Summary
Эта статья предусматривает протокол для выращивания рассады в Arabidopsis RootChip, микрофлюидных платформы визуализации, которая сочетает в себе автоматизированного контроля условий роста микроскопических мониторинга корня и FRET-измерительные внутриклеточных метаболитов.
Abstract
Корневых функций, как физическое якорь завода и является органом, ответственным за поглощение воды и минеральных питательных веществ, таких как азот, фосфор, сульфат-и микроэлементов, что растения получают от почвы. Если мы хотим развивать устойчивые подходы к производству высокий урожай, мы должны лучше понять, как корень развивается, занимает широкий спектр питательных веществ, и взаимодействует с симбиотических и патогенных организмов. Для достижения этих целей, мы должны быть в состоянии исследовать корни в микроскопических деталей на сроки от нескольких минут до нескольких дней.
Мы разработали RootChip, полидиметилсилоксана (PDMS) - на основе микрофлюидных устройство, которое позволяет нам расти и изображение корни саженцев Arabidopsis избегая любой физической нагрузки на корнях при подготовке изображений 1 (рис. 1). Устройство содержит раздвоенные структуры канала с участием микромеханических клапаны для направления потока жидкостиРешение от входов в каждой из восьми камер наблюдения 2. Эта система позволяет перфузии корень микросреды необходимо контролировать и модифицировать с точностью и скоростью. Объем камеры составляет около 400 нл, что требует минимального количества исследуемого раствора.
Ниже мы предлагаем подробный протокол для изучения биологии в корень RootChip использование изображений подходы с реальным разрешением по времени. Корни могут быть проанализированы в течение нескольких дней с помощью микроскопа промежуток времени. Корни можно будет озарен питательных растворов или ингибиторов, и до восьми саженцы могут быть проанализированы параллельно. Эта система обладает потенциалом для широкого спектра приложений, в том числе анализ роста корней в присутствии или отсутствии химических веществ, флуоресценция основе анализа экспрессии генов, а также анализ биосенсоров, например FRET-наносенсоров 3.
Protocol
Примечание: Выполните все этапы подготовительных шагов в стерильных условиях.
1. Подготовка пластиковых конусов для прорастания семян
- Заполнить 10 см чашки Петри с питательной среде, содержащей 1% агара до толщины 5 мм. Мы используем вполсилы изменение средней Хогланд 4, но средний состав должен быть выбран в соответствии с индивидуальными требованиями экспериментальный.
- В то время как средний по-прежнему жидкости, использовать многоканальную пипетку, чтобы заполнить 10 мкл наконечники с 5 мкл среды от чашки Петри.
- Храните заполненные советы в поле наконечник пипетки до среды твердыми, затем разрезать на 4 мм длиной шишек пластика и место вертикально в чашку Петри с твердой питательной среде.
2. Прорастание семян и рост проростков
- Поверхностные стерилизации семян в 5% NaOCl в течение 5 минут, промыть трижды стерильной водой, затем поместите одного семени в верхней части каждой среды заполненный конусс.
- Закройте блюдо с микропор ленты (3М) и хранить при температуре 4 ° C для синхронизации прорастания.
- Через три дня, передает пластин к росту кабинет, чтобы начать прорастания. Наши условия роста 23 ° C на 16 часов высокий light/8h темно цикла (Интенсивность света: 100 мкЕ м -2 с -1).
- Между 5 и 7 дней после прорастания, саженцы должны быть готовы для передачи в RootChip. В это время, кончики корней должна быть внизу выходы пластиковых конусов. Проверьте саженец здоровья, длина корня и, если применимо, выражение флуоресцентный маркер при вскрытии микроскопом.
- Отметить отдельных саженцев для передачи на чипе. Выберите десятка саженцев в случае повреждения во время транспортировки.
3. Передача сеянцев на RootChip
- Для стерилизации RootChip для долгосрочных экспериментов, обернитеУстройство в оберточную бумагу, место в чашке Петри, стекла, и автоклав.
- После RootChip остынет, покрыть ее жидкой питательной среде. RootChip должны быть полностью погружены, но уровень жидкости должен быть не более чем на 3 мм выше RootChip поверхности.
- С 20 мкл пипетки, потяните среды через впускной корни и выход камеры, чтобы заполнить камеры наблюдения со средой.
- Конусы пластиковой заглушкой, выбранный в шаге 2,5 в RootChip заливов. Конусов должна плотно прилегать в бухтах. С RootChip устанавливается на тонкий слой из оптического стекла, не прилагайте чрезмерных усилий к чипу.
- Инкубируйте RootChip ночь в жидкой среде. Чтобы предотвратить плавающие, поставить две стеклянные пластинки на чипе. Добавить магнитной мешалкой и закрыть блюдо.
