia effetto (monitor per un sedazione adeguata).
  3. Posizionare il mouse su una coperta termica e radersi il cuoio capelluto.
  4. Applicare una pomata oftalmica a entrambi gli occhi.
  5. Fissare ilvie aeree, delicatamente muovere la lingua lateralmente, e con attenzione fissare la testa del mouse sul dispositivo stereotassico. Nota: La testa deve essere fissato orizzontalmente alla base del telaio stereotassico.
  6. Disinfettare l'area chirurgica con Betadine, e risciacquare con etanolo al 70%. Ripetere alternando applicazioni di Betadine e etanolo al 70% per un totale di tre volte. Punte di cotone può essere utilizzato per questo scopo.

2. Sangue iniezione Modello

  1. Fai un cm 1 lunga incisione mediana del cuoio capelluto con una lama di bisturi # 10.
  2. Utilizzare punte di cotone per rimuovere il tessuto molle che copre il cranio, in modo da esporre il punto di intersezione perpendicolare della sutura coronale e sagittale (bregma).
  3. Montare la siringa Hamilton (250 microlitri) sulla pompa di iniezione, e stereotaxically dirigere l'ago (26 Gauge) sopra bregma.
  4. Quindi, regolare i bracci manipolatori stereotassica per posizionare l'ago di 0,2 millimetri anteriore e 2millimetri lateralmente a destra. A queste coordinate fare un piccolo foro cranica bave, utilizzando un trapano a velocità variabile, con una punta da 1 mm.
  5. Sospendere coda dell'animale e disinfettare la superficie inferiore con etanolo 70%.
  6. Puntura l'arteria centrale della coda con un ago sterile (ad esempio, 26 Gauge) e raccogliere il sangue arterioso in un tubo capillare unheparinized.
  7. Trasferire il sangue rapidamente dal tubo capillare nel cilindro in vetro della siringa Hamilton, quindi inserire il pistone.
  8. Ricollegare il 30 microlitri ora o più di sangue arterioso contenente una siringa Hamilton sulla pompa di iniezione e inserire l'ago (con il bordo smussato rivolto verso la sutura sagittale) attraverso il foro cranico solo fino alla sua smussatura non è più visibile.
  9. Da questo punto anticipo l'ago 3 millimetri ventralmente e iniettare 5 ml di sangue autologo ad una velocità di 2 ml / min.
  10. Dopo il completamento della prima iniezione anticipo l'ago di 0,7 millimetri ulteriormente in profondità.
  11. Attendere5 min quindi iniettare 25 pl di sangue nello striato destro.
  12. Al termine della seconda iniezione, lasciare l'ago in posizione per altri 10 minuti, prima di prelevare ad un tasso di 1 mm / min.
  13. Sigillare il foro cranico con cera ossea e suturare la pelle.
  14. Per l'analgesia postoperatoria iniettare 0,05 mg / kg di buprenorfina per via sottocutanea in pre-riscaldate liquidi (soluzione fisiologica).

3. Collagenasi iniezione Modello

  1. Dopo i preparativi preoperatori, ripetere i passaggi 1-4 come descritto per il modello iniezione sangue.
  2. Riempire la siringa Hamilton (10 pl) con 0.075U di batteri (clostridi) collagenasi VII-S disciolti in 0,5 ml di soluzione fisiologica. Evitare la formazione di bolle d'aria.
  3. Ricollegare la siringa Hamilton sulla pompa di iniezione e inserire l'ago (26 Gauge), attraverso il foro cranico solo fino alla sua smussatura non è più visibile.
  4. Far avanzare il 3,7 millimetri ago ventralmente e iniettare il 0.075U di collagenasi into striato destra ad una velocità di 2 ml / min.
  5. Al termine dell'iniezione, lasciare l'ago in posizione per altri 10 minuti, prima di prelevare ad un tasso di 1 mm / min.
  6. Sigillare il foro cranico con cera ossea e suturare la pelle.
  7. Iniettare 0,05 mg / kg di buprenorfina per via sottocutanea in preriscaldate postoperatorie fluidi.

