Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

التحليل الكمي من Proteomes الكروماتين في الأمراض

Published: December 28, 2012 doi: 10.3791/4294
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2,3, 1,4
1Department of Anesthesiology, David Geffen School of Medicine at UCLA, 2Department of Medicine, David Geffen School of Medicine at UCLA, 3Department of Physiology, David Geffen School of Medicine at UCLA, 4Department of Internal Medicine, Nora Eccles Harrison Cardiovascular Research and Training Institute, University of Utah

Summary

وقد سمح التقدم في مطياف الكتلة لتحليل إنتاجية عالية البروتين التعبير والتعديل على مجموعة من الأنسجة. جنبا إلى جنب مع تجزئة التحت خلوية ونماذج المرض والكتلة الطيفي الكمي والمعلوماتية الحيوية يمكن أن تكشف عن خصائص جديدة في النظم البيولوجية. الطريقة الموضحة هنا يحلل لونين البروتينات المرتبطة في تحديد أمراض القلب وينطبق بسهولة إلى أخرى

Abstract

في النواة الموجودة في proteomes التي هي الأكثر ارتباطا وثيقا وظائف مرتبطة مع تنظيم الجينات. الكبار نوى cardiomyocyte الثدييات هي فريدة من نوعها نظرا لنسبة عالية من الخلايا binucleated، 1 heterochromatic الدولة في الغالب من الحمض النووي، وطبيعة تقسيم غير من cardiomyocyte مما يجعل نوى الكبار في حالة دائمة من الطور البيني .. 2 تنظيم الترانسكربتي خلال تطوير و وقد المرض مدروسة في هذا الجهاز، 3-5 ولكن ما زال غير مستكشفة نسبيا هو الدور الذي تقوم به البروتينات النووية المسؤولة عن التعبئة والتغليف DNA والتعبير، وكيف يمكن لهذه البروتينات السيطرة تغييرات في برامج النسخ التي تحدث أثناء المرض. 6 في تطوير العالم، وأمراض القلب هي السبب الأول للوفيات لكل من الرجال والنساء .. 7 انسايت حول كيفية البروتينات النووية لتنظيم التعاون تطور هذا المرض أمر بالغ الأهمية للنهوض الحالية س العلاجيارات.

قياس الطيف الكتلي هو الأداة المثالية لمعالجة هذه الأسئلة لأنها تسمح للتعليق توضيحي متحيز للبروتيوم الكمي النووية والنسبية لكيفية وفرة من هذه البروتينات مع التغيرات المرض. في حين كانت هناك دراسات عدة عن البروتين البروتين الثدييات المجمعات النووية، 8-13 وحتى وقت قريب كان هناك 14 دراسة واحدة فقط فحص القلب النووي بروتيوم، وأنها تعتبر نواة بأكملها، بدلا من استكشاف بروتيوم على مستوى حجرات فرعية النووية 15 في جزء كبير منه، هذا النقص في العمل ويرجع ذلك إلى صعوبة عزل نواة القلب. نوى القلب تحدث داخل جهاز أكتين الميوسين-جامدة وكثيفة لأنها التي ترتبط عبر ملحقات متعددة من الشبكة الإندوبلازمية، إلى الحد الذي يغير شكل خلية عضلية تقلص بشكل عام 16 بالإضافة إلى ذلك، cardiomyocytes هي 40٪ من حيث الحجم الميتوكوندريا 17 الذي necessitaقسم التدريب والامتحانات إثراء النواة وبصرف النظر عن العضيات الأخرى. نحن هنا وصف بروتوكول للتخصيب النووي وتجزئة القلب الى مزيد من حجرات بيولوجيا ذات الصلة. وعلاوة على ذلك، فإننا طرق بالتفصيل لتسمية خالية تشريح الشامل الكمي الطيفي لهذه الكسور تقنيات قابلة للتجريب في الجسم الحي في النماذج الحيوانية المختلفة وأجهزة الجسم حيث وضع العلامات الأيضية ليست مجدية.

Protocol

سير العمل التجريبي يحتوي على سبع خطوات رئيسية (الشكل 1). لأي عمل يستدعي العينات التي سيتم تشغيلها على مطياف الكتلة، يجب أن مجرب ارتداء معطف المختبر وقفازات وصافي الشعر والعناية لتجنب التلوث من الغبار وسفك الشخصية من الكيراتين.

1. التجانس القلب والعزلة النووية

والمتجانس قلوب الماوس ومعزولة وسليمة بيليه نوى (الشكل 2).

  1. التضحية الماوس الكبار، واستئصال القلب وشطف في الجليد الباردة PBS، والتجانس على الجليد في dounce الزجاج (ونحن نفضل مطحنة الأنسجة ويتون من فيشر، # 08-414-13A، ولكن وسائل أخرى قد تعمل بشكل جيد على قدم المساواة) التي تحتوي على 2 مل من تحلل العازلة (ناقص التوتر الذي حل lyses تفاضلي غشاء الخلية على العضيات بما في ذلك النواة) (10 ملي تريس درجة الحموضة 7.5، 15 مم كلوريد الصوديوم، و0.15٪ V / V-40 P Nonidet [40-NP] في الماء منزوع الأيونات زائد البروتيني والفوسفاتيز طويمكن تخزين العازلة تحلل لمدة تصل إلى أسبوع واحد في -20 ° C - 10 الزبدات الصوديوم ملم و 0.1 ملم فلوريد phenylmethylsulfonyl [PMSF]، 0.2 مم نا 3 VO 4، 0.1 مم و 1 ناف روش البروتيني مل pellet/10: خليط nhibitor ). (ملاحظة: نحن لا نجد من الضروري أن يروي قلوب مع PBS، والبيانات المتوفرة لدينا مطياف الكتلة وتحليل GO تحديد البروتينات كما يغلب عليها الطابع cardiomyocyte [ف قيمة 3.8E-22] في الأصل بدلا من تلوث الدم قيمة P [5.0 E-2].)
  2. صب حلالة من خلال مصفاة ميكرومتر 100 و جمع من خلال تدفق في 1.5 مل أنبوب الطرد المركزي. عند هذه النقطة، ما لم ينص على ذلك، ينبغي الاحتفاظ العينة على الجليد.
  3. أجهزة الطرد المركزي في 4،000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق في C. ° 4
  4. إزالة طاف. (هذا هو العصارة الخلوية، ويجب أن يتم تخزين في -80 ° C. وهو يحتوي على الميتوكوندريا هي lysed.) إعادة تعليق بيليه في 200 ميكرولتر العازلة تحلل من قبل الطحن. (هذا هو بيليه الخام النووية.)
  5. ملء 1،5 مل أنبوب الطرد المركزي مع 1 مل من السكروز برتقاليإيه (24٪ سكروز الوزن / الحجم، 10 ملي تريس درجة الحموضة 7.5، وكلوريد الصوديوم 15 مم في الماء منزوع الأيونات مع البروتيني / الفوسفاتيز خليط المانع - ينبغي بذل العازلة السكروز النقي في اليوم للاستخدام). طبقة بلطف بيليه معلق في أعلى لوحة السكروز وأجهزة الطرد المركزي في 5،000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقيقة في C. ° 4
  6. إزالة طبقة رقيقة على رأس وكذلك لوحة السكروز (التي تحتوي على الغشاء). شطف بيليه المتبقية مع 200 PBS الجليد الباردة ميكرولتر / EDTA (1X PBS مع EDTA ملي 1). (هذا هو بيليه نوى ويمكن solubilized أو ثابتة لاستخدامها في المجهر الإلكترون أو النشاف الغربية [انظر الخطوات 4.1 و 4.2] لتحديد التخصيب.)

