Summary
Les progrès de la spectrométrie de masse ont permis l'analyse à haut débit de l'expression protéique et la modification dans une multitude de tissus. Combiné avec fractionnement subcellulaire et modèles de maladies, spectrométrie de masse quantitative et de la bioinformatique peut révéler de nouvelles propriétés dans les systèmes biologiques. Le procédé décrit ici analyse des protéines associées à la chromatine dans le cadre d'une maladie cardiaque et est facilement applicable à d'autres
Abstract
Dans le noyau résident les protéomes dont les fonctions sont le plus intimement lié à la régulation des gènes. Adulte noyaux des cardiomyocytes de mammifères sont uniques en raison du pourcentage élevé de cellules binucléées, 1 l'état hétérochromatique principalement de l'ADN, et la nature non-division du cardiomyocyte qui rend noyaux adulte dans un état permanent d'interphase. 2 Régulation transcriptionnelle au cours du développement et maladie ont été bien étudiés dans cet organe, 3-5, mais ce qui reste relativement inexploré est le rôle joué par les protéines nucléaires responsables de l'empaquetage de l'ADN et de l'expression, et comment ces protéines contrôlent des changements dans les programmes transcriptionnels qui se produisent au cours de la maladie. 6 Dans les pays développés monde, les maladies cardiovasculaires sont la première cause de mortalité pour les hommes et les femmes 7. Regard sur la façon dont les protéines nucléaires coopèrent pour réguler la progression de cette maladie est essentielle pour faire avancer le traitement actuel options.
La spectrométrie de masse est l'outil idéal pour répondre à ces questions car elle permet une annotation non biaisée de la quantification nucléaire protéome et relative de la façon dont l'abondance de ces protéines varie avec la maladie. Bien qu'il y ait eu plusieurs études protéomiques pour des complexes de protéines de mammifères nucléaires, 8-13 jusqu'à récemment 14, on a eu qu'une seule étude portant sur le protéome cardiaque nucléaire, et considéré comme le noyau entier, plutôt que d'explorer le protéome au niveau des compartiments nucléaires sous 15. En grande partie, ce manque de travail est due à la difficulté d'isoler les noyaux cardiaque. Noyaux cardiaque ultérieure dans un semi-rigide et dense actine-myosine l'appareil auquel ils sont reliés par plusieurs extensions du réticulum endoplasmique, dans la mesure où la contraction des myocytes modifie leur forme générale. 16 En outre, les cardiomyocytes sont 40% en volume 17 mitochondries qui necessitàTES enrichissement du noyau mis à part les autres organites. Ici, nous décrivons un protocole d'enrichissement nucléaire cardiaque et un fractionnement supplémentaire en compartiments biologiquement pertinentes. En outre, nous avons détail les méthodes pour le label sans dissection spectrométrie de masse quantitative de ces fractions des techniques qui se prêtent à l'expérimentation in vivo dans divers modèles animaux et des systèmes d'organes où marquage métabolique n'est pas réalisable.
Protocol
Le flux de travail expérimental comporte sept étapes principales (figure 1). Pour tout travail impliquant des échantillons qui seront exécutés sur le spectromètre de masse, l'expérimentateur doit porter une blouse, des gants et un filet à cheveux et prendre soin d'éviter la contamination par la poussière et la chute personnelle de la kératine.
1. Homogénéisation coeur et isolement nucléaire
Coeurs de souris sont homogénéisés et un noyaux intacts culot est isolé (figure 2).
- Sacrifiez la souris adulte, le cœur d'accise, rincer à PBS glacé, et homogénéiser sur la glace en verre Dounce (nous préférons le broyeur de tissu Wheaton de Fisher, # 08-414-13A, mais d'autres méthodes peuvent fonctionner aussi bien) contenant 2 ml de tampon de lyse (une solution hypotonique qui lyse différentielle sur la membrane cellulaire des organites dont le noyau) (10 mM Tris pH 7,5, 15 mM de NaCl, et 0,15% v / v de Nonidet P-40 [NP-40] dans de l'eau désionisée ainsi que protéase et la phosphatase imélange nhibitor: 10 mM de butyrate de sodium, 0,1 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyle [PMSF], 0,2 mM de Na 3 VO 4, 0,1 mM de NaF et 1 Roche protéase pellet/10 ml - tampon de lyse peut être stocké pendant jusqu'à une semaine à -20 ° C ). (Note: Nous ne jugeons pas nécessaire de perfuser les coeurs avec du PBS, car nos données de spectrométrie de masse et analyse GO identifier les protéines comme essentiellement cardiomyocytes [p-valeur 3,8 E-22] à l'origine, par opposition à la contamination du sang [valeur p 5,0 E-2].)
