Time-lapse fluorescensavbildning av Arabidopsis rottillväxt med Rapid Manipulering av Root miljö med hjälp av RootChip

Summary

Den här artikeln innehåller ett protokoll för odling av Arabidopsis plantor i RootChip, en mikroflödessystem imaging plattform som kombinerar automatiserad styrning av odlingsbetingelser med mikroskopisk roten övervakning och FRET-baserad mätning av intracellulära metaboliten nivåer.

Abstract

De root fungerar som den fysiska ankare av anläggningen och är det organ som ansvarar för upptag av vatten och mineraler näringsämnen som kväve, fosfor, sulfat och spårämnen som växterna förvärvar från marken. Om vi ​​vill utveckla hållbara metoder för att producera hög avkastning, måste vi bättre förstå hur roten utvecklas, tar upp ett brett spektrum av näringsämnen och interagerar med symbiotiska och patogena organismer. För att uppnå dessa mål, måste vi kunna utforska rötterna i mikroskopisk detalj under tidsperioder som sträcker sig från minuter till dagar.

Vi utvecklade RootChip, en polydimetylsiloxan (PDMS) - baserad mikroflödessystem enhet, vilket ger oss möjlighet att växa och rötterna bild från Arabidopsis plantor och samtidigt undvika fysisk stress rötterna under beredning för avbildning ¹ (figur 1). Enheten innehåller en tvådelad kanalstruktur med mikromekaniska ventiler för att styra vätskeflödetfrån lösning inlopp till var och en av de åtta observationskammare ^2. Detta perfusion system tillåter roten mikromiljön ska styras och ändras med precision och snabbhet. Volymen av kamrarna är ungefär 400 nl, vilket således kräver endast minimala mängder av testlösningen.

Här erbjuder vi ett detaljerat protokoll för att studera root biologi på RootChip med imaging-baserade metoder i realtid upplösning. Rötter kan analyseras under flera dagar med mikroskopi tid förflutit. Rötter kan perfuseras med näringslösningar eller inhibitorer, och upp till åtta plantor kan analyseras parallellt. Detta system har potential för ett brett spektrum av tillämpningar, inklusive analys av rottillväxten i närvaro eller frånvaro av kemikalier, fluorescens-baserad analys av genuttryck och analys av biosensorer, t.ex. FRET nanosensorer ^3.

Protocol

Obs: Utför alla steg förberedande steg under sterila förhållanden.

1. Beredning av plastkoner för frögroning

1. Fylla en 10 cm petriskål med tillväxtmedium innehållande 1% agar till en tjocklek av 5 mm. Vi använder en halv styrka modifierat Hoagland medium ^4, men mediet sammansättning bör väljas för att passa individuella experimentella behov.
2. Medan mediet fortfarande är flytande, använda en multikanalpipett att fylla 10 mikroliter pipettspetsar med 5 pl av mediet från petriskålen.
3. Förvara de fyllda tips i pipettspetsen rutan tills mediet är fast, klipp till 4 mm långa plast koner och placera stående i en petriskål innehållande fast odlingsmedium.

2. Frögroning och plantproduktion tillväxt

1. Ytan sterilisera frön i 5% NaOCl under 5 min, tvätta tre gånger med sterilt vatten, sedan placera en enda frö på toppen av varje medelstora fyllda kons.
2. Täta skålen med Micropore tejp (3M) och förvara vid 4 ° C för att synkronisera groning.
3. Efter tre dagar överföra plattorna till en ökning skåp för att starta groning. Våra odlingsbetingelser är 23 ° C vid en 16h hög light/8h mörker cykel (ljusintensitet: 100 μE m ^-2 s ^-1).
4. Mellan 5 och 7 dagar efter groning, bör de späda plantorna vara redo för överföring till RootChip. Vid denna tidpunkt bör rotspetsar vara nära de nedre utloppen från plastkoner. Kontrollera planta hälsa, rot längd och, i förekommande fall, uttryck för en fluorescerande markör under ett dissektionsmikroskop.
5. Markera enskilda plantor för överföring på chipet. Välj ett tiotal plantor ifall en skadas under överföringen.