2. جبلة النواة والمنظفات المستخرج تجزئة الكروماتين

يتم فصل كريات النوى الخام في جبلة النواة والمنظفات، استخراج جزء لونين، تتضمن البروتينات المرتبطة بشكل فضفاض مع DNA.

  1. يسحن بيليه من الخطوة 1.6 في 200 ميكرولتر العازلة المنظفات استخراج (20 ملي HEPES 7.6 أس هيدروجيني، 7.5 ملم MgCl 2. ويمكن تخزين المنظفات العازلة استخراج لمدة تصل إلى أسبوع واحد في -20 ° C) - 0.2 ملم EDTA، 30 مم كلوريد الصوديوم، 1 M اليوريا، 1٪ NP-40 في الماء منزوع الأيونات مع البروتيني / الفوسفاتيز خليط المانع.
  2. دوامة عينة 2 مرات، كل 10 ثانية. مكان على الجليد 10 دقيقة.
  3. أجهزة الطرد المركزي في 13000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق في C. ° 4
  4. إزالة طاف. (هذا هو جبلة النواة ويجب أن يتم تخزين في C ° -80). شطف مع بيليه الجليد الباردة PBS / EDTA. (هذا هو بيليه لونين.)
  5. يسحن بيليه في 300 ميكرولتر تريس، SDS، EDTA العازلة (50 ملي تريس درجة الحموضة 7.4، 10 ملم EDTA، 1٪ SDS في الماء منزوع الأيونات مع البروتيني / الفوسفاتيز خليط المانع - تريس، SDS، يمكن أن تظل EDTA العازلة لمدة تصل إلى أسبوع واحد في -20 ° C).
  6. يصوتن 3-6 مرات لمدة 10 ثانية كل لتفريق DNA. الحفاظ على عينة الجليد بين sonications.
  7. أجهزة الطرد المركزي في 13000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق في C. ° 4 إبقاء طاف. (طاف هو المنظفات-المستخرج لونين البروتين fractioيجب أن تبقى في C N ° و-80). ينبغي أن بيليه المتبقية تكون صغيرة ويمكن التخلص منها.
  8. إذا باستخدام myocytes معزولة بدلا من قلب كله: عزل الوليد myocytes البطين الفئران الفئران من الجراء يوم واحد بعد الولادة باستخدام الهضم الأنزيمي، تليها الثقافة في النسر Dulbecco المتوسطة المعدلة (DMEM) مع مصل بقري جنيني 10٪ (FBS)، الأنسولين 1٪ ترانسفيرين-الصوديوم سيلينيت (ITS)، و 1٪ البنسلين. بعد 24 ساعة، ونقل إلى المصل خالية من وسائل الإعلام (نفس النحو الوارد أعلاه، ولكنها تفتقر FBS). الحصاد في خلايا العازلة تحلل (المدرجة في 1.1)، والبدء في الخطوة تجزئة النووية 1.3.

3. استخراج حمض تجزئة - DNA البروتين محدد التخصيب

A يثري تجزئة منفصلة عن البروتينات بإحكام إلى DNA، بما في ذلك الهستونات.

  1. كرر الخطوات 1،1-2،4.
  2. يسحن على بيليه في 400 ميكرولتر لونين قدرها 0.4 حامض الكبريتيك N. دوامة لإزالة كتل.
  3. احتضان في C ° 4 لمدة 30 دقيقة أو overnآيت حين تناوب.
  4. الطرد المركزي في 16000 XG لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية لإزالة الحطام النووية.
  5. نقل طاف لأنبوب جديد.
  6. إضافة 132 ميكرولتر من حمض الخليك ثلاثي الكلور إلى انخفاض طاف الحكيم. قلب عدة مرات. احتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة.
  7. الطرد المركزي في 16000 XG لمدة 10 دقيقة في C. ° 4
  8. تجاهل طاف. شطف بلطف مع بيليه الجليد الباردة الأسيتون. (هذا هو بيليه هيستون.)
  9. الطرد المركزي في 16000 XG لمدة 10 دقيقة في C. ° 4
  10. تكرار غسل، الخطوات 3،8-3،9.
  11. الهواء الجاف بيليه.
  12. إعادة تعليق بيليه في 100 ميكرولتر من تريس، SDS، EDTA العازلة. تعيين درجة الحموضة إلى 8 بإضافة 1 M تريس. (استخدم الأسهم (أ) 1 M تريس غير المعدلة وفقا للدرجة الحموضة).
  13. يصوتن في حمام مائي لمدة 15 دقيقة. منع الانهاك عن طريق إضافة الثلج للحمام الماء. (وهذا هو جزء حمض المستخرجة ويجب أن يتم تخزين في درجة مئوية -80)

4. نقاء تحقق

البقع الغربية والمجهر الإلكترونيتؤكد تخصيب الناجح لنواة واستنزاف العضيات الأخرى. لرؤية نتائج نموذجية لجميع المقايسات مراقبة الجودة التالية، يرجى الاطلاع على نشر رسائلنا السابقة 18

