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Medicine

Hemorragia modelagem intracerebral em camundongos: Injeção de sangue autólogo ou colagenase bacteriana

Published: September 22, 2012 doi: 10.3791/4289

Summary

Modelos animais clinicamente relevantes de hemorragia intracerebral (ICH) são necessários para ampliar nosso conhecimento sobre AVC hemorrágico e para analisar novas estratégias terapêuticas. Neste estudo, descrever e avaliar dois modelos ICH que implementam injeções unilaterais de tanto sangue autólogo todo ou colagenase bacteriana no gânglio basal (corpo estriado) de camundongos.

Abstract

Hemorragia intracerebral espontânea (ICH) define uma doença potencialmente fatal neurológica que responde por 10-15% de todas as internações relacionados ao AVC e para os quais não há tratamentos eficazes estão disponíveis até o momento 1,2. Devido à heterogeneidade do ICH em humanos, vários modelos pré-clínicos são necessários para explorar completamente possíveis estratégias terapêuticas 3. ICH experimental é geralmente induzida em roedores, por injecção ou intraparenquimatosa de sangue autólogo ou colagenase bacteriana 4. O modelo adequado é selecionado com base na fisiopatologia da indução hemorragia e progressão das lesões. O modelo de injeção de sangue imita uma hemorragia evoluindo rapidamente. Alternativamente, a colagenase bacteriana enzimaticamente interrompe a lâmina basal do cérebro capilares, causando uma hemorragia activa, que geralmente se desenvolve ao longo de várias horas 5. Perihematomal edema resultante e déficits neurofuncionais pode ser quantificado from ambos os modelos. Neste estudo, foram descritos e avaliados de um modelo modificado de injecção dupla de sangue total autólogo 6, bem como um modelo de injecção de ICH de colagenase bacteriana 7, ambas as quais alvo os gânglios basais (corpo estriado) do sexo masculino ratinhos CD-1. Foram avaliados os déficits neurofuncionais e edema cerebral em 24 e 72 horas após a indução ICH. Injecção intraestrial de sangue autólogo (30 uL) ou colagenase bacteriana (0.075U) causada reprodutíveis défices neurofuncionais em camundongos e edema cerebral significativamente aumentados em 24 e 72 horas após a cirurgia (p <0,05). Em conclusão, ambos os modelos consistentes produzir infartos hemorrágicos e representam métodos básicos para a pesquisa pré-clínica ICH.

Protocol

Todos os procedimentos foram realizados de acordo com o Guia de NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e aprovado pelo Comitê Animal Care e Uso da Universidade Loma Linda.

1. Preparação pré-cirúrgica

Técnicas assépticas são recomendados para todos os procedimentos cirúrgicos. Desinfectar o aparelho estereotáxico e preparar instrumentos cirúrgicos estéreis antes da cirurgia. Usar equipamento de proteção individual (EPI), durante todo o tratamento animal. Use uma almofada de aquecimento durante a cirurgia para manter a temperatura corporal do animal fisiológico.

  1. Pesar o mouse semana 8-12 de idade usando uma escala animal triplo feixe.
  2. Co-injecção de cetamina (100 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg) por via intraperitoneal, em seguida, permitir que 7-10 minutos para a anestesia tenha efeito (monitor para uma sedação adequada).
  3. Posicione o mouse sobre um cobertor térmico e raspar o couro cabeludo.
  4. Aplicar pomada oftálmica para ambos os olhos.
  5. Fixe avias aéreas, delicadamente movendo a língua lateralmente, e cuidadosamente assegurar a cabeça do rato sobre o aparelho estereotáxica. Nota: A cabeça tem de ser fixada na horizontal para a base da armação estereotáxica.
  6. Desinfetar a área cirúrgica com Betadine, e enxágüe com etanol 70%. Repita alternando aplicações de Betadine e etanol a 70% para um total de três vezes. Aplicadores com ponta de algodão podem ser utilizados para esta finalidade.