3. Överföring av plantor på RootChip

1. Att sterilisera RootChip för långsiktiga experiment, lindaenheten i silkespapper, plats i ett glas petriskål och autoklav.
2. När RootChip har svalnat, täck den med flytande odlingsmedium. Den RootChip ska vara helt nedsänkt, men vätskenivån bör inte vara mer än 3 mm ovanför RootChip ytan.
3. Med en 20 ^ pipett, dra medium genom roten inlopp och utlopp för att fylla observation kammaren med medium.
4. Plug plast koner valde i steg 2,5 i RootChip inloppen. Konerna bör passa tätt i vikarna. Eftersom RootChip är monterad på ett tunt lager av optiskt glas, gäller inte för mycket tryck på chipet.
5. Inkubera RootChip över natten i flytande medium. För att förhindra flytande genom att placera två glasskivor på chipet. Tillsätt en magnetisk omrörarstav och stänga formen.
6. Överföra anordningen till en magnetisk omrörare och försiktigt skaka mediet.
7. Den RootChip s inlopp skär kanalerna i 30 ° vinkel till enheten normal till Facilitate rottillväxt in i kanalerna (Figur 1A). För att ytterligare stödja tillväxt i den önskade riktningen, luta anordningen lätt genom att placera en glasskiva under petriskål på den sida av chipet motsatta av utloppen.
8. För att upprätthålla ljus / mörker-cykel belysa plantorna med en ring lampa (Ljus intensitet: 100 μE m ^-2 s ^-1) är ansluten till en timer.

4. Ansluta RootChip till Carrier

1. Följande dag, fylla en förslutbar, trycksättbar flaska med flytande odlingsmedium (Figur 1B).
2. Vänd chipshållaren och placera den på ett stabilt underlag. Avlägsna RootChip från det flytande mediet och för in den PDMS sidan nedåt i botten öppningen av chipsbäraren. Orientera chipet, så att den sida som innehåller inloppen reglerskiktet är vänd mot sidan av slangen tryckledningen kontaktdon i bäraren sidoväggen.
3. Torka locket glaset påbotten av chipset genom att försiktigt blotting med läskpapper. Fäst RootChip till transportören med tejp och höger hela församlingen.
4. Slangar kontakter görs genom att skära flexibel plast mikrodiameter slang (Tygon, 0,20 "ID x 0,060" OD) i 5 cm långa bitar och ansluta dem till rostfritt stål mikrodiameter rör (New England litet rör, 0,025 "OD x 0,013" ID x 0,75 " lång). Fyll slangen kontakterna med vatten med hjälp av en spruta och plugg varje slang kontakten till motsvarande kontroll lagret inloppet på chipet. Vattnet kommer senare att fylla kanalerna kontroll lagret och kan användas för att överföra trycket till mikromekaniska ventiler.
5. Ansluter de motsatta ändarna av linjerna i mediet / lösning ampull (er). Applicera tryck på lösningen flaskan med en spruta med luft. Den ökade lufttrycket i lösningen flaskan kommer att tvinga vätska i ledningarna.

5. Montering av RootChip vid Mikroskop

1. Placera buren på Microscopa stadium. För att minska risken för församlingen att flytta under loppet av experimentet på grund av vibrationer i rummet bör bäraren passar in exakt i spåren av scenen insatsen.
2. Chip ventiler och flödet av mediet genom chipet styrs av lufttryck. Två rader med regulatorer avgrenas av en huvud tryckledning - en används för att styra mediet strömma genom kanalerna, och den andra är ansluten till solenoidventiler luft att ansätta tryck upp ventil för kontroll-skiktet. Magnetventilerna drivs från datorn via USB-ventilstyrdonet (utvecklad av Rafael Gómez-Sjöberg, Lawrence Berkeley National Lab). Stäng båda tryckregulatorer innan du ansluter chip.
3. Tillsätt några ml vatten till reservoarer av bäraren för att hålla fuktigheten hög i enheten. Detta steg bör upprepas under loppet av längre experiment för att hålla växterna inte torkar ut. Håll låg volym för att minimera than mängd vätska som kan spillas på mikroskopet. För långsiktiga experiment kan utflödet från chipet butiker styras in i reservoarer hos bäraren genom att ansluta chip butiker att behållarna med mikrodiameter slangar (se steg 4,4). Alternativt, kan utflödet som ackumuleras på spånytan samlas genom pipettering.
4. Förbered kvadrerade ark av transparent plast från ark beskyddare (C-Line). Fixera den transparenta plasten till bäraren genom dubbelsidig tejp för att bibehålla hög fuktighet i aggregatet.
5. Positionera ringen ljus över chipet och bibehålla ljus / mörker-cykel. Ringen ljuset ska stängas av innan starten av något experiment som använder fluorescerande markörer, som direkt belysning stör bildsamling.

6. Använda RootChip med LabView Interface

Den RootChip styrgränssnitt för LabView mjukvaruplattform kanladdas ner från vår hemsida http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip .

1. Ventilerna på chipet är stängda genom att anbringa tryck på reglerskiktet, i detta fall genom att öppna ventilerna solenoid luft. Regulatorn gränssnittet kan aktivering av ventilerna genom att klicka på knappen under ventilens nummer. Klargrön indikerar applicering av tryck och stängning av ett chip ventil (figur 2B). Aktivera alla tre lösningsorienterad insugningsventilerna i regulatorn gränssnittet innan du öppnar tryckregulatorer. Obs! Styrgränssnitt har en feedback-loop som tillåter övervakning av systemets status. Denna funktion kan aktiveras genom att klicka på "återläsning"-knappen i regulatorn gränssnittet.
2. Öppna tryckregulatorn för kontroll lagret och initialt satt till 15 psi, öppna regulatorn för flödet lagret och initialt satt till 5 psi. Beroenende på den önskade flödeshastigheten, kan trycken justeras senare.
3. Öppna inloppsventilen för tillväxtmediet av val för att spola kammaren med medium.
4. Kontrollera flödesvägar under mikroskop. Typiskt luft fångad i flödeskanalerna och måste avlägsnas. Dessutom är kanalerna i kontrollgruppen skiktet innehåller fortfarande luft som måste pressas ut och ersättas med vatten från röret kontaktdon (dead-end fyllning). Båda uppgifterna uppnås genom spolning var och en av de åtta kamrar flera gånger (5 psi) tills all luft tvingats från kanalerna i PDMS ("avgasning"). Obs! Styrgränssnitt kan programmeras för att automatisera experiment. Sådana rutiner kan också användas för att avgasa chipet.

7. Representativa resultat

Det främsta syftet med RootChip är att kombinera en avbildning plattform och en perfusion system i en enda enhet med en hög grad av integration. För att demonstrera manipuleringav mikroomgivningen av rötter vi sköljas kamrarna med mörk karamellfärg (1:4 spädning i hydrokultur medium) och mätte utbyte av vätska i kamrarna. Vid den rekommenderade trycket 5 psi mätte vi en fullständig utväxling inom 10 sekunder vid en beräknad flödeshastighet av cirka 1,5 | il / min (figur 3).

Vi observerade också att rottillväxt av plantor, i detta fall odlas i mörker och levereras med 10 mM glukos som en extern energikälla (Figur 4). Beroende på de tillväxtfaktorer som ljus och sammansättningen av det medium, kan växter observeras i RootChip upp till tre dagar.

Den RootChip har använts för att övervaka den intracellulära glukos och galaktos nivåer i rötter som uttrycker genetiskt kodade nanosensorer, baserat på Förster-energiöverföring (FRET) ^5-7. Rötter i chipet perfunderades med fyrkantiga pulser av glukos eller galaktos lösning (

Figur 1. RootChip princip.

1. Den RootChip har åtta observationer kammare för tillväxt och avbildning av rötter. Fröna gror först i plast koner - tillverkat av plast pipettspetsar - som är fyllda med fast medium. Den rotspets växer genom mediet och når kammaren där ett kontinuerligt flöde av flytande medium behåller betingelserna i kammaren konstant. Mikromekaniska ventiler (röd) styr flödet. Chipet är monterat på en optisk täckglas.
   Ritning inte i skala. (Anpassad med tillstånd från Grossmann et al., 2011 Plant Cell.)
2. SchEME av en trycksättningsbar lösning flaska med membranet (röd).

Figur 2. Anslutning och montering av RootChip.

1. Vy uppifrån av den fullt anslutna RootChip och bärare monterad på ett inverterat mikroskop.
2. Schema som illustrerar ventilsystemet och styrenheten gränssnittet. Ett exempel på en ventil inställning för att styra vätskeflödet till en enda kammare som visas. Även ventilerna 4 till 8 fungerar som enskilda ventiler, ventiler 0 till 3 lagen i grupp. Med detta system en enskild kammare kan adresseras genom att aktivera en kombination av ventiler.

Figur 3. Utbyte av lösningar i observationen lmAmbers. Visualisering av utbytet av vätska i en observation kammare med färglösningen. Bilden är en överlagring av ljusfält och falsk-färgad intensitet färgsignal.

Figur 4. On-chip rottillväxt. Observation av en enda ökande rot uttryckande en fluorescerande FRET Nanosensorn för glukos / galaktos under loppet av 20h. Tidsformat: hh: mm, skala bar: 100 nm.

Figur 5. Mätning av intracellulära socker nivåer med hjälp FRET nanosensorer.