  1. أداء الغربية تحليل لطخة. غشاء التحقيق تحتوي على كل جزء لH2A هيستون أو nucleoporin P62 (كعلامات النووية للتحقق من التخصيب)، ونقل عن النوكليوتيدات الأدينين، BIP وتويولين (كعلامة الميتوكوندريا، هيولي باطني علامة شبكية، وعلامة هيكل الخلية على التوالي للتحقق من نقاء). للتحقق من subfractionation الناجح للمسبار، نواة لH3 هيستون أو fibrillarin (المنظفات والمواد الحمضية المستخرجة نواة لونين وسليمة) وSNRP70 أو E2F (جبلة النواة). دقق في الشبكية أو محرض نقص الأكسجة عامل-1 (المخصب في الكروماتين المنظفات استخراج أكثر من حمض المستخرج آسر). ويمكن أيضا التحكم في عينات إضافية من الخلايا المحللة وهيلا كله المحللة القلب يتم تشغيلها في نفس الجل: إعداد التحكم هيلا lysate الخلية عن طريق إضافة تريس، SDS، EDTA عازلة لصحن الثقافة واستخدام مكشطة الخلية لجمع العينة. يصوتن وأجهزة الطرد المركزي كما هو الحال في نموذج الخطوات 2،6-2،7. إعداد كامل السيطرة المحللة القلب بنسبة المجانسة في قلب مل العازلة 2 (20 ملي تريس درجة الحموضة 7.4، 150 مم كلوريد الصوديوم، EDTA 1 ملم، 1 ملم EGTA، 1٪ تريتون X-100، بيروفوسفات الصوديوم 2.5 ملم، 1 ملم في المياه جليسروفوسفات منزوع الأيونات مع البروتيني والفوسفاتيز خليط المانع). يصوتن وأجهزة الطرد المركزي كما هو الحال في الخطوات 2،6-2،7. انظر الخطوة 5 لإعداد العينات للبروتين SDS-PAGE.
  2. المجهر الإلكتروني: إعادة تعليق بيليه نواة من 1.6 في خطوة تحلل العازلة التي تحتوي على 2٪ gluteraldehyde وتحديد العينة عند 4 ° C. شطف عينات الحمض في الأوسميك، يذوى، وتغرس في راتنجات الايبوكسي. قطع شرائح نانومتر باستخدام 70 Ultracut رايشرت مشراح مستدق. وصمة عار في عينات خلات اليورانيل ثم الرصاص والصورة باستخدام JEOL انتقال الإلكترون 100CX المجهر. تحديد تخصيب عن طريق قياس مجال نواة سليمة مقابل المساحة الإجمالية من المواد المصورة. نجد 60-80٪ من النوى إلىتكون سليمة 14

اعتبارات هامة لتخصيب مقابل تنقية نوى. وقد تم تطوير هذا البروتوكول لتمكينها من التحليلات البروتين لونين من القلب لغرض دراسة العمليات العالمية خلال تنظيم الجينات المرض. ومن العناصر الرئيسية في تصميم كامل بروتيوم تجارب مطياف الكتلة هي قضية النطاق الديناميكي والقدرة على تحديد وتوصيف المنخفضة وفرة البروتينات. بالإضافة إلى الهدف الأساسي من توفير المعلومات عن الأحياء النووية ومحددة لونين، وإثراء للبروتيوم النووية، ويزيد من احتمالية الكشف عن هذه البروتينات المنخفضة وفرة، كما يفعل subfractionation المزيد من النوى. ومع ذلك، كما تمت مناقشته، وcardiomyocyte الكبار على عنصر كثيفة هيكل الخلية مرتبطة الغشاء النووي. ونحن لا نعتقد أن لدينا تنقيته تماما من مكونات نواة هذه الخلايا الأخرى. ومع ذلك، من خلال إثراء فقط للنواة، لدينا الحصول علىإد وصف عتبة مقبولة لتمكين أنواع من التحليلات.

على وجه التحديد، وقد استخدمنا EM لتقييم نقاء نواة لدينا بيليه الخام وجدت 60-80٪ من الكسر ليكون نواة سليمة، ما يقرب من 10٪ الميتوكوندريا، وبقية الحطام. بالإضافة إلى ذلك، ونحن نعلم من دراستنا السابقة على السكان نواة سليمة، أنه في حين لا المخصب لل myofilaments العديد من هذا البروتوكول (بما في ذلك تويولين والأكتين التي تقاس الغربية) بروتينات معينة (calsarcin-1) هي المخصب، مما يشير إلى السكان صحيح البيولوجي لل هذه البروتينات في نواة القلب 19

بالإضافة إلى ذلك، قارنا البروتينات وجدنا أن تكون موجودة في جزء لونين حمض المستخرج، إلى الأدوار المتوقعة من هذه البروتينات من الأنطولوجيا الجينات. الأهم من ذلك، هذا التحليل الجيني الأنطولوجيا لا يأخذ بعين الاعتبار الوفرة النسبية من البروتينات المختلفة (كما يفعل البيانات المتوفرة لدينا لطخة غربية) لكنها تعتمد بدلا عن البروتينات المحددة (تخصيبإد أم لا) على قدم المساواة عند تحديد مسارات مشتركة ومقصورات الخلوية. ويمكن الاطلاع على تحليل هذه المسارات ومقصورات الخلوية في منشوراتنا السابقة. 18،20 الأهم من ذلك أن نجاح التخصيب في جزء لونين حمض المستخرج سمح لنا للتعرف على وجود متغيرات من 54 هيستون في خلية عضلية الماوس الكبار، 18 اعتمد كثير منها على واحدة فريدة من نوعها لتحديد الببتيد، وبالتالي من المحتمل أن لا تم كشفها هذا البروتوكول دون تخصيب نظرا لتعقيد هائلة من بروتيوم cardiomyocyte الإجمالي. من البروتينات وجدناها 1048 من نواة القلب، وكانت 56 من هذه (5.3٪) المشروح بواسطة التحليل لتكون جزءا من النيوكليوسومات (أحد مكونات نواة الفائدة). دراسة أخرى تبحث في قلب كله، حددت 6180 البروتينات، والتي فقط 11 البروتينات (0.18٪) كانت المشروح لتكون جزءا من ال 21 النيوكليوسومات. هذا يوضح زيادة قوة جهدنا لبروتوكول meaningfuLLY إثراء للبروتينات نووية.

5. جل البروتين وهضم البروتينات الأنزيمية

يتم فصل البروتينات واحد الأبعاد SDS-PAGE والتربسين هضم ليتم تشغيلها على مطياف الكتلة.