- Verser le lysat à travers un tamis de 100 um et de recueillir l'écoulement à travers dans 1,5 ml tube à centrifuger. À ce stade, sauf indication contraire, l'échantillon doit être conservé dans la glace.
- Centrifuger à 4000 rpm pendant 5 min à 4 ° C.
- Retirer le surnageant. (C'est le cytosol, et doit être stocké à -80 ° C. Il contient les mitochondries lysé.) Resuspendre le culot dans 200 ul de tampon de lyse par trituration. (C'est le culot nucléaire brut.)
- Remplissez tube de 1,5 ml centrifugeuse avec 1 ml de saccharose buffer (poids de saccharose 24% / volume, 10 mM Tris pH 7,5, et 15 mM de NaCl dans de l'eau déminéralisée avec la protéase / inhibiteur de la phosphatase mélange - mémoire tampon saccharose doit être préparée le jour d'utilisation). Doucement la couche culot remis en suspension au-dessus du coussin de saccharose et centrifuger à 5000 tours par minute pendant 10 min à 4 ° C.
- Retirer le film mince sur le dessus ainsi que le pad saccharose (qui contiennent la membrane). Rincez le reste de culot avec 200 ul PBS glacé / EDTA (1x PBS avec 1 mM d'EDTA). (C'est le culot des noyaux et peuvent être solubilisés ou fixe pour usage en microscopie électronique ou western blot [Voir étapes 4.1 et 4.2] pour quantifier l'enrichissement.)
2. Nucléoplasme et détergent-extrait de fractionnement chromatine
Les noyaux brut culot est séparé en une nucléoplasme et détergent extrait fraction chromatine, contenant des protéines faiblement liés à l'ADN.
- Triturer granulés de l'étape 1.6 en tampon de 200 ul d'extraction de détergent (20 mM HEPES pH 7,6, 7,5 mM MgCl 2. EDTA 0,2 mM, NaCl 30 mM, 1 M d'urée, 1% de NP-40 dans de l'eau déminéralisée avec la protéase / inhibiteur de la phosphatase mélange - tampon d'extraction détergent peut être stocké pendant jusqu'à une semaine à -20 ° C).
- Vortex échantillon 2 fois, chaque 10 sec. Placer sur la glace 10 min.
- Centrifuger à 13000 rpm pendant 5 min à 4 ° C.
- Retirer le surnageant. (C'est le nucléoplasme et doit être stocké à -80 ° C). Rincer culot avec du PBS glacé / EDTA. (C'est le culot chromatine.)
- Triturer culot dans 300 pl de Tris, SDS, EDTA (50 mM Tris pH 7,4, EDTA 10 mM, SDS à 1% dans de l'eau déminéralisée avec la protéase / inhibiteur de la phosphatase mélange - Tris, SDS, EDTA tampon peut se conserver jusqu'à une semaine à -20 ° C).
- Soniquer 3-6 fois pendant 10 secondes chacun pour briser l'ADN. Conserver l'échantillon sur la glace entre sonications.
- Centrifuger à 13000 rpm pendant 5 min à 4 ° C. Conserver le surnageant. (Surnageant est extrait par le détergent chromatine protéines fractionnementn et doit être conservé à -80 ° C). Les autres pastilles devrait être faible et peut être jeté.
- Si vous utilisez des myocytes isolés au lieu de tout son cœur: Isoler myocytes ventriculaires de rats nouveau-nés à partir de ratons un jour après la naissance par digestion enzymatique, suivie par la culture en milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) avec 10% de sérum foetal bovin (FBS), l'insuline 1% à la transferrine sélénite de sodium (SON), et 1% de pénicilline. Après 24 h, le transfert à un milieu sans sérum (comme ci-dessus, mais sans FBS). Cellules de récolte dans un tampon de lyse (voir la liste en 1.1), et commencer à l'étape de fractionnement nucléaire 1.3.
3. Fractionnement d'extraction à l'acide - liée à l'ADN enrichissement en protéines
A l'enrichit de fractionnement des protéines séparées étroitement liés à l'ADN, y compris les histones.
- Répétez les étapes 1.1 à 2.4.
- Triturer le culot de la chromatine dans 400 ul de 0,4 N d'acide sulfurique. Vortex pour éliminer les grumeaux.