1. Mängden av sensorn visas som citrin intensitet inom rotspets (vänster). Svaret hos den intracellulära FRET Nanosensorn tillämpningen av glukos eller galaktos lösning visas som kvotmetriska bilder. (Anpassad med tillstånd från Grossmann et al., 2011 Plant Cell) Skala bar. 100 nm.
2. Spårande FRET utväxlingsändringar som ett svar på tre upprepade fyrkantpulser av glukos (grön) och galaktos (röd).

Discussion

De huvudsakliga fördelarna med RootChip jämfört med konventionella odlingsmetoder är den minimalt invasiva förberedelse för mikroskopi, förmågan att reversibelt och upprepade gånger ändrar roten miljö, och kapaciteten för kontinuerlig observation av utvecklingsmässigt kompetenta och fysiologiskt frisk vävnad under en period av flera dagar. Tidigare var plantorna växa vertikalt på gelade media och överförs till en perfusionssystem omedelbart före försöket, som endast tillät att mäta enstaka rötter i taget ^8. Mikroflödessystem verktyg har använts för Arabidopsis, men på en låg integration nivå ⁹ eller utan perfusion kontroll ^10. Den RootChip kombinerar en hög grad av integration med förmågan att automatisera experiment genom noggrann flödet vägledning. En annan fördel med denna plattform, karakteristisk för alla mikroflödessystem enheter ^11, är att endast minimala mängder vätska skyldiga att lämna roten med nödvändig mutternrients, även för experiment som spänner över flera dagar. Den RootChip närvarande utformad som en engångsbruk enhet, men eftersom produktionskostnaderna för chips är låga, gör små mängder som konsumeras reagenser chipet fortfarande mycket kostnadseffektivt.

Det finns några viktiga steg som måste vidtas för att garantera hälsa plantor:

Volymen i plastkoner är endast 3-4 | il, vilket kommer att börja torka vid exponering för luft. Följaktligen är det kritiskt att konerna överförs på chipset snabbt och fuktighet hålls hög tills rötterna har nått observationskammare och som kommer att leverera dem med tillräcklig mängd vatten. Steg 4.2 till 4,5 bör utföras snabbt och utan avbrott för att förhindra uttorkning av plantorna.

Steg 3,5 - 3,8 beskriva inkubering av chip på flytande medier under vilken rötterna växer in i observation kamrarna. Detta steg kan hoppas över genom att montera chip i Carrier omedelbart och börjar ständigt perfusion med tillväxt medium. Vi rekommenderar dock blötläggning i odlingsmedium över natten, eftersom det har vissa fördelar: 1) det skapar en fuktig miljö så plantorna är mindre risk att bli uttorkad när de växer in observationen kammaren, 2) chip är indränkt i flytande så avgasning (steg 6,4) kommer att bli snabbare.

Det är viktigt att använda medier med låga koncentrationer av lösta ämnen. Mer koncentrerade lösningar kan fälla ut och sätta igen kanalerna, i synnerhet om chip används under flera dagar.

När enheten är ansluten till tryckluftledningen, är flödet av mediet regleras genom att ändra hydraultryck i ventilerna. Att säkerställa en korrekt stängning av mikromekaniska ventiler, är det viktigt att välja en kontroll tryck som är cirka tre gånger högre än flödet trycket. Flödet tryck bör inte överstiga 15 psi då fluiden kommer att tryckas ut från rot inloppen. Högre tryck may orsakar också delaminering av chipet, vilket gör chipet oanvändbar.

En begränsning av RootChip är att PDMS är porös och hydrofob. Medan materialet är praktiskt taget inert mot vattenlösningar, kan det absorbera organiska föreningar ^12. Detta kan störa ett snabbt utbyte av lösningar som organiska föreningar kan läcka från materialet, även när tillförseln av denna förening har stoppats vid inloppet. På grund av den porositet, kan användning av organiska lösningsmedel orsakar svallning av PDMS ^12.

Vi fortsätter att optimera RootChip och utöka dess användbarhet, till exempel med rötter grödor. Vi tror att genom att förbättra tillgången till roten för behandling och observation kommer mikroflödessystem verktyg som RootChip öppnar nya dimensioner rot forskning.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chip carrier, software and other information.	Carnegie Institution - DPB	CAD and CNC files for carrier fabrication, controller software and further information are available for download from the website http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip Carriers can also be ordered from this website.
RootChip	Stanford Foundry	Mask designs and fabrication protocols are available upon request. Ready-to-use RootChips can be ordered from http://www.stanford.edu/group/foundry/
Chip controller	Home-built	The automated valve controller system was originally developed by Rafael Gómez-Sjöberg , Lawrence Berkeley National Lab. A detailed instruction how to build your own actuated valve controller can be found at https://sites.google.com/a/lbl.gov/microfluidics-lab/valve-controllers