  1. ذوبان الجليد على الجليد وعينات تحديد تركيز البروتين لكل عينة باستخدام حمض bicinchoninic (BCA) فحص البروتين.
  2. تخفيف عينات إلى تركيز المعروفة باستخدام 5X Laemmli العازلة، يغلي لمدة 10 دقيقة وتخزينها في -20 درجة مئوية لمدة الأبعاد SDS-PAGE. تخفيف عينات إلى تركيز اليوريا المعروف باستخدام العازلة استخراج وتخزينها في -20 درجة مئوية لمدة الأبعاد المواد الهلامية.
  3. تشغيل هلام في الاختيار تحميل كمية متساوية من البروتين في كل حارة. يمكن نقل البروتين إلى غشاء النيتروسليلوز لاستخدامها في النشاف الغربية (كما هو الحال مع عناصر التحكم في الخطوة 4.1) أو يمكن خفض نطاقات لتحليل الطيف الكتلي، وانظر الخطوات التالية.
  4. إزالة هلام من جهاز باستخدام الماء منزوع الأيونات نقله إلى وعاء نظيف.تغطية جل في الصفارية وصمة عار، والتفاف الحاويات في رقائق الألومنيوم لمنع الضوء. السماح لاحتضان جل في درجة حرارة الغرفة على شاكر لمدة لا تقل 90 دقيقة.
  5. الصورة الملطخة الصفارية هلام (الشكل 3) استخدام ضوء الأشعة فوق البنفسجية، وعلامة حيث سيتم قطع العصابات على الصورة. قطع كل منا في حارة 2-العصابات حوالي 25 ملم للدراسات قياس بروتيوم الإجمالي.
  6. وضع الجل على سطح نظيف. استخدام المواد الوحيدة التي ظلت مختومة أو يتم رش مع الايثانول لمنع التلوث الكيراتين. قطع كل نطاق، ومن ثم شريحة كذلك إلى 3 أقسام متساوية. وضع جميع القطع الثلاث معا في كل نطاق منها صفت أنبوب مل 1.5. ويمكن تخزين القطع هلام في -20 درجة مئوية لمدة عدة أشهر.
  7. إعداد المقابس هلام لعملية الهضم الأنزيمي. خلاصة هلام باستخدام قطعة التربسين عند 37 درجة مئوية خلال الليل. لبروتوكول مفصلة جل عينة انظر نشر رسائلنا السابقة. 22 يمكنك الهضم منخفضة الوزن الجزيئي مع العصابات كيموتربسين بدلا من التربسين،للقضاء على الانقسام التربسين الواسعة من ذيول هيستون.

6. قياس الطيف الكتلي وتحليل البيانات

يتم فصل العينات على وتحليلها بواسطة LC MS / MS. يتم البحث الأطياف مقابل قاعدة بيانات لتحديد البروتين البروتين.

  1. تشغيل 10 ميكرولتر من كل عينة من خلال LC / MS / MS. نستخدم النانو تدفق Eskigent LC مع عمود ميكرون 75 مرحلة عكسي. استخدام التشغيل LC الأمثل لمجموعة من البروتينات والببتيدات. توظيف الانحدار الخطي من الطور المتحرك A (الأسيتونيتريل حمض الفورميك بنسبة 0.1٪ و 2٪ [ACN] في الماء) إلى الطور المتحرك B (حمض الفورميك بنسبة 0.1٪، والمياه بنسبة 20٪ في ACN): 60 دقيقة من 5٪ B الطور المتحرك إلى 50 B٪، ثم 15 دقيقة من B 50٪ إلى 95٪ B، وأخيرا 10 دقيقة في 95٪ ثابت B. استخدام معدل التدفق من 200 NL / دقيقة. الحصول على بيانات مطياف الكتلة في وضع البيانات التابعة. نحن نستخدم الحرارية التي Orbitrap شظايا أعلى 6 أيونات الرئيسي الأكثر وفرة.
  2. تكرار يمتد لثلاثة على الأقل البيولوجية ويعيد التقنيتين. (Recommended)
  3. استخدام البرمجيات (الخيارات المتاحة تجاريا تشمل BioWorks وXcalibur؛! الخيارات المتاحة علنا ​​تشمل جوس، جنبا إلى جنب X، SpectraST) للبحث الأطياف مقابل قاعدة البيانات عن طريق اختيار Uniprot من خوارزمية البحث (مثل SEQUEST أو MASCOT).
  4. النظر في تعديل معلمات البحث للسماح للأكسدة carbamidomethylation السيستين والميثيونين، واثنين من التعديلات المشتركة التي أنشئت خلال تجهيز العينات.
  5. حساب معدل إيجابية كاذبة باستخدام البحث العكسي قاعدة البيانات.
  6. تصفية البروتين لتحديد الهوية فقط نقبل مباريات ثقة العتبة. نوصي المعلمات التالية لتبدأ: Xcorr> 3 (+2)،> 4 (+3)،> 5 (+4)؛ deltaCN التسامح> 0.1، درجة الإجماع ≥ 20، 2 دا التسامح الشامل لايون الأم والكتلة من 0.5 دا لايون المنتج، على الأقل 2 الببتيدات فريدة من نوعها في البروتين و 3 لا يزيد غاب الانشقاقات.

7. التسمية خالية الكمي

Determine الوفرة النسبية للبروتينات باستخدام التسمية خالية من الكميات (الشكل 4).

  1. وهناك عدد من البرامج هي علانية أو لتحديد الكميات المتاحة تجاريا التسمية خالية من البيانات بما في ذلك مطياف الكتلة Elucidator 23 التعداد (مجموعة الأستاذ ييتس ')، (مايكروسوفت)، 24 غربال (الحرارية العلمية)، 25 سقالة (بروتيوم البرمجيات) 26 هذه البرامج تهدف إلى ربط إشارة الشامل الطيفي من الببتيدات سليمة أو عدد الببتيد الأحداث التسلسل مع كميات البروتين النسبية بين دولتين أو أكثر من الدول.
  2. بينما يتضمن كل برنامج خط أنابيب تحليل مماثل، وتقتصر بعض البرامج إلى أنواع محددة من التحليل التي يمكن القيام بها على البيانات. في البداية، يتم محاذاة البيانات من أشواط مختلفة، وتطبيع كثافة إشارة ويتم اختيار قمم الببتيد للتحليل.
  3. الطريقتين الأكثر شيوعا هي الكمي يعتمد على عد الطيفية أو LC-MS منطقة الذروة. وفرةوتحسب نسب لتحديد التغيرات في وفرة الببتيد بين المجموعات المختلفة.
  4. يمكن لهذه البرامج أن تكون ربطه مع خوارزميات البحث البروتين (التميمة، SEQUEST، X! جنبا الى جنب) لربط المعلومات لتحديد الكمي البروتين.
  5. لضمان الدقة واستنساخ البيانات لا بد من دمج كل من البيولوجي (مختلف نماذج تجريبية) والتقنية (تشغيل نفس العينة على مطياف الكتلة عدة مرات) يعيد للبيانات المواصفات الشامل.
  6. ويمكن تقييم التباين في وفرة الببتيد وبين الظروف التجريبية من ANOVA وتآمر عبر PCA (الشكل 5).

اعتبارات هامة لتحديد الكميات التسمية مجانا. عند تنفيذ التسمية خالية من تحديد الكميات، لا بد من إيلاء اهتمام خاص لضمان اتساق إعداد العينات، والوقت وظروف LC-MS/MS الهضم ويجب أن تتم معالجة كل عينة وتحليلها بشكل منفصل. وعلى النقيض من الحدمصنوعة نهج وضع العلامات abolic، مقارنات في التسمية خالية من التجارب على بيانات من مطياف الكتلة متميزة يعمل (لأن عدم وجود وسم يغني عن إمكانية تشغيلها معا)، مما يجعل من الضروري استنساخ عالية في جميع جوانب تحليل العينة (أي من عينة الإعدادية، والخطوات LC MS) واستخدام عالية الدقة الطيف الشامل الشامل.