4. Sham Funzionamento

  1. Dopo i preparativi preoperatori, ripetere i passaggi 1-4 come descritto per il modello iniezione sangue.
  2. Inserire il (26 Gauge) ago 3,7 millimetri ventralmente attraverso il foro cranico. L'ago deve rimanere in posizione per 10 min prima di essere ritirato ad una velocità di 1 mm / min.
  3. Sigillare il foro cranico con cera ossea e suturare la pelle.
  4. Iniettare 0,05 mg / kg di buprenorfina per via sottocutanea in preriscaldate postoperatorie fluidi.

5. Risultati rappresentativi

Sperimentale emorragia intrastriatal evoca morfologicocosì come cambiamenti comportamentali nei roditori. Queste modifiche possono essere valutati per garantire una adeguata esecuzione della procedura, o per studiare gli effetti di possibili trattamenti. Generazione di spurgo in una zona del cervello mirata (ad esempio nuclei della base) è più essenziale per un approccio riproducibile, e può essere verificata su sezioni di cervello lordi o istologicamente tinto (Figura 1-2). Lesioni ai risultati dei gangli della base in deficit sensomotori, che possono essere quantificati attraverso varie valutazioni comportamentali. Risultati della prova turn angolo mostrato che, dopo sperimentale lato destro ICH, topi trasformato significativamente più spesso ipsilaterale e dalla ridotta controlaterale (sinistro), di animali sham operati a 24 e 72 ore dopo l'intervento (Figura 3). Inoltre, la possibilità di posizionare adeguatamente la compromissione (sinistra) forelimb su una superficie, dopo stimolazione vibrisse, è stata valutata mediante il test forelimb immissione. A 24 e 72 ore dopo l'intervento, i topi subproiettate a destra lato ICH ha mostrato un numero significativamente inferiore di posizionamenti animali finti operati. Misura di edema cerebrale è spesso impiegato per quantificare l'entità del danno cerebrale dopo ICH sperimentale. Iniezioni intracerebrali di sangue autologo (30 microlitri) o collagenasi batterica (0,075 U) ha portato ad un notevole aumento del contenuto di acqua nel cervello corteccia ipsilaterale e gangli basali a 24 (Figura 4 A) e 72 ore (Figura 4 B) dopo l'intervento ( rispetto alla sham). Il risultato delle prove di comportamento (Figura 3) e il grado di edema cerebrale (Figura 4) ha mostrato alcuna differenza tra il sangue e modelli iniezione collagenasi in volumi dati.

Figura 1
Figura 1. ICH modellazione nei topi. (A) Lo schema semplificato di una sezione coronale cervello 0,2 millimetri anteriore bregma illustra la proposed posizione di sangue autologo o iniezione collagenasi. Il ventricolo laterale è segnato LV. CPu sta per caudato-putamen, una parte del corpo striato, e GP identifica il globo pallido. Entrambi, il corpo striato e il globo pallido appartiene ad un gruppo di sub-corticale nuclei, noto anche come gangli basali. (B) microfotografia Rappresentante di una sezione del cervello coronale anteriore 0,2 millimetri di bregma, ottenuto a 24 ore dopo l'iniezione di sangue autologo intrastriatal sangue intero.

Figura 2
Figura 2. Manifestazione istologica dell'ematoma. Rappresentante ematossilina ed eosina (H & E) tinto cryosection coronale (10 micron) di un cervello di topo, illustrando dimensione ematoma a 24 ore dopo l'iniezione di collagenasi batterica intrastriatal (0,075 U). LH = emisfero sinistro, RH = emisfero destro.

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Figura 3. Valutazioni neurofunzionali seguenti ICH sperimentale nei topi. Intrastriatal iniezione di sangue autologo (30 pl) o collagenasi batterica (0,075 U) causato riproducibili deficit neurofunzionali. (A) I topi dopo ICH sperimentale ha mostrato curve molto più a destra di quelle degli animali finti operati a 24 e 72 ore dopo l'intervento chirurgico. (B) capacità zampa anteriore ponendo l'arto sinistro è stato alterato dopo la ICH a 24 e 72 ore dopo l'intervento chirurgico. I valori sono espressi come media ± SEM e analizzati con Kruskal-Wallis Una analisi della varianza su ranghi, seguita dalla Student-Newman-Keuls Method. Un valore di p <0.05 è stato considerato statisticamente significativo; n = 6-12 per gruppo, * P <0.05 rispetto al sham. Clicca qui per ingrandire la figura .