- Передача сборки магнитной мешалкой и осторожно перемешивать среды.
- Входы RootChip в пересекают каналы на угол 30 ° к нормали к устройству ВВСКИlitate рост корней в каналы (рис. 1А). Для дальнейшей поддержки роста в нужном направлении, наклоните сборку немного, поставив стекло в чашку Петри на стороне чипа противоположные точки.
- Чтобы сохранить светлый / темный цикл освещения рассады с кольцевой лампой (Интенсивность света: 100 мкЕ м -2 с -1), подключенных к таймеру.
4. Подключение RootChip Перевозчику
- На следующий день, заполните герметичные, pressurizable флакон с жидкой питательной среде (рис. 1б).
- Обратить кристаллодержатель и поместите его на ровную поверхность. Удалить RootChip из жидкой среды и вставить его PDMS вниз на дно отверстия чип перевозчика. Восток чипа таким образом, чтобы сторона содержащий входы уровень управления сталкивается стороны напорной линии трубы разъемы в боковой стенке перевозчика.
- Высушите крышку стекланижней части чипа, мягко промокательной с папиросной бумагой. Закрепите RootChip перевозчика с лентой и права целого собрания.
- Трубы разъемы сделаны гибкими резки пластиковых труб microbore (Tygon, 0.20 "ID х 0,060" OD) в 5 см кусочки и подключения их к нержавеющей стали microbore труб (New England Тюбик, 0,025 "OD х 0,013" ID х 0,75 " в длину). Заполните трубы разъемы с водой при помощи шприца и подключите разъем каждой трубы в соответствующий входной уровень контроля над чипом. вода позже заполнения каналов управления слой и использоваться для передачи давления на микромеханических клапанов.
- Подключите противоположные концы строк в средствах массовой информации / Решение флакон (ы). Надавите на решение флакон со шприцем воздуха. Увеличение давления воздуха в растворе флакон заставит жидкости в линии.
5. Монтаж RootChip в микроскоп
- Установите носитель на microscОПЕ стадии. Чтобы уменьшить возможность сборки перемещение в течение эксперимента в связи с колебаниями в комнату, то перевозчик должен соответствовать точно в пазы на этапе вставки.
- Чип клапанов и потока среды через чип контролирует давление воздуха. Две линии с регуляторы ответвляется от магистрали давление - один используется для контроля потока рабочей среды по каналам, а другая связана с электромагнитным воздушные клапаны, которые приводят в действие нажатием на клапан управления слой. Электромагнитные клапаны устанавливаются на компьютер через USB-клапанный контроллер (разработан Рафаэль Гомес-Шеберг, Lawrence Berkeley National Lab). Закройте оба регуляторы давления до подключения чипа.
- Добавьте несколько мл воды к водохранилищам перевозчиком сохранить влажность высокая в сборке. Этот шаг должен быть повторен над ходом экспериментов дольше сохранить растения от высыхания. Держите уровень громкости, чтобы минимизировать тОн количества жидкости, что может быть пролита на микроскоп. Для долгосрочных экспериментов, отток из чипа точек можно руководствоваться в водоемах носитель путем подключения чипа выходы на резервуарах с microbore трубы (см. п. 4.4). Кроме того, отток, который накапливается на поверхности чипа могут быть собраны с помощью пипетки.
- Подготовить квадрат листы из прозрачного пластика с листа защиты (C-Line). Закрепите прозрачного пластика для перевозчика двухсторонней ленты для поддержания высокой влажности в сборке.
- Установите кольцо света над чипом и поддерживать свет / темнота цикла. Кольцо света должны быть выключены до начала любой эксперимент, который использует флуоресцентные маркеры, как прямое освещение будет вмешиваться в образ коллекции.
6. Операционная RootChip использованием LabView Интерфейс
Интерфейс RootChip контроллер для программной платформы LabVIEW можетможно скачать с нашего сайта http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip .
- Клапаны на чипе закрыты давления на уровень управления, в данном случае, открыв клапаны воздуха. Контроллер интерфейса позволяет срабатывания клапана, нажав на кнопку ниже клапана номер. Яркий зеленый цвет означает применение давления и закрытия клапана чипе (рис. 2В). Включите все три решения, впускных клапанов в контроллер интерфейса перед открытием регуляторов давления. Примечание: контроллер интерфейса имеет обратную связь, которая позволяет осуществлять мониторинг состояния системы. Эта функция может быть активирована нажатием на "считывание" кнопку контроллера интерфейса.
- Откройте регулятор давления для контроля слой и изначально устанавливается до 15 фунтов на квадратный дюйм, а затем откройте регулятор потока слой и первоначально установлен в 5 фунтов на квадратный дюйм. ЗависимостьДин на требуемый расход, давление может быть скорректирована позже.
- Откройте клапан для роста среднего выбор для очистки камер со средой.
- Проверьте пути потока под микроскопом. Как правило, воздух, попавшие в поток и каналы должны быть удалены. Кроме того, каналы управления по-прежнему содержат слой воздуха, которые должны быть вытеснены и заменены вода из трубы разъемы (тупиковая заполнения). Обе задачи достигается путем промывки каждой из восьми камер в несколько раз (5 фунтов на квадратный дюйм), пока весь воздух вынужден из каналов в PDMS ("дегазация"). Примечание: контроллер интерфейса может быть запрограммирован для автоматизации экспериментов. Такие процедуры могут быть также использованы для дегазации чипа.
7. Представитель Результаты
Основная цель RootChip является сочетание платформы визуализации и перфузии системы в одном устройстве с высоким уровнем интеграции. Чтобы продемонстрировать манипуляциимикроокружения корней мы очистили камеры с темным пищевой краситель (1:4 разбавление в гидропонных среды) и измерил обмен жидкости в камерах. В рекомендуемых давлении 5 бар мы измерили полный обмен в течение 10 секунд рассчитывается расход около 1,5 мкл / мин (рис. 3).
Мы также наблюдали рост корней рассады, в этом случае, выращенных в темноте и поставляется с 10 мМ глюкозы в качестве внешнего источника энергии (рис. 4). В зависимости от условий роста, таких как свет и состав среды, растения можно наблюдать в RootChip на срок до трех дней.
RootChip был использован для контроля внутриклеточных глюкозы и галактозы уровней в корни выражения генетически закодированы наносенсоры на основе Ферстер резонансный перенос энергии (FRET) 5-7. Корни в чип был озарен прямоугольных импульсов глюкозы или галактозы решение ( 
Рисунок 1. RootChip принципе.
Рисунок не в масштабе. (Адаптировано с разрешения Гроссмана и др.., 2011 растительной клетки). 
Рисунок 2. Подключение и монтаж RootChip. 
Рисунок 3. Обмен решения в наблюдении чянтаря. Визуализация обмена жидкости в камере наблюдения использованием раствор красителя. Изображение наложение светлого поля и ложные цвета интенсивность красителя сигнала. 
Рисунок 4. On-чип рост корней. Наблюдение одного растущий корень выражения люминесцентные FRET-наносенсор глюкозы / галактозы в течение 20 часов. Формат времени: чч: мм шкалы: 100 мкм. 
Рисунок 5. Измерение уровня сахара в внутриклеточных использования FRET-наносенсоров.
Discussion
Основные преимущества RootChip сравнению с традиционными методами роста малоинвазивных подготовки к микроскопии, способность обратимо и неоднократно менять корневой окружающей среды и потенциала для непрерывного наблюдения за умственно компетентный и физиологически здоровых тканей в течение нескольких дней. Ранее, саженцы были выращены вертикально геля средств массовой информации и передается перфузии системы непосредственно перед экспериментом, который разрешен только одно измерение корнями в то время 8. Микрофлюидных средства были использованы для Arabidopsis, но на низком уровне интеграции 9 или без перфузии управления 10. RootChip сочетает в себе высокий уровень интеграции с возможностью автоматизации экспериментов по точным руководством потока. Еще одним преимуществом этой платформы, характерные для всех микрожидкостных устройств 11, в том, что только минимальное количество жидкости, необходимый для питания корневой необходимые гайкиrients, даже эксперименты на протяжении нескольких дней. RootChip В настоящее время разработана в качестве одноразовых устройств, но, поскольку издержки производства чипов низки, небольшое количество потребляемых реагентов делает чип еще очень рентабельным.
Есть несколько важных шагов, которые необходимо предпринять, чтобы гарантировать здоровье рассады:
Объем в пластиковых конусов составляет всего 3-4 мкл, который начнет сохнуть на воздухе. Поэтому очень важно, что конусы передаются на чип быстрее и влажность сохраняется высоким до корней достигли камер наблюдения, которые будут снабжать их достаточным количеством воды. Шаги 4,2 до 4,5 должна быть выполнена быстро и без перерывов, чтобы предотвратить высыхание саженцев.
Шаги 3,5 - 3,8 описывают инкубации чипов в жидких средах, в течение которого корни растут в наблюдение камер. Этот шаг может быть пропущен по установке чипа в сarrier немедленно и начать постоянный перфузии питательной среды. Тем не менее, мы рекомендуем замачивания в питательную среду ночью, так как он имеет ряд преимуществ: 1) она создает влажную среду, поэтому саженцы имеют меньше шансов стать сухой, как они растут в камере наблюдения, 2) чип замачивают в жидкости, так дегазации (шаг 6.4) будет быстрее.
Важно использовать средства массовой информации с низкой концентрацией растворенного вещества. Более концентрированные растворы могут ускорить и закупоривают каналы, особенно, если чип используется в течение нескольких дней.
Когда устройство подключено к линии давления, расхода среднего регулируется путем изменения гидравлического давления в клапанах. Для обеспечения надлежащего закрытия микромеханических клапаны, важно выбрать контроля давления, что примерно в три раза выше, чем давление потока. Давление потока не должна превышать 15 фунтов на квадратный дюйм, как жидкость будет выталкиваться из коренных заливов. Более высокие давления мау вызвать отслоение чипе, что делает чип из строя.
Ограничение RootChip в том, что PDMS является пористым и гидрофобные. В то время как материал практически инертны к водным растворам, он может поглощать органические соединения 12. Это может помешать быстрому обмену решениями, органические соединения могут вылиться из материала, даже если поставки этого препарата была остановлена на входе. В связи с пористостью, с использованием органических растворителей может вызвать отек PDMS 12.
Мы продолжаем оптимизировать и расширить RootChip его полезность, например, с корней культурных растений. Мы считаем, что улучшение доступа к корневым для лечения и наблюдения, микрофлюидных инструменты, такие как RootChip откроет новые размеры корневой исследований.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы благодарим Филипп Denninger за помощь в подготовке и видео Bhavna Чаудхури для обеспечения завода линии, экспрессирующие ладу датчиков. Эта работа была поддержана грантами от Национального научного фонда (MCB 1021677), Министерство энергетики (DE-FG02-04ER15542) в WBF, Национальные институты здравоохранения и Медицинского института Говарда Хьюза в SRQGG была поддержана EMBO долго срок общения. ММ при поддержке Фонда Александра фон Гумбольдта.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chip carrier, software and other information. | Carnegie Institution - DPB | CAD and CNC files for carrier fabrication, controller software and further information are available for download from the website http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip Carriers can also be ordered from this website. | |
| RootChip | Stanford Foundry | Mask designs and fabrication protocols are available upon request. Ready-to-use RootChips can be ordered from http://www.stanford.edu/group/foundry/ | |
| Chip controller | Home-built | The automated valve controller system was originally developed by Rafael Gómez-Sjöberg , Lawrence Berkeley National Lab. A detailed instruction how to build your own actuated valve controller can be found at https://sites.google.com/a/lbl.gov/microfluidics-lab/valve-controllers |
References
- Grossmann, G. The RootChip: An Integrated Microfluidic Chip for Plant Science. Plant Cell. 23, 4234-4240 (2011).
- Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288, 113-116 (2000).
- Okumoto, S., Jones, A., Frommer, W. B. Quantitative Imaging with Fluorescent Biosensors: Advanced Tools for Spatiotemporal Analysis of Biodynamics in Cells. Annu. Rev. Plant Biol. , (2012).
- Loqué, D., Lalonde, S., Looger, L. L., von Wirén, N., Frommer, W. B. A cytosolic trans-activation domain essential for ammonium uptake. Nature. 446, 195-198 (2007).
- Okumoto, S. Imaging approach for monitoring cellular metabolites and ions using genetically encoded biosensors. Curr. Opin. Biotechnol. 21, 45-54 (2010).
- Fehr, M., Frommer, W. B., Lalonde, S. Visualization of maltose uptake in living yeast cells by fluorescent nanosensors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 9846-9851 (2002).
- Takanaga, H., Chaudhuri, B., Frommer, W. B. GLUT1 and GLUT9 as major contributors to glucose influx in HepG2 cells identified by a high sensitivity intramolecular FRET glucose sensor. Biochim. Biophys. Acta. 1778, 1091-1099 (2008).
- Chaudhuri, B., Hörmann, F., Frommer, W. B. Dynamic imaging of glucose flux impedance using FRET sensors in wild-type Arabidopsis plants. J. Exp. Bot. 62, 2411-2417 (2011).
- Meier, M., Lucchetta, E. M., Ismagilov, R. F. Chemical stimulation of the Arabidopsis thaliana root using multi-laminar flow on a microfluidic chip. Lab Chip. 10, 2147-2153 (2010).
- Parashar, A., Pandey, S. Plant-in-chip: Microfluidic system for studying root growth and pathogenic interactions in Arabidopsis. Appl. Phys. Lett. 98, 263703-26 (2011).
- Whitesides, G. M. The origins and the future of microfluidics. Nature. 442, 368-373 (2006).
- Lee, J. N., Park, C., Whitesides, G. M. Solvent Compatibility of Poly(dimethylsiloxane)-Based Microfluidic Devices. Anal. Chem. 75, 6544-6554 (2003).