قد لمراعاة التغييرات الطفيفة في إعداد العينات وتحليلها على مستوى المعروف أن تضاف إلى كل عينة للمساعدة في تطبيع البيانات. بالإضافة إلى ذلك، معظم برامج البرمجيات تسمح تطبيع كثافة إشارة (مثل من خلال تعديل للضجيج في الخلفية أو المعروفة وفيرة الحليلة) بعد الحصول على البيانات لحساب الاختلافات في التأين، والحقن والتجزئة. خوارزميات المحاذاة موجودة في معظم البرامج المشار إليها أعلاه التي تساعد في تصحيح الاختلافات في ملامح شطف الببتيد. استخدام مكررات البيولوجية والتقنية ايسنقيمه في هذا النوع من الدراسة، لأنه يتيح التحليلات الإحصائية للتأكد من اتساق واستنساخ أي التغيرات الملحوظة في وفرة البروتين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الشكل 4 يسلط الضوء على فائدة هذا النوع من القياس الكمي النسبية. هو موضح في اللوحة اليمنى هي الببتيد الفردية قمم monoisotopic (مضافين من الفئران مختلفة)، والتي تم تعيينها على أنها تنتمي إلى HMGB1 البروتين (التي تم تحديدها من خلال البحث في قاعدة البيانات). كل الذروة، في الأساس اللوني ايون لاستخراج الببتيد معينة، يأتي من ماوس مختلفة. المجموعات تمثل ثلاث ولايات مختلفة الفسيولوجية: القاعدية، وتضخم القلب، وفشل القلب، مع ثلاثة مكررات البيولوجية لكل مجموعة. من خلال دمج المنطقة تحت المنحنى، يمكن حساب وفرة نسبية. في لوحة الأوسط يظهر متوسط ​​الكميات المتوفرة من هذه. يبدو واضحا من هذا النوع من التحليل أن وفرة من البروتين HMGB1 يتغير خلال سير المرض. في المقابل، فإن لوحات تظهر أسفل مثال H4 هيستون الذي لا يتغير مع المرض. في كلتا الحالتين، الببتيدات قادمة من الحيوانات من نفس phenotالدولة ypic إظهار ملفات التعريف شطف مماثلة والوفرة النسبية، مما يدل على إمكانية استنساخ من إعداد العينات وLC / MS / MS.

ويؤكد كذلك استنساخ هذه التقنية باستخدام المكونات الرئيسية تحليل (PCA). كما هو مبين في الشكل (5)، وتطبيق ANOVA لنتائج بروتيوم الإجمالية لكل حيوان تحليل يكشف عن تجمع متميز من قبل النمط الظاهري القلب (البيولوجية مكررات) مع الرابطة بين أشد التقنية مكررات (المواصفات المختلفة الشامل يمتد لنفس العينة) من نفس الحيوان . هذا يوفر الثقة بأن التغييرات وفرة البروتينات الفردية لوحظ الاهتمام هي في الواقع تعزى إلى اختلاف في الحالة الفسيولوجية.

نفس القدر من الأهمية كما الكمي واستنساخ من النتائج هو التغطية المتزايدة للبروتيوم النووية مكن subfractionation النووية. الشكل 6 يوضح أن تحليل نواة بأكملها وحده للكشف عن فشل حتى أغلبية من البروتينات النووية التي تم تحديدها عند الجمع بين تحليلات فردية من حجرات منفصلة (1048 البروتينات الفريدة التي تم تحديدها في مجموع أنحاء الكسور مقابل 428 تحديدها من نواة سليمة). وعلاوة على ذلك، فإن التداخل بين معتدلة كسور مختلفة يدل على أهمية النظر في هذه البيولوجي للحجرات منفردة على بصيرة أضاف ضمن ظيفة النووية وتنظيم الجينات. وأخيرا، والقدرة على وجه التحديد يجزئ حمض استخراج أو المنظفات المستخرج يثري لونين لونين البروتينات الهيكلية الرئيسية، مثل الهستونات، وبالتالي تمكين تحليلات أكثر تركيزا الطيفي الشامل (مثل تلك التعديلات بعد متعدية أن الهدف) على مجموعة من البروتينات دون تتطلب الأجسام المضادة المحددة لكل متغير وشكل الإسوي.

94fig1highres.jpg "SRC =" / files/ftp_upload/4294/4294fig1.jpg "/>
الشكل 1. والرسم البياني المتجانس لتوصيف البروتينات في حجرات القلب الفرعية النووية. قلوب الماوس الجامعة والمحللة المخصب لنوى. نوى هي مجزأة إلى لونين جبلة النواة المنظفات-المستخرجة، والكسور لونين حمض المستخرج. يتم عزل البروتينات من كل ومفصولة أحادية البعد SDS-PAGE، و. النطاقين التربسين يهضم ويديرها LC / MS / MS بعد البحث في قاعدة البيانات، يتم استخدام التسمية خالية الكمي لتحديد الاتجاهات وفرة للبروتينات في كسور مختلفة.

الشكل 2
الشكل 2. يتم إثراء النووية التخطيطي تجزئة. النواة من جناسة القلب كله عن طريق التدرج السكروز. يمكن إما كل عينة يتم فصل النوى في جبلة النواة والكسور المنظفات، أو المستخرج إلى ميلانID-المستخرج جزء التي تثري لالهستونات.

الشكل 3
الشكل 3. ذات بعد واحد من هلام كسور مختلفة. من 20 ميكروغرام المحللة القلب كله (WHL)، نواة سليمة (مجلس التوحيد الوطنى)، جبلة النواة (حزب الوحدة الوطنية)، والمنظفات، استخراج لونين (DE)، وحمض المستخرج لونين الكسر (AE) من القلب الماوس وتعمل على هلام SDS-PAGE ذات بعد واحد (12٪ الأكريلاميد) جنبا إلى جنب مع لونين جزء حمض يستخرج من خلايا هيلا وملطخة الصفارية. والزخرفة مختلفة من وفرة البروتين الكلي في الأوزان الجزيئية المختلفة إثبات وجود proteomes فريدة لحجرات الفرعية المختلفة، بما في ذلك تخصيب للالهستونات الوزن الجزيئي المنخفض في لونين المنظفات-المستخرجة التي إثراء كسور في حمض المستخرج . وتجدر الإشارة أيضا إلى حد كبير طبيعة أقل تعقيدا من الكسر AE من خلية هيلاق مقارنة مع أن من القلب.