- Incuber à 4 ° C pendant 30 min ou overnroite tout en tournant.
- Centrifuger à 16.000 xg pendant 10 min à 4 ° C pour éliminer les débris nucléaires.
- Transférer le surnageant dans un nouveau tube.
- Ajouter 132 ul d'acide trichloracétique goutte à goutte dans le surnageant. Retourner plusieurs fois. Incuber dans la glace pendant 30 min.
- Centrifuger à 16000 g pendant 10 min à 4 ° C.
- Rejeter le surnageant. Rincer délicatement culot avec acétone glacée. (C'est l'histone granulés.)
- Centrifuger à 16000 g pendant 10 min à 4 ° C.
- Répétez lavage, les étapes 3.8 à 3.9.
- Air culot sec.
- Reprendre le culot dans 100 ul de Tris, SDS, EDTA. Régler le pH à 8 par addition de 1 M de Tris. (Utilisez un Tris 1 M d'actions qui n'est pas au pH ajusté.)
- Soniquer au bain-marie pendant 15 min. Éviter la surchauffe en ajoutant de la glace au bain-marie. (Il s'agit de la fraction acide extrait et doit être conservé à -80 ° C)
4. Vérifier la pureté
Western blot et microscopie électroniqueconfirment l'enrichissement succès de noyaux et l'épuisement des autres organites. Pour voir les résultats typiques pour toutes les analyses suivantes de contrôle de qualité, s'il vous plaît consulter notre publication précédente 18.
- Effectuer une analyse Western blot. Membrane sonde contenant chaque fraction de l'histone H2A ou nucléoporine p62 (en tant que marqueurs pour vérifier l'enrichissement nucléaires), et pour transporter nucléotide adénine, la tubuline et BiP (comme un marqueur mitochondrial, marqueur du réticulum endoplasmique, et le marqueur du cytosquelette respectivement pour vérifier la pureté). À vérifier sous-fractionnement succès des noyaux, la sonde de l'histone H3 ou fibrillarine (détergent et de l'acide a extrait les noyaux intacts et la chromatine) et SNRP70 ou E2F (nucléoplasme). Sonde pour rétinoblastome ou hypoxia inducible factor-1 (enrichi en extrait de détergent chromatine sur de l'acide extrait par fraction). Échantillons de contrôle supplémentaires de lysat de cellules HeLa et lysat de tout cœur peut également être exécuté sur le même gel: Préparer le contrôle lysat de cellules HeLa par l'ajout de Tris, SDS, EDTA tampon de boîte de culture et en utilisant un grattoir à cellules à prélever l'échantillon. Soniquer et centrifuger l'échantillon comme dans les étapes 2.6 à 2.7. Préparer toute commande lysat coeur en homogénéisant le cœur dans 2 ml de tampon (20 mM Tris pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, 1% Triton X-100, le pyrophosphate de sodium à 2,5 mM, 1 mM de glycérophosphate dans de l'eau désionisée avec une protéase et un inhibiteur de phosphatase mélange). Soniquer et centrifuger comme dans les étapes 2.6 à 2.7. Voir l'étape 5 pour la préparation d'échantillons de protéines pour SDS-PAGE.
- Microscopie électronique: Reprendre le culot des noyaux de 1,6 étape dans un tampon de lyse contenant du glutaraldéhyde à 2% et de fixer l'échantillon à 4 ° C. Rincer les échantillons dans l'acide osmique, déshydrater, et d'intégrer dans de la résine époxy. Couper les tranches 70 nm en utilisant un Reichert Ultracut ultramicrotome. Colorer les échantillons dans l'acétate d'uranyle et de plomb et de l'image en utilisant un microscope JEOL 100CX électronique à transmission. Quantifier l'enrichissement en mesurant la surface des noyaux intacts fonction de la superficie totale de la matière imagée. Nous trouvons 60-80% de noyaux d'être intact 14.