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Figura 4. Valutazione del contenuto di acqua in seguito ICH cerebrale sperimentale nei topi. Iniezione intracerebrale di sangue autologo (30 microlitri) o collagenasi batterica (0,075 U) ha portato ad un significativo aumento del contenuto di acqua nel cervello corteccia ipsilaterale e gangli basali a 24 (A) e 72 hr (B) dopo ICH-induzione. I valori sono espressi come media ± SEM ed analizzate con una analisi della varianza, seguita da test di Tukey post hoc. Un valore di p <0.05 è stato considerato statisticamente significativo; n = 6-10 per gruppo, * P <0.05 rispetto al sham. Clicca qui per ingrandire la figura .

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Discussion

Modelli animali di emorragia intracerebrale (ICH) contribuiscono notevolmente a una conoscenza avanzata della fisiopatologia della malattia, e sono comunemente utilizzati per sviluppare e valutare nuove strategie terapeutiche in un ambiente preclinica. Iniezioni intraparenchimali di sangue autologo o collagenasi batterica sono consolidati metodi per generare ICH nei roditori. Entrambi i metodi sono stati sviluppati inizialmente nel ratto, tuttavia, a causa della disponibilità rapida crescita di ceppi transgenici e knockout, topi divenne indispensabile per chiarire ulteriormente i meccanismi di danno cerebrale emorragico 8.

Negli esseri umani, l'emorragia dei gangli della base rappresenta circa il 50% di tutti gli ictus emorragici, e pazienti che sopravvivono l'evento iniziale sviluppano frequentemente deleteri deficit neurofunzionali 1. Di conseguenza, ICH sperimentale nei roditori, coinvolgendo i gangli della base, evoca deficit sensomotori nella estremità controlaterali dell'animale. Adata, la valutazione del comportamento sono stati sviluppati diversi per caratterizzare tali menomazioni in topi e ratti 9,10.

Nel presente studio, abbiamo descritto e valutato un modello modificato doppia iniezione di sangue intero autologo 6 così come un modello ICH iniezione di collagenasi batterica 7, sia il targeting i gangli della base (corpo striato) nei topi. Abbiamo valutato deficit comportamentali tramite il turn angolo e forelimb immissione prova 9,11 e osservato un aumento sensorimotorio deficit in entrambi i modelli a 24 e 72 ore dopo l'intervento (Figura 3). In questi tempi fa nessuna differenza significativa è stata trovata tra i gruppi ICH, tuttavia, studi precedenti suggerito una progressione lungo infortunio dopo l'iniezione di collagenasi, che lo rende un modello più adatto per studi a lungo termine risultati 5. Edema cerebrale (contenuto d'acqua del cervello) è stata valutata con il metodo wet-weight/dry-weight come precedentemente riportato 12,13.I nostri risultati hanno mostrato un aumento significativo edema cerebrale perihematomal a 24 e 72 ore dopo l'induzione ICH (Figura 4). Tutti i topi sottoposti a un intervento chirurgico sperimentale ICH o sham sopravvisse fino al giorno del sacrificio (mortalità = 0%).

I due modelli descritti ICH impiegano un stereotassica chirurgia assistita per assicurare iniezioni precisi e riproducibili di sangue o collagenasi nell'area mirata cervello. Una piccola craniotomia (1 mm foro cranico) è necessario per questo scopo. È essenziale evitare la perforazione della dura dalla punta, poiché questa imprecisione aggravare il pregiudizio e risultato in riflusso di sangue o collagenasi durante l'iniezione.