الشكل 4
الشكل 4. تم جمع القاعدية (الأزرق) تضخم (أحمر) والفشل (الأخضر) في ثلاث نسخ وعينات البروتين ركض في اثنين من التقنية يعيد LC / MS / MS: النسبية الكمي وفرة من الفئران الدول الثلاث القلب المختلفة. يظهر على اليسار هي قمم monoisotopic لالببتيد محددة (الذي يظهر على أطياف اليمين). تم حساب الوفرة النسبية من التكامل وبلغ متوسط ​​بين مكررات لكل دولة المظهري (لوحة الأوسط) لمقارنة الوفرة النسبية للببتيد (بروتين والتي جاءت من) في ولايات مختلفة من قصور في القلب. لوحة الأعلى يظهر من الببتيد HMGB1، الذي يتم تبديل فرة في المرض، في حين أن اللوحة السفلية (H4 هيستون) لا تغيير. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

الشكل 5
الشكل 5. يكشف تحليل المركبات الرئيسية التكاثر. ANOVA تحليل لكل الماوس (3 مكررات البيولوجية / القلب × 2 حالة التقنية مكررات) تآمر لشدة الببتيد (محاور) يظهر المرض تجميع من قبل الدولة (القاعدية في الزرقاء، وتضخم في الحمراء، والفشل في الخضراء)، التي يشير استنساخ ناجحة للبيانات المواصفات الشامل والاختلافات الفسيولوجية ذات دلالة إحصائية بين الحالات المرضية المختلفة.

الشكل 6
الشكل 6. توصيف العالمية حجرات متميزة الفرعية النووية. حددنا 1048 مجموع البروتينات الفريدة في جميع الاب 4الإجراءات. وقد تم تبادل 146 البروتينات من قبل جميع الكسور 4، مقارنة إلى 749 البروتينات المحددة في جبلة النواة، 380 جزء في لونين المنظفات-المستخرجة، و 426 في لونين جزء حمض المستخرجة، و 428 في نوى سليمة. الرسم البياني فين يصور التداخل المعتدلة في البروتينات التي تم تحديدها بين الكسور، وتسليط الضوء على وجود مناطق مختلفة في الجسم الحي وقدرة هذه التجزئة لعزلهم. بالإضافة إلى ذلك، وصف غير مكتملة بشكل ملحوظ من إجمالي بروتيوم النووي يمكن تحقيقه فقط من خلال تحليل نوى غير المجزأ (البرتقال) يبرر تجزئة أخري.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وقد استعرضت طريقتين رئيسيتين لعزل النووية سابقا: 27 واحد هو أسلوب بيرنس من المجانسة الأنسجة مجفف بالتجميد في المذيبات غير المائية، والثاني، وهو التعديل الذي نستخدمه هنا، من التجانس في الأنسجة السكروز المائي / محلول الملح يتبع بواسطة الطرد المركزي أو الفرق الكثافة التدرج.

Subfractionation من نوى من استخلاص الحمض على عينات الأنسجة هو أداة هامة لدراسة لونين التي استخدمت منذ 28، 1960 مع الهدف الأصلي يجري لتحليل الهستونات. وقد وضعت حمض استخراج البروتوكولات لتحقيق هذا الهدف من تنقية مكونات الأساسية النووي nucleosomal الهستونات 29 ألف الحد من هذه الدراسات السابقة هو عدم وجود معلومات عن البروتينات غير هيستون تشكل، وتعديل، لونين؛ تناولناها هذا التحدي مع البروتوكول الحالي لوصف الأفخاذ البيولوجية المميزة للنواة لونين و.هذا النهج، والذي يستخدم استخراج المنظفات أو استخلاص الحمض من لونين في موازاة ذلك، يكشف عن تنوع الجزيئات التنظيمية لونين ويميز بين مستويات التنظيم المحلية، مما يخدم كنهج قوية لتوليد الفرضية.

إنشاء تطبيق منهجية استخراج حمض إلى خلية عضلية الكبار يطرح بعض العقبات بما في ذلك الهيكل الخلوي كثيفة السكان والميتوكوندريا كبيرة. بينما استخدمت إصدارات استخراج الحمضية على أنسجة القلب كله 30 من أجرى التجارب بطريقة تستهدف دراسة البروتينات المعروفة؛ تم تصميم البروتوكول الحالي وتم تنفيذ تحليل لتمكين بروتيوم متحيزة. بالإضافة إلى ذلك، وجدنا أنه من المفيد للنظر في المنظفات، واستخراج حمض المستخرج بشكل منفصل لونين (لوحظ تداخل سوى 37٪ بين proteomes من هذه الكسور اثنين) إلى فهم أفضل للديناميات التي من خلالها هؤلاء السكان من لونين البروتينات الباحثeract مع DNA. بروتوكولات أخرى باستخدام اليوريا على أساس مخازن كما تم وصفها، التي 31،32، أنجز قبل استخلاص الحمض، وإثراء البروتينات أقل باحكام ملزمة لجينوم. بالإضافة إلى الكسور لونين، والبعض الآخر subfractionated نواة لعزل نوية، 33 ولكن subfractionation لتحليل الطيف الكتلي من نوى عضلة القلب معزولة عن القلوب كلها لم المبلغ عنها.

دراسات بندقية البروتين على حالها نوى، وهذا هو، غير المجزأ العضيات-نفذت على الأنسجة عضلة القلب باستخدام نهج MudPIT. بأسماء 15 هذه الدراسة 1044 البروتينات القلب النووي، على نفس النطاق كبروتوكول لدينا، إلا أنها تعتمد على استخدام متوسط 8.5 مكررات، مع كل تشغيل يستمر 20 ساعة للكشف عن وفرة البروتينات المنخفضة. في المقابل، قمنا بتوظيف subfractionation، إلى كل من زيادة عدد من البروتينات المحددة (طويلة دون الحاجة اللوني لدينا أشواط LC هي 85 دقيقة) في حين importantly تقدم أيضا معلومات إضافية عن البيولوجية التعريب شبه النووية والوفرة النسبية من البروتينات.

من قلب كله الماوس (0.14 تقريبا ز) نستعيد حوالي 1.2 ملغ (0.85٪ من الكل) من البروتين في نوى سليمة. من نوى سليمة نحقق الانتعاش التالية لكل من الأفخاذ (ملاحظة: القيم الإجمالية تتجاوز 100٪ حيث تتم حمض استخراج واستخلاص المنظفات على قلوب منفصلة، ​​وليس في سلسلة): جبلة النواة (15٪)، والمنظفات، استخراج لونين (85٪)، وحمض المستخرج لونين (54٪). وعلى سبيل المقارنة، الحرارية العلمية لديها مجموعة (NE-PER الكواشف النووية والسيتوبلازم) الذي رقة البيانات الخاصة بهم يقول غلة البروتين عصاري خلوي 1.6mg و 0.6 ملغ من البروتين النووي (1.5٪) من 40 ملغ من قلب الفأر مع ما بين 10٪ عبر تلوث الكسور اثنين. سيجما لديها مجموعة (، CellLytic NXTRACT كيت استخراج النووية) التي قد اختبارها على العضلات أرنب، ولكن ليس القلب، وتعافى من الأنسجة 100 ملغ 0.46 ملغ من البروتين النووي (0.46٪) في ما يسمونه هم "بيليه الخام النووية" مع "نسبة ضئيلة" من التلوث حشوية. شركات أخرى، مثل Epigentek كما تقدم مجموعات، وكانت ولكن نحن غير قادرين على العثور على تفاصيل محددة بشأن تخصيب اليورانيوم والنقاء في موقعيهما على الانترنت للمقارنة.