Considérations importantes pour enrichir rapport à purifier noyaux. Ce protocole a été développé pour permettre des analyses protéomiques de la chromatine cardiaque dans le but d'étudier les processus globaux de régulation des gènes au cours de la maladie. Un élément majeur de la conception de l'ensemble du protéome des expériences de spectrométrie de masse est la question de la plage dynamique et d'être en mesure d'identifier et de caractériser les protéines de faible abondance. En plus de l'objectif principal de fournir des informations sur la biologie et de la chromatine nucléaire spécifique, enrichissant pour le protéome nucléaire, augmente la probabilité de détecter ces protéines de faible abondance, tout comme sous-fractionnement ultérieur du noyau. Cependant, comme nous le verrons, les cardiomyocytes adultes a une composante dense du cytosquelette lié à la membrane nucléaire. Nous ne croyons pas que nous avons complètement purifié les noyaux de ces autres composants cellulaires. Toutefois, en enrichissant seulement pour les noyaux, nous avons obtenued un seuil acceptable pour permettre aux types d'analyses décrits.
Plus précisément, nous avons EM utilisé pour évaluer la pureté de notre noyau brut granulés et a constaté 60-80% de la fraction à noyaux intacts, environ 10% des mitochondries, et les débris de repos. En outre, nous savons de notre précédente étude sur la population de noyaux intacts, tandis que de nombreux myofilaments sont pas enrichis par ce protocole (y compris la tubuline et l'actine, telle que mesurée par Western) certaines protéines (calsarcin-1) sont enrichis, ce qui suggère une population biologique de réelle ces protéines dans le noyau cardiaque 19.
En outre, nous avons comparé les protéines que nous avons trouvé à être présent dans la fraction acide chromatine extraite, les rôles prévus de ces protéines par une ontologie des gènes. Surtout, cette analyse de l'ontologie génétique ne tient pas compte de l'abondance relative des différentes protéines (comme le fait de nos données de Western blot), mais compte plutôt toutes les protéines identifiées (enrichiré ou pas) comme étant égal lors de l'identification des voies communes et des compartiments cellulaires. L'analyse de ces voies et des compartiments cellulaires peuvent être trouvées dans nos publications antérieures. 18,20 Plus important encore, le succès de l'enrichissement dans la fraction chromatine acide extrait nous a permis d'identifier la présence de 54 variants d'histones dans le myocyte souris adulte, 18 dont beaucoup compté sur un peptide unique pour l'identification, et donc n'aurait probablement pas été détectable sans ce protocole d'enrichissement étant donné l'énorme complexité du protéome des cardiomyocytes total. Sur les 1048 protéines que nous avons identifiés à partir des noyaux cardiaque, 56 d'entre eux (5,3%) ont été annotés par GO analyse à faire partie du nucléosome (un composant du noyau d'intérêt). Une autre étude portant sur le cœur, identifié 6180 protéines, dont seulement 11 protéines (0,18%) ont été annotés comme faisant partie des 21 nucléosome. Ceci illustre encore la force de notre protocole à meaningfully enrichissement en protéines nucléaires.
5. Gel de protéine et protéine enzymatique Digest
Les protéines sont séparées par une dimension SDS-PAGE et de la trypsine digéré pour être exécuté sur le spectromètre de masse.
- Faire dégeler les échantillons sur la glace et déterminer la concentration de protéines pour chaque échantillon en utilisant l'acide bicinchoninique (BCA) dosage des protéines.
- Diluer les échantillons à une concentration connue à l'aide 5x tampon de Laemmli, faire bouillir pendant 10 minutes et les conserver à -20 ° C pendant une dimension SDS-PAGE. Diluer les échantillons à une concentration connue à l'aide du tampon d'extraction d'urée et conserver à -20 ° C pour les gels bidimensionnels.
- Exécuter gel de choix chargement quantité égale de protéine dans chaque couloir. Les protéines peuvent être transférées sur une membrane de nitrocellulose à utiliser pour Western blot (comme les contrôles à l'étape 4.1) ou des bandes peuvent être découpées pour l'analyse par spectrométrie de masse; voir les étapes suivantes.
- Retirer le gel de dispositif utilisant de l'eau déminéralisée pour le transférer dans un récipient propre.Couvrir gel d'Oriole tache, et contenant les envelopper dans du papier d'aluminium pour bloquer la lumière. Permettez-gel pour incuber à température ambiante sur un agitateur pendant au moins 90 min.
- Image Oriole-gel coloré (figure 3) en utilisant la lumière UV, et la marque où les bandes seront coupés sur l'image. Nous avons coupé dans chaque couloir d'environ 25 mm 2 bandes pour les études de mesure du protéome total.
- Placez gel sur une surface propre. Utilisez uniquement des matériaux qui ont été gardés scellés ou sont pulvérisés avec de l'éthanol pour empêcher la contamination de kératine. Découpez chaque bande, puis encore le découper en 3 parties égales. Placez les trois pièces de chaque groupe ainsi que dans son propre tube de 1,5 ml étiqueté. Morceaux de gel peuvent être conservés à -20 ° C pendant plusieurs mois.