2. Modelo de injeção de sangue

  1. Faça um 1 centímetro longa incisão na linha média do couro cabeludo com uma lâmina de bisturi n º 10.
  2. Usar aplicadores com ponta de algodão para limpar o tecido mole que cobre o crânio, a fim de expor o ponto de intersecção perpendicular da sutura sagital e coronal (bregma).
  3. Montar a seringa de Hamilton (250 ul) para a bomba de injecção, e estereotaxicamente dirigir a agulha (26 Gauge) durante bregma.
  4. Em seguida, ajuste os braços mecânicos estereotáxicas para posicionar a agulha 0,2 milímetros anterior e 2mm lateralmente para a direita. A estas coordenadas fazer um pequeno orifício de trepanação craniana, usando uma broca de velocidade variável com uma broca de 1 mm.
  5. Suspender a cauda do animal e desinfectar a sua superfície inferior, com etanol a 70%.
  6. A punção da artéria cauda central com uma agulha estéril (por exemplo 26 Gauge) e recolher o sangue arterial para um tubo capilar unheparinized.
  7. Transferir o sangue rapidamente a partir do tubo capilar de vidro para dentro do tambor da seringa de Hamilton, em seguida, inserir o êmbolo.
  8. Recoloque o ul agora 30 ou mais de sangue arterial contendo seringa de Hamilton para a bomba de injeção e inserir a agulha (com sua borda chanfrada de frente para a sutura sagital) através do orifício de trepanação apenas até seu bisel não é mais visível.
  9. A partir deste ponto, o avanço da agulha 3 milímetros ventralmente e injectar 5 ul de sangue autólogo, a uma taxa de 2 ul / min.
  10. Depois de completada a primeira injecção previamente a agulha 0,7 milímetro mais em profundidade.
  11. Esperar5 min, em seguida, injectar 25 jil de sangue para o corpo estriado direito.
  12. Após a conclusão da segunda injecção, deixando a agulha em posição por mais 10 min, antes de retirar-lo a uma velocidade de 1 mm / min.
  13. Selar o furo da rebarba com cera de osso e sutura da pele.
  14. Para analgesia injectar 0,05 mg / kg de buprenorfina por via subcutânea, em pré-aquecidos fluidos (soro fisiológico normal).

3. Colagenase modelo de injeção

  1. Seguindo a preparação pré-cirúrgicas, repetir os passos 1-4, como descrito para o modelo de injecção de sangue.
  2. Encher a seringa de Hamilton (10 ul) com 0.075U de bactérias (Clostridium) colagenase VII-S dissolvidos em 0,5 uL de uma solução salina. Evitar a formação de bolhas de ar.
  3. Volte a colocar a seringa de Hamilton para a bomba de injeção e inserir a agulha (26 Gauge), através do orifício de trepanação apenas até seu bisel não é mais visível.
  4. Avançar a agulha 3,7 milímetros ventralmente e injetar o 0.075U de colagenase into striatum a direita a uma taxa de 2 ul / min.
  5. Após a conclusão da injecção, deixando a agulha em posição por mais 10 min, antes de retirar-lo a uma velocidade de 1 mm / min.
  6. Selar o furo da rebarba com cera de osso e sutura da pele.
  7. Injectar de 0,05 mg / kg de buprenorfina por via subcutânea, em pré-aquecidos no pós-operatório fluidos.

4. Operação Sham

  1. Seguindo a preparação pré-cirúrgicas, repetir os passos 1-4, como descrito para o modelo de injecção de sangue.
  2. Inserir a agulha (26 Gauge) 3,7 milímetros ventralmente através do orifício de trepanação. A agulha deve permanecer em posição durante 10 minutos, antes de ser retirada a uma taxa de 1 mm / min.
  3. Selar o furo da rebarba com cera de osso e sutura da pele.
  4. Injectar de 0,05 mg / kg de buprenorfina por via subcutânea, em pré-aquecidos no pós-operatório fluidos.

5. Resultados representativos

Hemorragia intraestriatal Experimental evoca morfológicabem como alterações comportamentais em roedores. Estas mudanças podem ser avaliados para assegurar uma execução adequada do processo, ou para investigar os efeitos de tratamentos potenciais. Gerando o sangramento em uma área do cérebro alvo (gânglios basais, por exemplo) é mais essencial para uma abordagem reprodutível, e pode ser verificado em seções cerebrais graves ou histologicamente coradas (Figura 1-2). Prejuízo para os resultados dos gânglios da base em alterações sensório-motoras, que podem ser quantificados por meio de várias avaliações comportamentais. Os resultados do teste mostraram que a curva de canto, após HIC do lado direito experimental, os ratos virou uma frequência significativamente superior ipsilateralmente e longe do prejudicada lado (esquerdo) contralateral, com operação simulada do que os animais às 24 e 72 horas após a cirurgia (Figura 3 A). Além disso, a capacidade para colocar adequadamente a prejudicada (esquerda) forelimb numa superfície, após a estimulação das vibrissas, foi avaliada através do teste do membro anterior de colocação. Às 24 e 72 horas após a cirurgia, ratos submetido a do lado direito ICH mostrou colocações significativamente menos do que os animais operação simulada. Medição do edema cerebral é frequentemente empregue para quantificar a extensão da lesão cerebral após hemorragia intracraniana experimental. Injecções intracerebrais de sangue autólogo (30 uL) ou colagenase bacteriana (0,075 U), levou a um aumento significativo do teor de água no córtex ipsilateral e gânglios basais a 24 (Figura 4 A) e 72 h (Figura 4 B) após a cirurgia ( em comparação com placebo). O resultado dos testes de comportamento (Figura 3) e da extensão do edema cerebral (Figura 4) não mostrou qualquer diferença entre o sangue e os modelos de injecção de colagenase em volumes indicados.

Figura 1
Figura 1. ICH modelagem em ratinhos. (A) O esquema simplificado de uma secção coronal do cérebro anterior de 0,2 milímetros bregma ilustra o proposed localização de sangue autólogo ou injecção colagenase. O ventrículo lateral é marcada LV. CPu significa caudado-putamen, uma parte do corpo estriado, e GP identifica o globus pallidus. Ambos, o striatum, bem como o globo pálido pertencem a um grupo de sub-cortical núcleos, também conhecida como gânglios basais. (B) fotomicrografia representativas de uma secção coronal do cérebro anterior de 0,2 milímetros bregma, obtidos às 24 h após a injecção intraestrial de sangue total autólogo.

Figura 2
Figura 2. Manifestação histológica do hematoma. Representante hematoxilina e eosina (H & E) criocorte coronal corada (10 mm) de um cérebro de rato, ilustrando tamanho hematoma às 24 h após a injecção intraestrial de colagenase bacteriana (0.075 U). LH = hemisfério esquerdo, RH = hemisfério direito.

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Figura 3. Avaliações neurofuncionais seguintes ICH experimental em ratos. Injecção intraestrial de sangue autólogo (30 uL) ou colagenase bacteriana (0.075 U), causada reprodutíveis défices neurofuncionais. (A) ratos após ICH experimental mostrou espiras significativamente mais direitas do que os animais sham operados a 24 e 72 horas após a cirurgia. (B) A capacidade de colocação das patas dianteiras do membro esquerdo foi alterado após ICH em 24 e 72 horas após a cirurgia. Os valores foram expressos como média ± EPM e analisados ​​com o teste de Kruskal-Wallis análise de variância de sentido único em Ranks, seguido do método de Student-Newman-Keuls. Um valor de p <0,05 foi considerado estatisticamente significativo, n = 6-12 por grupo, * P <0,05 em relação ao placebo. Clique aqui para ver maior figura .

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Figura 4. Avaliação do conteúdo de água do cérebro após ICH experimental em ratos. Injecção intracerebral de sangue autólogo (30 uL) ou colagenase bacteriana (0.075 U) conduziu a um aumento significativo do teor de água no córtex ipsilateral e gânglios basais de 24 (A) e 72 horas (B) depois de ICH-indução. Os valores foram expressos como média ± EPM e analisados ​​com uma análise de variância, seguido pelo teste de Tukey post hoc. Um valor de p <0,05 foi considerado estatisticamente significativo, n = 6-10 por grupo, * P <0,05 em relação ao placebo. Clique aqui para ver maior figura .

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Discussion

Modelos animais de hemorragia intracerebral (ICH) contribuem grandemente para um entendimento avançado da fisiopatologia da doença, e são comumente usados ​​para desenvolver e avaliar novas estratégias terapêuticas em um ambiente pré-clínica. Intraparenquimatosos injecções de sangue autólogo ou colagenase bacteriana são bem estabelecidos métodos para a geração de ICH em roedores. Ambos os métodos foram desenvolvidos inicialmente no rato, no entanto, devido à disponibilidade crescente de estirpes transgénicas e knockout, ratos tornou-se indispensável para elucidar os mecanismos de lesão cerebral hemorrágico 8.

Nos seres humanos, a hemorragia dos gânglios da base é responsável por aproximadamente 50% de todos os acidentes vasculares cerebrais hemorrágicos, e os pacientes que sobrevivem ao evento inicial frequentemente desenvolvem deletérios défices neurofuncionais 1. Por conseguinte, ICH experimental em roedores, que envolve o gânglio basal, evoca alterações sensório-motoras em extremidades contralaterais do animal. Paradata, as avaliações de comportamento foram desenvolvidos diversos para caracterizar aqueles prejuízos em camundongos e ratos 9,10.

No presente estudo, nós descrevemos e avaliadas num modelo de injecção dupla modificados de sangue total autólogo 6, bem como um modelo de injecção de ICH de colagenase bacteriana 7, tanto a segmentação dos gânglios da base (corpo estriado) nos ratinhos. Foram avaliados os déficits comportamentais através do canto e por sua vez, membros anteriores colocando teste e 9,11 observada aumentou sensório deficiências em ambos os modelos, a 24 e 72 horas após a cirurgia (Figura 3). Nessas tempo aponta nenhuma diferença significativa foi encontrada entre os grupos do ICH, no entanto, estudos anteriores sugeriram uma progressão lesão prolongada após a injeção de colagenase, tornando-o um modelo mais adequado para estudos de longo prazo resultado 5. Edema cerebral (teor em água do cérebro) foi medida utilizando o método de wet-weight/dry-weight conforme relatado anteriormente 12,13.Os nossos resultados mostraram um aumento significativo no edema cerebral perihematomal às 24 e 72 h após a indução da ICH (Figura 4). Todos os ratos submetidos a ICH experimental ou cirurgia sham sobreviveram até ao dia do sacrifício (= mortalidade de 0%).

Os dois modelos descritos ICH empregar uma cirurgia estereotaxicamente assistida para assegurar injecções precisos e reprodutíveis do sangue ou da colagenase para a área do cérebro alvo. Uma craniotomia pequeno (1 mm orifício de trépano) é necessário para este propósito. É essencial para evitar a perfuração da dura-máter com a broca, uma vez que esta imprecisão agravaria a lesão e resultar em refluxo de sangue ou de colagenase durante a injecção.

Inicialmente, o modelo de injecção de sangue foi desenvolvido como uma única injecção intracerebral 14, mas é muitas vezes produzido resultados inconsistentes devido ao refluxo de sangue ao longo do tracto da agulha 15. Para minimizar esta complicação, um método de injeção dupla foi desenvolvido, Em que uma pequena quantidade de sangue é injectado logo acima da área alvo do cérebro, seguida por uma segunda injecção de sangue para dentro do gânglio basal 6. Sangue coagulado da primeira injecção, evita o refluxo ao longo do tracto da agulha. Este modelo imita um hematoma em rápido desenvolvimento, mas não induz a ruptura real dos vasos sanguíneos cerebrais. Uma grande vantagem do modelo de injeção de sangue autólogo é que não há fatores de confusão, como proteínas exógenas, são utilizados para induzir ICH. Alternativamente, o modelo de colagenase bacteriana imita uma hemorragia intracerebral espontânea que se desenvolve ao longo de várias horas, tal como expostas em cerca de 30% de todos os pacientes do ICH 5. Colagenase bacteriana é uma protease que lisa a matriz extracelular em torno dos capilares cerebrais e os enfraquece, causando a ruptura do vaso e consequente extravasamento de sangue 16. Este modelo é geralmente utilizado para investigar os mecanismos de alargamento hematoma, bem como a desenvolver perspectivaive tratamentos que afetam a homeostase. No entanto, a colagenase bacteriana, pode amplificar a resposta inflamatória e apresentar efeitos neurotóxicos em doses elevadas 3. Além disso, os sangramentos extensos após a injecção intracerebral de colagenase podem produzir - em contraste com a patologia humana ICH-uma lesão isquémica cerebral.

Interessantemente, murganhos fêmeas submetidas à ICH experimental mostrou uma recuperação significativamente mais rápida dos défices neurofuncionais de animais machos 8. Resultados similares foram feitas em modelos de isquemia do curso, assim roedores machos são mais comumente implementado para estudos de patologia derrame e avaliação do tratamento 17.

Nestas experiências foram utilizados os co-injecções intraperitoneal do anestésico cetamina (100 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg) em ambos os modelos de ICH, no entanto, estudos prévios têm relatado a incidência de hiperglicemia aguda em roedores anestesiados, começando dentro de 20 minutos após ketamine e xilazina injeção 18. Além disso, a cetamina, um N-metil-d-aspartato antagonista de receptor (NMDA), pode, eventualmente, reduzir a excitotoxicidade do receptor NMDA-dependentes, e, por conseguinte, melhorar os resultados em modelos de lesão cerebral. Os anestésicos voláteis, tais como o isoflurano, são utilizadas alternadamente na investigação pré-clínica ICH e mantenha vantagens únicas sobre agentes injectáveis, incluindo a alteração rápida da profundidade da anestesia e tempos de recuperação curtos 19. A principal desvantagem da anestesia com gás é a necessidade de equipamento elaborado (vaporizador, medidor de caudal, o circuito de respiração da máscara), bem como a possibilidade de exposição ao gás humano. Além disso, o isoflurano tem sido relatada para reduzir a morte celular por apoptose após acidente vascular cerebral hemorrágico em ratos 20. A anestesia óptima necessita de ser adaptada consoante a duração da cirurgia, a espécie animal ou de tensão, e as medições de resultado de interesse.

Nós descrevemos e demonstraram dois modelos que têm ICH uniqupontos fortes e fracos de e, ao mesmo tempo que representam as propriedades do ICH específicos. Características de cada modelos representativos devem ser levados em consideração, quando usado em investigações pré-clínicas ICH.

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Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgments

Este estudo foi parcialmente financiado pelo NIH concessão RO1NS053407 a JH Zhang. Gostaríamos de agradecer ao Sr. Damon Klebe por suas valiosas contribuições.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stereotactic Head Frame Stoelting Co. 51600
Nanomite Syringe Pump Harvard Apparatus PY2 70-2217
Hamilton Syringe Hamilton Company 1725RN (250 μl)
1701 RN (10 μl)
26 Gauge needle for 250 μl and 10 μl syringes.
Microdrill Fine Science Tools 18000-17
Microdrill burr Fine Science Tools 19007-09 0.9 mm diameter
Collagenase Type VII-S Sigma-Aldrich C2399
Microhematocrit Capillary Tubes Fisher Scientific 22-362-574 unheparinized
Bone Wax Ethicon W31
Suture Ethicon 1676G
Ketamine JHP Pharmaceuticals 42023-115-10 Ketalar
Xylazine LLOYD Laboratories 139-236 AnaSed

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References

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Krafft, P. R., Rolland, W. B.,More

Krafft, P. R., Rolland, W. B., Duris, K., Lekic, T., Campbell, A., Tang, J., Zhang, J. H. Modeling Intracerebral Hemorrhage in Mice: Injection of Autologous Blood or Bacterial Collagenase . J. Vis. Exp. (67), e4289, doi:10.3791/4289 (2012).

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