وقد وصفت لنا تقنية جديدة لتلبي الحاجة الحالية لتخصيب الناجح لنوى القلب للدراسات البروتين. وصفنا منهجية لمزيد من التجزئة المقصورة الكبرى، التي يزيد حد سواء القدرة على اكتشاف البروتينات أقل وفرة وكذلك يسمح للأعلى الكمي، القرار وتحديد توطين البروتين. تحقيقا لهذه الغاية، وبروتوكول لتحليل الطيف الكتلي يقدم المبادئ التوجيهية الموصى بها، ولكن كل حالة على حدة اعتبارات من المرجح أن تكون ضرورية. على سبيل المثال، وجدنا أن عددا كبيرا من الأشكال الإسوية القلب البديل هيستون مع تسلسل تشابه التفتيش اليدوي المطلوب من أطياف لتعيين أماهقمم JOR وتؤكد الأم الشامل أيون قبل أن يتمكن من تعيين بثقة أطياف. المعلمات ويمكن أيضا أن تكون مخصصة البحث 14 لمرحلة ما بعد متعدية التعديل (PTM) تحديد وجود ملاحظات ممتازة طرق بالتفصيل والاهتمامات مع تفسير البيانات لتحليل PTM (بما في ذلك تخصيب PTM و 34 برنامج للPTMs، 35 تحليل PTMs اندماجي، 36 استراتيجيات بديلة التجزئة 37 و الهضم البديلة وتجهيز 38،39).

إثراء وصفها هو تجزئة من القلب كله (والذي هو 50-70٪ من cardiomyocyte الشامل). في حين أن هذا التحديد الجوانب تضحيات الخلية والتي قد تكون ذات أهمية خاصة للعائلات معينة من البروتينات النووية، لأنها تتيح للتعليق أكثر من ذلك بكثير السريع للبروتينات في مخازن مناسبة، وهو أمر غير ممكن مع الكبار خلية عضلية بروتوكولات العزل الخلية. وبهذه الطريقة، يحافظ على هذه المنهجية على نحو أفضل يا سلامةو العينة من التدهور. ومع ذلك، وصفت أيضا هي تعليمات لتطبيق هذا البروتوكول إلى البطين المعزولة حديثي الولادة myocytes الفئران، لأن كلا نماذج الكائنات المعزولة وخلايا كاملة من الأدوات اللازمة لدراسة قصور القلب. يمكن من حيث المبدأ أيضا هذه الطريقة يمكن تطبيقها على الكبار myocytes استخراج انزيم الهضم من قبل من قلوب-معزولة مع التحذير من أن التغييرات في ملزمة البروتين التي تحدث أثناء العزلة (التي يمكن أن تستمر أكثر من ساعة) سوف نخلط تفسير الملاحظات البروتين.

وضعنا هذه المنهجية لفهم التغيرات في بروتيوم النووي والكروماتين ماكياج التي تسهم في المرض. 14 طلبا ولكن دراسة أخرى تشمل الحوافز الخاصة التغييرات في تكوين علم وظائف الأعضاء في بروتيوم العادية. بالإضافة إلى ذلك، ودون تجزئة يوفر القدرة لمستوى جديد من توصيف للكيفية التي تعمل البروتينات وتوطين الوظائف في مختلف المناطق متميزة من النواة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

يتم اعتماد مختبر Vondriska من المنح المقدمة من معهد القلب والرئة والدم الوطني من المعاهد الوطنية للصحة والمؤسسة Laubisch في جامعة كاليفورنيا. EM هو المستفيد من جنيفر S. زمالة دراسات عليا في الفسيولوجيا بوخفالد في جامعة كاليفورنيا؛ HC وهو حاصل على زمالة القلب الأمريكية ما قبل الدكتوراه جمعية؛ MP وهو حاصل على زمالة روث NIH ما بعد الدكتوراه كيرشتاين، وSF وهو حاصل على وK99 NIH جائزة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbeco Modified Eagle Medium Invitrogen 11965
Protease pellet Roche 04 693 159 001
100 μm strainer BD Falcon 352360
Ultracut ultramicrotome Reichert
100CX Transmission Electron
Microscope		 JEOL USA, Inc.
Oriole BioRad 161-0496
Histone H2A antibody Santa Cruz sc-8648
Nucleoporin p62 antibody BD Biosciences 610498
Adenine nucleotide transporter antibody Santa Cruz sc-9299
BiP antibody Santa Cruz sc-1050
Tubulin antibody Sigma T1568
Histone H3 antibody Abcam ab1791
Fibrillarin antibody Cell Signaling C12C3
SNRP70 antibody Abcam ab51266
E2F-1 antibody Thermo Fisher MS-879
Retinoblastoma antibody BD Biosciences 554136
Hypoxia inducible factor-1 antibody Novus Biologicals NB100-469
BCA protein assay Thermo Scientific 23227
Reverse phase column New Objective PFC7515-B14-10
BioWorks Browser Thermo Scientific