Inizialmente, il modello di iniezione sangue è stato sviluppato come una singola iniezione intracerebrale 14, ma è spesso prodotto risultati inconsistenti a causa di riflusso di sangue lungo il tratto dell'ago 15. Per minimizzare questa complicazione, un metodo di doppia iniezione è stato sviluppato, In cui una piccola quantità di sangue viene iniettato proprio sopra l'area del cervello mirata, seguita da una seconda iniezione di sangue in gangli della base 6. Sangue coagulato della prima iniezione, impediscono il ritorno lungo il tratto dell'ago. Questo modello imita un ematoma rapido sviluppo, ma non induce la rottura effettiva dei vasi sanguigni cerebrali. Un importante vantaggio del modello autologo iniezione sangue è che nessun fattore di confondimento, come proteine ​​esogene, sono utilizzati per indurre ICH. In alternativa, il modello di collagenasi batterica mima una emorragia intracerebrale spontanea che si sviluppa per diverse ore, come esposti in circa il 30% di tutti i pazienti ICH 5. Collagenasi batterica è una proteasi che lisa la matrice extracellulare attorno al capillari cerebrali e indebolisce, provocando la rottura del vaso sanguigno e conseguente stravaso 16. Questo modello è generalmente utilizzato per studiare i meccanismi di allargamento ematoma e sviluppare prospettivatrattamenti ive che influenzano l'omeostasi. Tuttavia, collagenasi batterica, può amplificare la risposta infiammatoria e presentano effetti neurotossici a dosi elevate 3. Inoltre, sanguina estese dopo l'iniezione intracerebrale collagenasi può produrre - a differenza di patologia umana ICH-una lesione ischemica cerebrale.

È interessante notare che, topi femmina sottoposti a ICH sperimentale ha mostrato un recupero molto più veloce di deficit neurofunzionali di maschi 8. Risultati simili sono stati realizzati in modelli ictus ischemico, così roditori maschi sono più comunemente implementato per gli studi di ictus patologia e valutazione del trattamento 17.

In questi esperimenti abbiamo utilizzato co-iniezione intraperitoneale di ketamina anestetici (100 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg) per entrambi i modelli ICH, tuttavia, studi precedenti hanno riportato l'incidenza di iperglicemia acuta nei roditori anestetizzati, iniziando entro 20 minuti dopo ketamine e xilazina iniezione 18. Inoltre, ketamina, un N-metil d-aspartato (NMDA) antagonista del recettore NMDA può eventualmente ridurre recettore-dipendente eccitotossicità, e quindi migliorare i risultati in modelli lesioni cerebrali. Anestetici volatili, come ad esempio l'isoflurano, vengono alternativamente utilizzati in ricerca preclinica ICH e mantenere vantaggi unici rispetto ad altri agenti iniettabili, tra cui l'alterazione rapida della profondità dell'anestesia e ridotti tempi di ripristino 19. Il principale svantaggio di anestesia gas è la necessità di attrezzature elaborato (vaporizzatore, flussometro, circuito di respirazione maschera), nonché la possibilità di esposizione gas umana. Inoltre, isoflurano è stato segnalato per ridurre la morte cellulare apoptotica dopo ictus emorragico nei topi 20. L'anestesia ottimale deve essere adattato in relazione alla durata della chirurgia, specie animali o ceppo, e sulle misurazioni esito di interesse.

Abbiamo descritto e dimostrato due modelli ICH che hanno uniqupunti di forza e di debolezza, posta, rappresentando ICH proprietà specifiche. Caratteristiche rappresentative Ogni modelle devono essere presi in considerazione, se usato in preclinici indagini ICH.

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Disclosures

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Acknowledgments

Questo studio è stato in parte sostenuto da NIH sovvenzione RO1NS053407 a JH Zhang. Vorremmo ringraziare il signor Damon Klebe per i suoi preziosi contributi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stereotactic Head Frame Stoelting Co. 51600
Nanomite Syringe Pump Harvard Apparatus PY2 70-2217
Hamilton Syringe Hamilton Company 1725RN (250 μl)
1701 RN (10 μl)		 26 Gauge needle for 250 μl and 10 μl syringes.
Microdrill Fine Science Tools 18000-17
Microdrill burr Fine Science Tools 19007-09 0.9 mm diameter
Collagenase Type VII-S Sigma-Aldrich C2399
Microhematocrit Capillary Tubes Fisher Scientific 22-362-574 unheparinized
Bone Wax Ethicon W31
Suture Ethicon 1676G
Ketamine JHP Pharmaceuticals 42023-115-10 Ketalar
Xylazine LLOYD Laboratories 139-236 AnaSed

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References

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