Summary
Kliniskt relevanta djurmodeller för intracerebral blödning (ICH) behövs för att utöka vår kunskap om hemorragisk stroke och att undersöka nya terapeutiska strategier. I denna studie beskriver vi och utvärdera två ICH modeller som genomför ensidiga injektioner av antingen autologt helblod eller bakteriell kollagenas i de basala ganglierna (corpus striatum) hos möss.
Abstract
Spontan intracerebral blödning (ICH) definierar en potentiellt livshotande neurologiska sjukdom som står för 10-15% av alla stroke-relaterade sjukhusinläggningar och för vilka inga effektiva behandlingar finns tillgängliga hittills 1,2. På grund av heterogenitet ICH hos människor, är olika prekliniska modeller som behövs för att noggrant undersöka potentiella terapeutiska strategier 3. Experimentell ICH vanligen framkallas hos gnagare genom intraparenkymal injektion av antingen autologt blod eller bakteriell kollagenas 4. Den lämplig modell väljs utifrån patofysiologi blödning induktion och skada progression. Blodet injektionen Modellen härmar en snabbt progredierande blödning. Alternativt, bakteriell kollagenas stör enzymatiskt basala lamina av hjärnan kapillärerna, vilket en aktiv blödning som i allmänhet utvecklas under flera timmar 5. Resulterande perihematomal ödem och neurofunctional underskott kan kvantifieras tillbakam båda modellerna. I denna studie, som beskrivs vi och utvärderat en modifierad dubbel injektion modell av autologt helblod 6 såväl som en ICH injektion modell av bakteriellt kollagenas 7, vilka båda mål basala ganglierna (corpus striatum) av hankön CD-1-möss. Vi bedömde neurofunctional underskott och hjärnödem vid 24 och 72 timmar efter ICH induktion. Intrastriatal injektion av autologt blod (30 ^ il) eller bakteriellt kollagenas (0.075U) orsakade reproducerbara neurofunctional underskott i möss och ökade signifikant hjärnans ödem vid 24 och 72 timmar efter operationen (p <0,05). Sammanfattningsvis båda modellerna ger konsekventa hemorragiska infarkter och utgör grundläggande metoder för preklinisk ICH forskning.
Protocol
Alla förfaranden genomfördes i enlighet med NIH Guide för vård och användning av försöksdjur och godkänts av Animal Care och användning kommittén vid Loma Linda University.
1. Presurgical Förberedelser
Aseptisk teknik rekommenderas för alla kirurgiska ingrepp. Desinficera stereotaktiska apparater och förbereda sterila kirurgiska instrument före operation. Använd personlig skyddsutrustning (PPE) under hela djurhantering. Använd en värmedyna under kirurgi för att upprätthålla djurets fysiologiska kroppstemperatur.
- Väg 8-12 veckor gammal mus med användning av en trippel skala balk djur.
- Co-injicera ketamin (100 mg / kg) och xylazin (10 mg / kg) intraperitonealt tillåter sedan 7-10 min för anestesi ska träda i kraft (monitor för en adekvat sedering).
- Placera musen på en värmefilt och raka hårbotten.
- Applicera oftalmisk salva i båda ögonen.
- Säkraluftvägarna, genom att försiktigt flytta tungan i sidled, och försiktigt säkra musens huvud på den stereotaktiska anordningen. Obs: Huvudet måste säkras horisontellt till grund för den stereotaktiska ramen.
- Desinficera kirurgiska området med Betadine, och skölj med 70% etanol. Upprepa alternerande tillämpningar av Betadine och 70% etanol för totalt tre gånger. Bomullspinne applikatorerna kan användas för detta ändamål.
2. Blod Injection Modell
- Gör en 1 cm lång mittlinjesnitt i hårbotten med en # 10 skalpell blad.
- Använd bomull spets applikatorer att rensa bort den mjuka vävnad som täcker skallen, för att exponera punkten vinkelrätt skärningspunkten mellan koronala och sagittala suturen (bregma).
- Montera Hamilton-spruta (250 pl) på insprutningspumpen och stereotaxiskt rikta nålen (26 Gauge) över bregma.
- Därefter justera stereotaktiska manipulatorarmar att placera nålen 0,2 mm främre och 2mm i sidled åt höger. Vid dessa koordinater gör ett litet kraniell borrhål, med en variabel hastighet borr med en 1 mm borr.
- Suspendera djurets svans och desinficera sin undre yta med 70% etanol.
- Punktera centrala svansartären med en steril nål (t.ex. 26 gauge) och samla det arteriella blodet i en unheparinized kapillärrör.
- Överför blodet snabbt från kapillärröret i glaset cylinder Hamilton-spruta, sedan in kolven.
- Sätt tillbaka den nu 30 ul eller mer av arteriellt blod innehåller Hamilton spruta på insprutningspumpen och stick in nålen (med dess avfasade kanten mot sagittala suturen) genom borrhålet bara tills dess avfasning inte längre syns.
- Från denna punkt förväg nålen 3 mm ventralt och injicera 5 il autologt blod vid en hastighet av 2 pl / min.
- Efter fullbordan av den första injektionen förväg nålen 0,7 mm längre djup.
- Vänta på5 minuter injicera därefter 25 pl blod i högra striatum.
- Efter avslutad den andra injektionen, lämna nålen i läge för ytterligare 10 minuter, innan du drar den med en hastighet av 1 mm / min.
- Täta borrhålet med ben vax och sy huden.
- För postoperativ smärtlindring injicera 0,05 mg / kg buprenorfin subkutant i förvärmda vätskor (fysiologisk koksaltlösning).
3. Kollagenas Injection Modell
- Efter presurgical förberedelser, upprepa steg 1-4 enligt beskrivningen för blodet injektion modellen.
- Fyll Hamilton-spruta (10 pl) med 0.075U av bakteriella (clostridial) kollagenas VII-S-löst i 0,5 pl saltlösning. Undvika bildandet av luftbubblor.
- Sätt tillbaka Hamilton-spruta på insprutningspumpen och stick in nålen (26 Gauge), genom borrhålet bara tills dess avfasning inte längre syns.
- Advance nålen 3,7 mm ventralt och injicera 0.075U av kollagenas Into den högra striatum med en hastighet av 2 pl / min.
- Vid fullbordande av injektionen, lämna nålen i läge för ytterligare 10 minuter, innan man tar ut den med en hastighet av 1 mm / min.
- Täta borrhålet med ben vax och sy huden.
- Injicera 0,05 mg / kg buprenorfin subkutant i förvärmda postoperativa vätskor.
4. Skenoperation
- Efter presurgical förberedelser, upprepa steg 1-4 enligt beskrivningen för blodet injektion modellen.
- Stick in nålen (26 Gauge) 3,7 mm ventralt genom borrhålet. Nålen bör förbli på plats under 10 min innan den dras med en hastighet av 1 mm / min.
- Täta borrhålet med ben vax och sy huden.
- Injicera 0,05 mg / kg buprenorfin subkutant i förvärmda postoperativa vätskor.
5. Representativa resultat
Experimentell intrastriatal blödning väcker morfologiska somsamt beteendeförändringar hos gnagare. Dessa förändringar kan utvärderas för att säkerställa en tillräcklig genomförande av förfarandet, eller att undersöka effekterna av potentiella behandlingar. Generera blöda på ett målinriktat hjärna område (t.ex. basala ganglierna) är mest avgörande för en reproducerbar metod, och kan verifieras på grova eller histologiskt betsad hjärnan sektioner (figur 1-2). Skador på basala ganglierna leder sensomotoriska svårigheter som kan kvantifieras genom olika beteendemässiga bedömningar. Resultat av hörnet sväng testet visade att, efter experimentell högersidig ICH, vände mössen signifikant oftare ipsilaterally och bort från nedsatt kontralaterala (vänstra) sida, än skenopererade djuren vid 24 och 72 timmar efter operationen (figur 3 A). Vidare, förmågan att adekvat placera nedsatt (vänster) frambenet på en yta, efter vibrissae stimulering utvärderades via forelimb placera provet. Vid 24 och 72 timmar efter operationen, möss subprojicerade till högersidig ICH visade signifikant färre placeringar än skenopererade djur. Mätning av hjärnödem ofta används för att kvantifiera omfattningen av hjärnskada efter experimentell ICH. Intracerebrala injektioner av autologt blod (30 ^ il) eller bakteriellt kollagenas (0,075 U) ledde till en signifikant ökning av hjärnans vattenhalt i ipsilaterala kortex och basala ganglier vid 24 (figur 4 A) och 72 timmar (figur 4 B) efter kirurgi ( jämfört med placebo). Resultatet av beteendetester (Figur 3) och omfattningen av hjärnödem (Figur 4) visade ingen skillnad mellan blodet och koUagenas modeller injektion vid givna volymer.
Figur 1. Modellering ICH i möss. (A) förenklad schematisk vy av en koronalt hjärna sektion 0,2 mm anterior av bregma illustrerar proposed plats autologt blod eller kollagenas injektion. Den laterala ventrikeln är märkt LV. Cpu står för caudatus-putamen, en del av striatum, och GP identifierar globus pallidus. Både striatum liksom globus pallidus tillhör en grupp av subkortikal kärnor, även känd som basala ganglierna. (B) Representant mikrofotografi av en koronalt hjärnan sektion 0.2mm främre av bregma, erhålls vid 24 timmar efter intrastriatal injektion av autologt helblod.
Figur 2. Histologisk manifestation av hematom. Representanten hematoxylin och eosin (H & E) färgade koronalt kryosnittet (10 | im) av en mus hjärna, illustrerar hematom storlek vid 24 h efter intrastriatal injektion av bakteriellt kollagenas (0,075 U). LH = vänster hjärnhalva, RH = höger hjärnhalva.
< img alt = "Bild 3" src = "/ files/ftp_upload/4289/4289fig3.jpg" />
Figur 3. Neurofunctional bedömningar följande experimentella ICH hos möss. Intrastriatal injektion av autologt blod (30 pl) eller bakteriell kollagenas (0,075 U) orsakade reproducerbara neurofunctional underskott. (A) möss efter experimentell ICH visade betydligt mer högersvängar än skenopererade djur vid 24 och 72 timmar efter operationen. (B) framtassarna placering kapacitet vänstra benet var nedsatt efter ICH vid 24 och 72 timmar efter operationen. Värden uttrycktes som medelvärde ± SEM och analyserades med Kruskal-Wallis envägsanalys av varians på Rankat, följt av Student-Newman-Keuls-metoden. AP värde <0,05 ansågs statistiskt signifikant, n = 6-12 per grupp, * P <0,05 jämfört med placebo. Klicka här för att se större bild .
igure 4 "src =" / files/ftp_upload/4289/4289fig4.jpg "/>
Figur 4. Utvärdering av hjärnans vattenhalt efter experimentell ICH i möss. Intracerebral injektion av autologt blod (30 ^ il) eller bakteriellt kollagenas (0,075 U) ledde till signifikant ökning av hjärnans vattenhalt i ipsilaterala kortex och basala ganglier vid 24 (A) och 72 timmar (B) efter ICH-induktion. Värden uttrycktes som medelvärde ± SEM och analyserades med envägsanalys av varians följt av Tukey post hoc-test. AP värde <0,05 ansågs statistiskt signifikant, n = 6-10 per grupp, * P <0,05 jämfört med placebo. Klicka här för att se större bild .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Djurmodeller av intracerebral blödning (ICH) bidrar starkt till en fördjupad förståelse av sjukdomens patofysiologi, och används ofta för att utveckla och utvärdera nya terapeutiska strategier i en preklinisk miljö. Intraparenkymal injektioner av autologt blod eller bakteriell kollagenas är väletablerade metoder för att generera ICH hos gnagare. Båda metoderna utvecklades ursprungligen på råtta, men på grund av den snabbt ökande tillgången på transgena och knockout stammar, blev mössen nödvändigt att ytterligare klarlägga mekanismer för hemorragisk hjärnskada 8.
Hos människor svarar basala ganglierna blödning för ca 50% av alla hemorragisk stroke, och patienter som överlever den första händelsen utvecklar ofta skadliga neurofunctional underskott 1. Därför väcker experimentell ICH hos gnagare, där de basala ganglierna, sensomotoriska svårigheter i djurets kontralaterala extremiteter. TillHittills har flera beteende bedömningar utvecklats för att karakterisera dessa försämringar hos möss och råttor 9,10.
I föreliggande studie beskrev vi och utvärderat en modifierad dubbel injektion modell av autologt helblod 6 såväl som en ICH injektion modell av bakteriellt kollagenas 7, båda riktade de basala ganglierna (corpus striatum) i möss. Vi utvärderade beteendestörningar via hörnet sväng och forelimb placera testet 9,11 och observerade ökade sensomotoriska funktionsnedsättningar i båda modellerna på 24 och 72 timmar efter operationen (Figur 3). Vid dessa tidpunkter inga signifikanta skillnader påträffades mellan ICH grupperna, men föreslog tidigare studier en långvarig skada progress efter kollagenas injektion, vilket gör det mer lämplig modell för långsiktiga utfall studier 5. Hjärnödem (hjärna vatteninnehåll) mättes med användning av wet-weight/dry-weight metod som tidigare rapporterats 12,13.Våra resultat visade en signifikant ökning i perihematomal hjärnödem vid 24 och 72 timmar efter induktion ICH (figur 4). Alla möss som utsätts för experimentell ICH eller simulerad operation överlevde till dag av offer (mortalitet = 0%).
De två beskrivna ICH modeller använder en stereotaktiskt-assisterad kirurgi för att säkerställa exakta och reproducerbara injektioner av antingen blod eller kollagenas i den målinriktade hjärnan området. En liten kraniotomi (1 mm borrhål) behövs för detta ändamål. Det är viktigt att undvika perforering av dura genom borrkronan, eftersom denna onoggrannhet skulle förvärra skadan och resulterar i backflöde av blod eller kollagenas under injektionen.
Inledningsvis var blod injektionen som utvecklats som en intracerebral injektion 14, men ofta producerade inkonsekventa resultat på grund av backflöde av blod längs nålen tarmkanalen 15. För att minimera denna komplikation har en dubbel injektion metod som utvecklats, I vilken en liten mängd blod injiceras precis ovanför riktade hjärnan området, följt av en andra injektion av blod i de basala ganglierna 6. Koagulerat blod av den första injektionen, förhindrar tillbakaflöde längs nålen tarmkanalen. Denna modell imiterar en snabbt växande hematom, men inducerar inte den faktiska bristning av cerebrala blodkärl. En stor fördel med autologt blod injektionen modellen är att inga störande faktorer, såsom exogena proteiner, används för att framkalla ICH. Alternativt härmar den bakteriella kollagenas-modellen en spontan intracerebral blödning som utvecklas över flera timmar, så utställda i ca 30% av alla ICH patienter 5. Bakteriell kollagenas är ett proteas som lyserar den extracellulära matrisen runt cerebrala kapillärerna och försvagar dem, vilket leder till fartyg bristning och därmed blod extravasering 16. Denna modell är i allmänhet används för att undersöka mekanismer för hematom utvidgningen samt att utveckla utsikterive behandlingar som påverkar homeostas. Emellertid bakteriellt kollagenas, kan förstärka det inflammatoriska svaret och presentera neurotoxiska effekter vid höga doser 3. Dessutom kan stora blödningar efter intracerebrala kollagenas injektionen producerar - i motsats till humant ICH patologi-en ischemisk cerebral skada.
Intressant nog visade honmöss utsatta för experimentell ICH en betydligt snabbare återhämtning av neurofunctional underskott än handjur 8. Liknande resultat har gjorts i ischemisk stroke modeller, vilket manliga gnagare är mer utbredd tillämpning för studier av stroke patologi och behandling utvärdering 17.
I dessa experiment har vi utnyttjade intraperitoneala co-injektioner av bedövningsmedel ketamin (100 mg / kg) och xylazin (10 mg / kg) för båda modellerna ICH, men har tidigare studier rapporterade incidensen av akut hyperglykemi i bedövade gnagare, med början inom 20 minuter efter ketamine och xylazin injektion 18. Vidare kan ketamin, en N-metyl-d-aspartat (NMDA) receptorantagonist, minska möjligen NMDA-receptor-beroende excitotoxicitet, och därför förbättra utfallet i modeller hjärnskada. Flyktiga anestetika, såsom isofluran, är alternativt används i preklinisk ICH forskning och hålla unika fördelar jämfört med injicerbara medel, inklusive den snabba förändringen av anestesi djup och korta återhämtning 19. Den största nackdelen med gas anestesi är behovet av komplicerad utrustning (förgasare, flödesmätare, mask andningskrets) samt möjlighet till mänsklig gasläckan. Dessutom har isofluran rapporterats minska apoptotisk celldöd efter hemorragisk stroke hos möss 20. Den optimala anestesi måste anpassas beroende på längd kirurgi, djurarter eller stam, och på resultaten mätningar av intresse.
Vi beskrivit och visat två ICH modeller som har unique styrkor och svagheter, samtidigt som representerar specifika ICH egenskaper. Varje modeller representativa egenskaper måste beaktas, när de används i prekliniska ICH utredningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Denna studie har delvis stöd av NIH bidrag RO1NS053407 till JH Zhang. Vi vill tacka Mr Damon Klebe för hans värdefulla bidrag.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereotactic Head Frame | Stoelting Co. | 51600 | |
| Nanomite Syringe Pump | Harvard Apparatus | PY2 70-2217 | |
| Hamilton Syringe | Hamilton Company | 1725RN (250 μl) 1701 RN (10 μl) |
26 Gauge needle for 250 μl and 10 μl syringes. |
| Microdrill | Fine Science Tools | 18000-17 | |
| Microdrill burr | Fine Science Tools | 19007-09 | 0.9 mm diameter |
| Collagenase Type VII-S | Sigma-Aldrich | C2399 | |
| Microhematocrit Capillary Tubes | Fisher Scientific | 22-362-574 | unheparinized |
| Bone Wax | Ethicon | W31 | |
| Suture | Ethicon | 1676G | |
| Ketamine | JHP Pharmaceuticals | 42023-115-10 | Ketalar |
| Xylazine | LLOYD Laboratories | 139-236 | AnaSed |
References
- Broderick, J. P. Guidelines for the management of spontaneous intracerebral hemorrhage: A statement for healthcare professionals from a special writing group of the Stroke Council, American Heart Association. Stroke. 30, 905-915 (1999).
- Qureshi, A. I., Mendelow, A. D., Hanley, D. F. Intracerebral haemorrhage. Lancet. 373, 1632-1644 (2009).
- MacLellan, C. L., Silasi, G., Auriat, A. M., Colbourne, F. Rodent models of intracerebral hemorrhage. Stroke. 41, 95-98 (2010).
- James, M. L., Warner, D. S., Laskowitz, D. T. Preclinical models of intracerebral hemorrhage: a translational perspective. Neurocrit Care. 9, 139-152 (2008).
- MacLellan, C. L. Intracerebral hemorrhage models in rat: comparing collagenase to blood infusion. J. Cereb. Blood Flow Metab. 28, 516-525 (2008).
- Belayev, L. Experimental intracerebral hemorrhage in the mouse: histological, behavioral, and hemodynamic characterization of a double-injection model. Stroke. 34, 2221-2227 (2003).
- Clark, W., Gunion-Rinker, L., Lessov, N., Hazel, K. Citicoline treatment for experimental intracerebral hemorrhage in mice. Stroke. 29, 2136-2140 (1998).
- Nakamura, T. Intracerebral hemorrhage in mice: model characterization and application for genetically modified mice. J. Cereb. Blood Flow Metab. 24, 487-494 (2004).
- Schallert, T. Behavioral tests for preclinical intervention assessment. NeuroRx. 3, 497-504 (2006).
- Hartman, R., Lekic, T., Rojas, H., Tang, J., Zhang, J. H. Assessing functional outcomes following intracerebral hemorrhage in rats. Brain Res. 1280, 148-157 (2009).
- Hua, Y. Behavioral tests after intracerebral hemorrhage in the rat. Stroke. 33, 2478-2484 (2002).
- Tang, J. Mmp-9 deficiency enhances collagenase-induced intracerebral hemorrhage and brain injury in mutant mice. J. Cereb. Blood Flow Metab. 24, 1133-1145 (2004).
- Ma, Q. Vascular adhesion protein-1 inhibition provides antiinflammatory protection after an intracerebral hemorrhagic stroke in mice. J. Cereb. Blood Flow Metab. , (2010).
- Bullock, R., Mendelow, A. D., Teasdale, G. M., Graham, D. I. Intracranial haemorrhage induced at arterial pressure in the rat. Part 1: Description of technique, ICP changes and neuropathological findings. Neurol Res. 6, 184-188 (1984).
- Yang, G. Y., Betz, A. L., Chenevert, T. L., Brunberg, J. A., Hoff, J. T. Experimental intracerebral hemorrhage: relationship between brain edema, blood flow, and blood-brain barrier permeability in rats. J. Neurosurg. 81, 93-102 (1994).
- Rosenberg, G. A., Mun-Bryce, S., Wesley, M., Kornfeld, M. Collagenase-induced intracerebral hemorrhage in rats. Stroke. 21, 801-807 (1990).
- Alkayed, N. J. Gender-linked brain injury in experimental stroke. Stroke. 29, 159-165 (1998).
- Saha, J. K., Xia, J., Grondin, J. M., Engle, S. K., Jakubowski, J. A. Acute hyperglycemia induced by ketamine/xylazine anesthesia in rats: mechanisms and implications for preclinical models. Exp Biol Med. (Maywood). 230, 777-784 (2005).
- Fujiwara, N. Effect of normobaric oxygen therapy in a rat model of intracerebral hemorrhage. Stroke. 42, 1469-1472 (2011).
- Khatibi, N. H. Isoflurane posttreatment reduces brain injury after an intracerebral hemorrhagic stroke in mice. Anesth Analg. 113, 343-348 (2011).