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Li, F., Wang, X., Capasso, J. M., Gerdes, A. M. Rapid transition of cardiac myocytes from hyperplasia to hypertrophy during postnatal development. J Mol Cell Cardiol. 28, 1737-1746 (1996).
  2. Rumyantsev, P. P. Interrelations of the proliferation and differentiation processes during cardiact myogenesis and regeneration. Int Rev. Cytol. 51, 186-273 (1977).
  3. Olson, E. N., Schneider, M. D. Sizing up the heart: development redux in disease. Genes Dev. 17, 1937-1956 (2003).
  4. Molkentin, J. D., Dorn, G. W. 2nd Cytoplasmic signaling pathways that regulate cardiac hypertrophy. Annu Rev. Physiol. 63, 391-426 (2001).
  5. Fishman, M. C., Chien, K. R. Fashioning the vertebrate heart: earliest embryonic decisions. Development. 124, 2099-2117 (1997).
  6. Rajabi, M., Kassiotis, C., Razeghi, P., Taegtmeyer, H. Return to the fetal gene program protects the stressed heart: a strong hypothesis. Heart Fail Rev. 12, 331-343 (2007).
  7. Roger, V. L., et al. Heart disease and stroke statistics--2011 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 123, e18-e209 (2011).
  8. Schirmer, E. C., Florens, L., Guan, T., Yates, J. R. 3rd, Gerace, L. Nuclear membrane proteins with potential disease links found by subtractive proteomics. Science. 301, 1380-1382 (2003).
  9. Lambert, J. P., Mitchell, L., Rudner, A., Baetz, K., Figeys, D. A novel proteomics approach for the discovery of chromatin-associated protein networks. Mol. Cell Proteomics. 8, 870-882 (2009).
  10. Malik, P., et al. Cell-specific and lamin-dependent targeting of novel transmembrane proteins in the nuclear envelope. Cell Mol Life Sci. 67, 1353-1369 (2010).
  11. Tweedie-Cullen, R. Y., Reck, J. M., Mansuy, I. M. Comprehensive mapping of post-translational modifications on synaptic, nuclear, and histone proteins in the adult mouse brain. J. Proteome Res. 8, 4966-4982 (2009).
  12. Chu, D. S., et al. Sperm chromatin proteomics identifies evolutionarily conserved fertility factors. Nature. 443, 101-105 (2006).
  13. Uchiyama, S., et al. Proteome analysis of human metaphase chromosomes. J. Biol. Chem. 280, 16994-17004 (2005).
  14. Franklin, S., et al. Specialized compartments of cardiac nuclei exhibit distinct proteomic anatomy. Mol. Cell Proteomics. 10, (2011).
  15. Kislinger, T., et al. Global survey of organ and organelle protein expression in mouse: combined proteomic and transcriptomic profiling. Cell. 125, 173-186 (2006).
  16. Moore, D. H., Ruska, H. Electron microscope study of mammalian cardiac muscle cells. J. Biophys Biochem. Cytol. 3, 261-268 (1957).
  17. Anversa, P., Vitali-Mazza, L., Visioli, O., Marchetti, G. Experimental cardiac hypertrophy: a quantitative ultrastructural study in the compensatory stage. J. Mol. Cell Cardiol. 3, 213-227 (1971).
  18. Franklin, S., et al. Specialized compartments of cardiac nuclei exhibit distinct proteomic anatomy. Mol Cell. Proteomics. 10, (2011).
  19. Paulsson, A. K., et al. Post-translational regulation of calsarcin-1 during pressure overload-induced cardiac hypertrophy. Journal of molecular and cellular cardiology. 48, 1206-1214 (2010).
  20. Franklin, S., et al. Quantitative analysis of the chromatin proteome in disease reveals remodeling principles and identifies high mobility group protein b2 as a regulator of hypertrophic growth. Mol Cell Proteomics. 11, (2012).
  21. Gramolini, A. O., et al. Comparative proteomics profiling of a phospholamban mutant mouse model of dilated cardiomyopathy reveals progressive intracellular stress responses. Mol Cell Proteomics. 7, 519-533 (2008).
  22. Singh, H., Warburton, S., Vondriska, T. M., Khakh, B. S. Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels. J. Vis. Exp. (27), e1178 (2009).
  23. Park, S. K., Venable, J. D., Xu, T., Yates, J. R. 3rd A quantitative analysis software tool for mass spectrometry-based proteomics. Nat. Methods. 5, 319-322 (2008).
  24. Lomenick, B., et al. Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS). Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 21984-21989 (2009).
  25. Kamleh, A., et al. Metabolomic profiling using Orbitrap Fourier transform mass spectrometry with hydrophilic interaction chromatography: a method with wide applicability to analysis of biomolecules. Rapid Commun. Mass Spectrom. 22, 1912-1918 (2008).
  26. Searle, B. C. Scaffold: a bioinformatic tool for validating MS/MS-based proteomic studies. Proteomics. 10, 1265-1269 (2010).
  27. Murray, K. The Basic Proteins of Cell Nuclei. Annu Rev. Biochem. 34, 209-246 (1965).
  28. Johns, E. W., Phillips, D. M., Simson, P., Butler, J. A. Improved fractionations of arginine-rich histones from calf thymus. Biochem. J. 77, 631-636 (1960).
  29. Rodriguez-Collazo, P., Leuba, S. H., Zlatanova, J. Robust methods for purification of histones from cultured mammalian cells with the preservation of their native modifications. Nucleic Acids Res. 37, e81 (2009).
  30. Kuehl, L., Salmond, B., Tran, L. Concentrations of high-mobility-group proteins in the nucleus and cytoplasm of several rat tissues. J. Cell Biol. 99, 648-654 (1984).
  31. Gronow, M., Griffiths, G. Rapid isolation and separation of the non-histone proteins of rat liver nuclei. FEBS Lett. 15, 340-344 (1971).
  32. Mischke, B. G., Ward, O. G. Isolation and tissue specificity of chromatin-associated proteins in Vicia faba. Can J. Biochem. 53, 91-95 (1975).
  33. Andersen, J. S., et al. Directed proteomic analysis of the human nucleolus. Curr. Biol. 12, 1-11 (2002).
  34. Zhao, Y., Jensen, O. N. Modification-specific proteomics: strategies for characterization of post-translational modifications using enrichment techniques. Proteomics. 9, 4632-4641 (2009).
  35. Ahrne, E., Muller, M., Lisacek, F. Unrestricted identification of modified proteins using MS/MS. Proteomics. 10, 671-686 (2010).
  36. Young, N. L., Plazas-Mayorca, M. D., Garcia, B. A. Systems-wide proteomic characterization of combinatorial post-translational modification patterns. Expert Rev. Proteomics. 7, 79-92 (2010).
  37. Guthals, A., Bandeira, N. Peptide identification by tandem mass spectrometry with alternate fragmentation modes. Mol. Cell Proteomics. , (2012).
  38. Wu, C., et al. A protease for 'middle-down' proteomics. Nat. Methods. , (2012).
  39. Tran, J. C., et al. Mapping intact protein isoforms in discovery mode using top-down proteomics. Nature. 480, 254-258 (2011).

Tags

الطب، العدد 70، البيولوجيا الجزيئية، علم المناعة، علم الوراثة، علم الجينوم، علم وظائف الأعضاء، بروتين، DNA، لونين، وأمراض القلب والأوعية الدموية، البروتيوميات، مطياف الكتلة
التحليل الكمي من Proteomes الكروماتين في الأمراض
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Monte, E., Chen, H., Kolmakova, M.,… More

Monte, E., Chen, H., Kolmakova, M., Parvatiyar, M., Vondriska, T. M., Franklin, S. Quantitative Analysis of Chromatin Proteomes in Disease. J. Vis. Exp. (70), e4294, doi:10.3791/4294 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter