Summary
Modelos animales clínicamente relevante de hemorragia intracerebral (HIC) son necesarios para profundizar en el conocimiento de accidente cerebrovascular hemorrágico y examinar nuevas estrategias terapéuticas. En este estudio, se describe y evaluar dos modelos que implementan ICH inyecciones unilaterales de sangre autóloga o bien total o colagenasa bacteriana en los ganglios basales (corpus striatum) de ratones.
Abstract
Hemorragia intracerebral espontánea (ICH) define una enfermedad potencialmente mortal neurológico que representa el 10-15% de todas las hospitalizaciones relacionadas con la carrera y para los cuales no hay tratamientos efectivos disponibles hasta la fecha 1,2. Debido a la heterogeneidad de la HIC en los seres humanos, diferentes modelos preclínicos son necesarios para explorar a fondo posibles estrategias terapéuticas 3. ICH Experimental es comúnmente inducida en los roedores mediante inyección intraparenquimatosa de cualquiera de sangre autóloga o colagenasa bacteriana 4. El modelo apropiado se selecciona basándose en la fisiopatología de la inducción y progresión de la lesión hemorragia. El modelo de inyección de sangre imita una hemorragia rápidamente progresivo. Alternativamente, colagenasa bacteriana enzimáticamente interrumpe la lámina basal de los capilares del cerebro, causando una hemorragia activos que generalmente se desarrolla durante varias horas 5. Edema resultante perihematoma y déficits neurofuncionales se puede cuantificar vaivénm ambos modelos. En este estudio, hemos descrito y evaluado un modelo modificado de doble inyección de sangre autóloga conjunto 6, así como un modelo de inyección de ICH de colagenasa bacteriana 7, ambos de los cuales objetivo de los ganglios basales (corpus striatum) de machos CD-1 ratones. Se evaluaron los déficits neurofuncionales y edema cerebral a las 24 y 72 horas después de la inducción de ICH. Inyección intraestriatal de sangre autóloga (30 l) o colagenasa bacteriana (0.075U) causada reproducibles déficit neurofuncionales en ratones y edema cerebral aumentado significativamente a las 24 y 72 h después de la cirugía (p <0,05). En conclusión, tanto los modelos de rendimiento consistentes infartos hemorrágicos y representan métodos básicos para la investigación preclínica ICH.
Protocol
Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con la Guía del NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y aprobados por el Cuidado de Animales y el empleo Comisión de Loma Linda University.
1. Preparación prequirúrgica
Técnicas asépticas se recomiendan para todos los procedimientos quirúrgicos. Desinfecte el aparato estereotáxico y preparar instrumentos quirúrgicos estériles antes de la cirugía. Use el equipo de protección personal (EPP) durante todo el manejo animal. Use una almohadilla eléctrica durante la cirugía para mantener la temperatura corporal del animal fisiológico.
- Pesar el ratón 8-12 semanas de edad mediante una escala haz animales triple.
- Co-inyectar ketamina (100 mg / kg) y xilazina (10 mg / kg) por vía intraperitoneal luego permitir 7-10 minutos a que la anestesia surta efecto (monitor para una adecuada sedación).
- Coloque el ratón sobre una manta térmica y afeitarse la cabeza.
- Aplique ungüento oftálmico en ambos ojos.
- Asegure ellas vías respiratorias, moviendo suavemente la lengua lateralmente, y asegurar cuidadosamente la cabeza del ratón sobre el aparato estereotáxico. Nota: La cabeza debe estar asegurado horizontalmente a la base del marco estereotáxico.
- Desinfecte el área quirúrgica con Betadine y enjuague con un 70% de etanol. Repita alternando aplicaciones de Betadine y etanol al 70% para un total de tres veces. Aplicadores con punta de algodón se puede utilizar para este propósito.
2. Sangre modelo de inyección
- Haz un 1 cm de largo incisión de línea media del cuero cabelludo con una hoja de bisturí # 10.
- Utilice aplicadores con punta de algodón para eliminar el tejido blando que cubre el cráneo, con el fin de exponer el punto de intersección perpendicular de la sutura coronal y sagital (bregma).
- Montar la jeringa de Hamilton (250 l) a la bomba de inyección, y estereotáxicamente dirigir la aguja (26 Gauge) durante bregma.
- A continuación, ajuste los brazos manipuladores estereotácticas para colocar la aguja de 0,2 mm por delante y 2mm lateralmente a la derecha. En estas coordenadas hacer un pequeño agujero craneal rebaba, utilizando un taladro de velocidad variable con una broca de 1 mm.
- Suspender la cola del animal y desinfectar su superficie inferior con 70% de etanol.
- La punción de la arteria central de la cola con una aguja estéril (por ejemplo, 26 Gauge) y recoger la sangre arterial en un tubo capilar unheparinized.
- Transfiera la sangre rápidamente del tubo capilar en el cuerpo de vidrio de la jeringa Hamilton, a continuación, insertar el émbolo.
- Vuelva a colocar el l ahora de 30 años o más de sangre arterial que contiene una jeringa Hamilton en la bomba de inyección e inserte la aguja (con el borde biselado hacia la sutura sagital) a través del orificio de trepanación sólo hasta que su bisel ya no es visible.
- Desde este punto de avance de la aguja 3 mm ventralmente e inyectar 5 l de sangre autóloga a razón de 2 l / min.
- Después de la terminación de la primera avance de inyección de la aguja 0,7 mm más en profundidad.
- Esperar5 min y después se inyectan 25 l de sangre en el cuerpo estriado derecho.
- Al término de la segunda inyección, deje la aguja en la posición de 10 minutos adicionales, antes de retirarlo a una velocidad de 1 mm / min.
- Selle el orificio de trepanación con cera de hueso y suturar la piel.
- Para la analgesia postoperatoria inyectar 0,05 mg / kg de buprenorfina por vía subcutánea en precalentadas líquidos (solución salina normal).
3. La colagenasa modelo de inyección
- A raíz de los preparativos prequirúrgicos, repita los pasos 1-4 como se describe para el modelo de inyección de sangre.
- Llene la jeringa Hamilton (10 l) con 0.075U de bacterias (clostridios) colagenasa VII-S disolvió en 0,5 l de solución salina. Evitar la formación de burbujas de aire.
- Vuelva a colocar la jeringa Hamilton en la bomba de inyección e inserte la aguja (26 Gauge), a través del orificio de trepanación sólo hasta que su bisel ya no es visible.
- Avance la aguja de 3,7 mm ventral e inyectar el 0.075U de la colagenasa into el cuerpo estriado derecho a un ritmo de 2 l / min.
- Una vez completada la inyección, deje la aguja en la posición de 10 minutos adicionales, antes de retirarlo a una velocidad de 1 mm / min.
- Selle el orificio de trepanación con cera de hueso y suturar la piel.
- Inyectar 0,05 mg / kg de buprenorfina por vía subcutánea en precalentadas post-operatorias fluidos.
4. Sham operación
- A raíz de los preparativos prequirúrgicos, repita los pasos 1-4 como se describe para el modelo de inyección de sangre.
- Inserte la aguja (26 Gauge) 3,7 mm ventral a través del orificio de trepanación. La aguja debe permanecer en posición durante 10 min antes de ser retirado a una velocidad de 1 mm / min.
- Selle el orificio de trepanación con cera de hueso y suturar la piel.
- Inyectar 0,05 mg / kg de buprenorfina por vía subcutánea en precalentadas post-operatorias fluidos.
5. Los resultados representativos
Hemorragia intraestriatal Experimental evoca morfológica comoasí como los cambios de comportamiento en los roedores. Estos cambios pueden ser evaluados para asegurar una adecuada ejecución del procedimiento, o para investigar los efectos de los tratamientos potenciales. La generación de la hemorragia en un área del cerebro específica (ganglios de la base, por ejemplo) es más esencial para un enfoque reproducible, y puede ser verificada en las secciones del cerebro brutos o teñido histológico (Figura 1-2). La lesión de los resultados de los ganglios basales en los déficits sensoriomotoras, que pueden ser cuantificados a través de diversas evaluaciones del comportamiento. Resultados de la prueba de esquina a su vez mostraron que, después experimental del lado derecho ICH, los ratones resultó significativamente más a menudo ipsilateralmente y lejos de la alteración contralateral (izquierda), con operación simulada que los animales a las 24 y 72 h después de la cirugía (Figura 3 A). Además, la capacidad de colocar adecuadamente la alteración (a la izquierda) extremidad anterior en una superficie, después de la estimulación vibrisas, se evaluó mediante el test de extremidad anterior de colocación. A las 24 y 72 horas después de la cirugía, ratones subproyectada para el lado derecho ICH mostraron las colocaciones significativamente menos que los animales operación simulada. La medición de edema cerebral se emplea con frecuencia para cuantificar la extensión de la lesión cerebral después de ICH experimental. Las inyecciones intracerebrales de sangre autóloga (30 l) o colagenasa bacteriana (0,075 U) condujo a un aumento significativo del contenido de agua del cerebro en la corteza ipsilateral y los ganglios basales en 24 (Figura 4 A) y 72 h (Figura 4 B) después de la cirugía ( en comparación con el tratamiento simulado). El resultado de las pruebas de comportamiento (Figura 3) y el grado de edema cerebral (Figura 4) no mostraron diferencias entre la sangre y los modelos de inyección de colagenasa en volúmenes dados.
Figura 1. Modelado de la HIC en ratones. (A) El esquema simplificado de una sección coronal del cerebro 0,2 mm anterior del bregma ilustra la proposed ubicación de sangre autóloga o inyección de colagenasa. El ventrículo lateral se marca LV. CPU significa caudado-putamen, una parte del cuerpo estriado, y GP identifica el globus pallidus. Ambos, el cuerpo estriado, así como el globus pallidus pertenecen a un grupo de sub-cortical núcleos, también conocida como los ganglios basales. (B) Representante microfotografía de una sección coronal del cerebro anterior de 0,2 mm bregma, obtenido a las 24 h después de la inyección intraestriatal de sangre entera autóloga.
Figura 2. Manifestación histológica del hematoma. Representante hematoxilina y eosina (H & E) criosección manchado coronal (10 micras) de un cerebro de ratón, que ilustra el tamaño del hematoma a las 24 h después de la inyección intraestriatal de colagenasa bacteriana (0,075 U). LH = hemicuerpo izquierdo, HR = hemisferio derecho.
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Figura 3. Evaluaciones neurofuncionales siguientes ICH experimental en ratones. Inyección intraestriatal de sangre autóloga (30 l) o colagenasa bacteriana (0,075 U) causada reproducibles déficit neurofuncionales. (A) ratones después de ICH experimental mostró vueltas significativamente más derecho que los animales operación simulada a 24 y 72 h después de la cirugía. (B) La capacidad de colocar las patas delanteras de la extremidad izquierda se vio afectada después de ICH a las 24 y 72 horas después de la cirugía. Los valores se expresan como media ± SEM y analizados con el test de Kruskal-Wallis de análisis de varianza unidireccional en Ranks, seguido por el método de Student-Newman-Keuls. Un valor de P <0,05 fue considerado estadísticamente significativo, n = 6-12 por grupo, * p <0,05 en comparación con el tratamiento simulado. Haga clic aquí para ampliar la cifra .
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Figura 4. Evaluación del contenido de agua del cerebro después de ICH experimental en ratones. Inyección intracerebral de sangre autóloga (30 l) o colagenasa bacteriana (0,075 U) llevó a un aumento significativo del contenido de agua del cerebro en la corteza ipsilateral y los ganglios basales en 24 (A) y 72 hr (B) después de ICH-inducción. Los valores se expresan como media ± SEM y analizados con una forma de análisis de varianza, seguido de Tukey test post hoc. Un valor de P <0,05 fue considerado estadísticamente significativo, n = 6-10 por grupo, * p <0,05 en comparación con el tratamiento simulado. Haga clic aquí para ampliar la cifra .
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Discussion
Los modelos animales de hemorragia intracerebral (ICH), contribuyen en gran medida a una comprensión avanzada de la fisiopatología de la enfermedad, y se utilizan para desarrollar y evaluar nuevas estrategias terapéuticas en un ambiente preclínica. Intraparenquimatosa inyecciones de sangre autóloga o colagenasa bacteriana son métodos bien establecidos para generar ICH en los roedores. Ambos métodos se desarrollaron inicialmente en la rata, sin embargo, debido a la disponibilidad creciente de cepas transgénicas y knockout, los ratones se hizo indispensable para aclarar aún más los mecanismos de lesión cerebral hemorrágico 8.
En los seres humanos, hemorragia ganglios basales representa aproximadamente el 50% de los ictus hemorrágicos, y los pacientes que sobreviven al evento inicial frecuentemente desarrollan déficits deletéreos neurofuncionales 1. En consecuencia, ICH experimental en roedores, con la participación de los ganglios basales, evoca déficits sensitivomotores en las extremidades contralaterales del animal. Afecha, varias evaluaciones de comportamiento se han desarrollado para caracterizar aquellas deficiencias en ratones y ratas 9,10.
En el presente estudio, hemos descrito y evaluado un modelo modificado de doble inyección de sangre autóloga conjunto 6, así como un modelo de inyección de ICH de colagenasa bacteriana 7, tanto la orientación de los ganglios basales (corpus striatum) en ratones. Se evaluaron los déficits de comportamiento a través de la esquina a su vez extremidad anterior y la colocación de prueba 9,11 y observó el aumento de sensorimotor impedimentos en los dos modelos en 24 y 72 horas después de la cirugía (Figura 3). En estos puntos temporales no se encontraron diferencias significativas entre los grupos de la ICH, sin embargo, los estudios anteriores sugieren una progresión lesión prolongada después de la inyección de colagenasa, por lo que es un modelo más adecuado para los estudios de resultados a largo plazo 5. Edema cerebral (contenido de agua del cerebro) se midió usando el método wet-weight/dry-weight como se informó anteriormente 12,13.Nuestros resultados mostraron un aumento significativo en el edema cerebral perihematoma a las 24 y 72 h después de la inducción de ICH (Figura 4). Todos los ratones sometidos a ICH experimental o cirugía simulada sobrevivieron hasta el día del sacrificio (mortalidad = 0%).
Los dos modelos descritos ICH emplear una cirugía estereotáctica-asistida para asegurar inyecciones precisas y reproducibles de la sangre o la colagenasa en el área del cerebro específica. Una craneotomía pequeñas (1 mm orificio de trepanación) que se necesita para este fin. Es esencial para evitar la perforación de la duramadre por la broca, ya que esta inexactitud se agravaría la lesión y el resultado en el reflujo de sangre o colagenasa durante la inyección.
Inicialmente, el modelo de inyección de sangre fue desarrollado como una sola inyección intracerebral 14, pero a menudo produce resultados inconsistentes debido a reflujo de sangre a lo largo del tracto de la aguja 15. Para minimizar esta complicación, un método de inyección de doble fue desarrollado, En el que una pequeña cantidad de sangre se inyecta justo encima de la zona del cerebro específica, seguido de una segunda inyección de sangre en los ganglios basales 6. La sangre coagulada de la primera inyección, evita el reflujo a lo largo del tracto de la aguja. Este modelo imita a un hematoma en rápido desarrollo, pero no induce la ruptura real de los vasos sanguíneos cerebrales. Una ventaja importante de la inyección de sangre autóloga modelo es que no hay factores de confusión, como las proteínas exógenas, se utilizan para inducir ICH. Como alternativa, el modelo de colagenasa bacteriana imita una hemorragia intracerebral espontánea que se desarrolla durante varias horas, según lo exhibido en aproximadamente el 30% de todos los pacientes con HIC 5. Colagenasa bacteriana es una proteasa que lisa la matriz extracelular alrededor de los capilares cerebrales y los debilita, causando la rotura del vaso y extravasación de sangre consiguiente 16. Este modelo se utiliza generalmente para investigar mecanismos de ampliación hematoma, así como para desarrollar perspectivaive tratamientos que afectan a la homeostasis. Sin embargo, la colagenasa bacteriana, pueden amplificar la respuesta inflamatoria y presentan efectos neurotóxicos a altas dosis 3. Además, hemorragias extensas después de la inyección intracerebral de colagenasa puede producir - en contraste con la patología humana ICH-una lesión cerebral isquémica.
Curiosamente, las mujeres ratones sometidos a ICH experimental mostró una recuperación significativamente más rápida del déficit neurofuncionales de animales machos 8. Resultados similares han sido realizados en modelos de ictus isquémicos, así roedores machos son más comúnmente implementado para estudios de la carrera de la patología y la evaluación de tratamiento 17.
En estos experimentos se utilizó co-intraperitoneal inyecciones de la ketamina anestésicos (100 mg / kg) y xilazina (10 mg / kg) para los dos modelos de ICH, sin embargo, estudios anteriores han informado de la incidencia de hiperglucemia aguda en roedores anestesiados, que comienza dentro de 20 minutos después de kEtamine y la inyección de xilazina 18. Además, la ketamina, un N-metil-D-aspartato (NMDA) del receptor, posiblemente puede reducir NMDA dependiente del receptor de excitotoxicidad, y por lo tanto mejorar los resultados en modelos de lesión del cerebro. Los anestésicos volátiles, como el isoflurano, se usan de manera alternativa en la investigación preclínica ICH y mantener ventajas únicas sobre los agentes inyectables, incluyendo la alteración rápida de la profundidad de la anestesia y los cortos tiempos de recuperación 19. La principal desventaja de la anestesia con gas es la necesidad de equipo complicado (vaporizador, medidor de flujo, circuito de respiración máscara), así como la posibilidad de exposición humana gas. Además, isoflurano se ha informado a reducir la muerte celular apoptótica después de accidente cerebrovascular hemorrágico en ratones 20. La anestesia óptima necesita ser modificado en función de la duración de la cirugía, las especies animales o cepa, y en las medidas de resultado de interés.
Se describió y demostró dos modelos que tienen ICH uniqufortalezas y debilidades de correos, mientras que representan propiedades específicas ICH. Características de cada modelo de representación hay que tener en cuenta, cuando se utiliza en investigaciones preclínicas ICH.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este estudio fue parcialmente apoyado por el NIH subvención RO1NS053407 a JH Zhang. Nos gustaría dar las gracias al Sr. Damon Klebe por sus valiosas contribuciones.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereotactic Head Frame | Stoelting Co. | 51600 | |
| Nanomite Syringe Pump | Harvard Apparatus | PY2 70-2217 | |
| Hamilton Syringe | Hamilton Company | 1725RN (250 μl) 1701 RN (10 μl) |
26 Gauge needle for 250 μl and 10 μl syringes. |
| Microdrill | Fine Science Tools | 18000-17 | |
| Microdrill burr | Fine Science Tools | 19007-09 | 0.9 mm diameter |
| Collagenase Type VII-S | Sigma-Aldrich | C2399 | |
| Microhematocrit Capillary Tubes | Fisher Scientific | 22-362-574 | unheparinized |
| Bone Wax | Ethicon | W31 | |
| Suture | Ethicon | 1676G | |
| Ketamine | JHP Pharmaceuticals | 42023-115-10 | Ketalar |
| Xylazine | LLOYD Laboratories | 139-236 | AnaSed |
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