- Préparer les bouchons de gel pour la digestion enzymatique. Digérer les morceaux de gel à l'aide de la trypsine à 37 ° C pendant une nuit. Pour le protocole de gel de l'échantillon de détails, voir notre précédente publication. 22 Vous pouvez digérer faibles bandes de poids moléculaires avec la chymotrypsine en lieu et place de la trypsine,pour éliminer le clivage vaste trypsine de queues d'histones.
6. Spectrométrie de masse et analyse des données
Les échantillons sont séparés sur un LC et analysées par MS / MS. Les spectres de lancer une recherche dans une base de données de protéines pour l'identification des protéines.
- Exécuter 10 ul de chaque échantillon à travers LC / MS / MS. Nous utilisons un nano-débit Eskigent LC avec une colonne de 75 pm phase inverse. Utiliser une course LC optimisé pour une gamme de protéines et de peptides. Employer un gradient linéaire de phase mobile A (acétonitrile à 0,1% d'acide formique à 2% [ACN] dans l'eau) à la phase mobile B (0,1% d'acide formique, d'eau de 20% dans ACN): 60 mn de la phase B 5% à 50 mobiles % de B, puis de B 15 min 50% à 95% B et enfin 10 min à 95% constant B. Utilisation d'un débit de 200 Nl / min. Acquérir des données de spectrométrie de masse en mode dépendant des données. Nous utilisons un Orbitrap Thermo qui fragmente les 6 premiers ions parents les plus abondantes.
- Répétition s'étend sur au moins trois techniques biologiques et deux répétitions. (RRecommandés)
- Utilisez le logiciel (les options disponibles dans le commerce comprennent BioWorks et Xcalibur;! D'options accessibles au public comprennent PROWL, Tandem X, SpectraST) pour rechercher la base de données des spectres Uniprot de choix via un algorithme de recherche (tels que SEQUEST ou MASCOT).
- Envisager de modifier les paramètres de recherche pour permettre carbamidomethylation cystéine et la méthionine oxydation, deux modifications communes créés lors du traitement de l'échantillon.
- Calculer un taux de faux positifs en utilisant la recherche de base de données inverse.
- Filtrez les identifications de protéines de n'accepter que les matches d'un seuil de confiance. Nous recommandons les paramètres suivants pour commencer: XCORR> 3 (+2),> 4 (+3),> 5 (+4), la tolérance deltaCN> 0,1, le score de consensus ≥ 20, tolérance de la masse 2 Da pour l'ion parent, la masse de 0,5 Da pour l'ion de produit, au moins 2 peptides uniques par protéine et pas plus de 3 raté clivages.
7. Sans étiquette quantification
Determine l'abondance relative des protéines à l'aide d'étiquettes sans quantification (figure 4).
- Un certain nombre de logiciels sont publiquement disponibles dans le commerce ou pour les sans étiquette quantification des données de spectrométrie de masse, y compris de recensement (groupe du professeur Yates), 23 Elucidator (Microsoft), 24 TAMIS (Thermo Scientific), 25 d'échafaudage (Software protéome) 26. Ces programmes visent à corréler le signal de spectrométrie de masse des peptides intacts ou le nombre d'événements de séquençage de peptides avec des quantités de protéines relatives entre deux ou plusieurs Etats.
- Bien que chaque programme intègre un pipeline d'analyse similaire, certains programmes sont limités aux types d'analyses spécifiques qui peuvent être effectuées sur les données. Initialement, les données de séries différentes est aligné, l'intensité du signal est normalisé et les pics peptidiques sont sélectionnés pour l'analyse.
- Les deux méthodes les plus courantes sont la quantification basée sur le comptage spectrale ou LC-MS surface du pic. Abondanceratios sont calculés pour déterminer les changements dans l'abondance peptidique entre les différents groupes.
- Ces programmes peuvent être interfacé avec des algorithmes de recherche protéomique (Mascot, Sequest, X! Tandem) de corréler les informations de quantification pour l'identification des protéines.
- Pour assurer la précision et la reproductibilité des données, il est crucial d'intégrer les deux biologiques (différents échantillons expérimentaux) et techniques (en cours d'exécution sur le même échantillon du spectromètre de masse à plusieurs reprises) réplique les données de spectrométrie de masse.
- Variation de l'abondance peptide dans et entre les conditions expérimentales peut être évaluée par analyse de variance et dessiné via le PCA (figure 5).
Considérations importantes pour étiquette sans quantification. Lors de l'exécution sans étiquette quantification, une attention particulière doit être accordée à la préparation de l'échantillon cohérent, le temps de digestion et conditions LC-MS/MS que chaque échantillon doit être traitée et analysée séparément. Contrairement aux rencontréapproches d'étiquetage abolic, des comparaisons de sans étiquette expériences ont été faites sur les données de spectrométrie de masse distincte fonctionne (parce que l'absence d'étiquetage permet d'éviter la possibilité de les faire fonctionner ensemble), ce qui nécessite une grande reproductibilité dans tous les aspects de l'analyse des échantillons (ie de préparation d'échantillons, LC MS et étapes) et l'utilisation de spectromètres de masse à haute précision de masse.
Pour tenir compte de légers changements dans la préparation des échantillons et l'analyse d'un étalon connu peut être ajouté à chaque échantillon afin d'aider à la normalisation des données. En outre, la plupart des logiciels permettent la normalisation des intensités de signal (par exemple, en ajustant au bruit de fond ou un analyte connue abondante) après l'acquisition de données pour tenir compte des différences dans l'injection, l'ionisation et la fragmentation. Algorithmes d'alignement existent dans la plupart des logiciels mentionnés ci-dessus qui aident à corriger les différences dans les profils d'élution de peptides. L'utilisation de réplicats biologiques et techniques est essentiel dans ce type d'étude, car il permet des analyses statistiques pour confirmer la reproductibilité et la cohérence de tout changement observé dans l'abondance des protéines.
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Representative Results
La figure 4 met en évidence l'utilité de cette forme de quantification relative. Montré dans le panneau de gauche sont différents pics peptidiques monoisotopiques (recouvert de différentes souris), qui ont été désignés comme appartenant à la HMGB1 protéines (identifiés par une recherche de base de données). Chaque pic, essentiellement un chromatographe ionique extrait pour le peptide donné, provient d'une autre souris. Les groupes représentent les trois différents états physiologiques: la base, l'hypertrophie cardiaque et l'insuffisance cardiaque, avec trois répétitions pour chaque groupe biologique. En intégrant l'aire sous la courbe, une abondance relative peut être calculée. Dans le panneau central de la moyenne de ces abondances est affiché. Il ressort clairement de ce type d'analyse que l'abondance de la protéine HMGB1 évolue au cours de la maladie. En revanche, les panneaux du bas montrent l'exemple de l'histone H4 qui ne change pas avec la maladie. Dans les deux cas, les peptides provenant d'animaux de la même phenotEtat ypic présentent des profils d'élution similaires et d'abondance relative, ce qui démontre la reproductibilité de la préparation des échantillons et LC / MS / MS.
La reproductibilité de cette technique est de plus confirmée par analyse en composantes principales (ACP). Comme le montre la figure 5, l'application de l'ANOVA au cumul des résultats protéome de chaque animal analysé révèle un des groupements distincts en fonction du phénotype cardiaque (biologique répétitions) avec l'association serré entre technique répétitions (spectrométrie de masse différents passages du même échantillon) provenant du même animal . Ce qui permet de vérifier que les changements d'abondance observées pour les protéines individuelles d'intérêt sont effectivement attribuable à la différence de l'état physiologique.
D'égale importance que la quantification et la reproductibilité des résultats est l'augmentation de la couverture du protéome nucléaire activé par sous-fractionnement nucléaire. Figure 6 montre que l'analyse des le noyau tout seul ne découvrir encore une majorité des protéines nucléaires identifiées lors de la combinaison des analyses individuelles à partir des compartiments séparés (1.048 protéines uniques identifiées au total dans les fractions par rapport à 428 identifiés par les noyaux intacts). En outre, le chevauchement entre les modérés différentes fractions démontre la pertinence biologique de l'examen de ces compartiments individuellement pour un aperçu ajouté en fonction nucléaire et la régulation des gènes. Enfin, la possibilité de fractionner en particulier l'acide extrait ou un détergent extrait enrichit la chromatine pour les principaux chromatine protéines structurales, comme les histones, ce qui permet des analyses par spectrométrie de masse plus ciblées (telles que celles qui ciblent les modifications post-traductionnelles) sur un groupe de protéines sans nécessitant des anticorps spécifiques pour chaque variante et isoforme.
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Figure 1. Diagramme pour la caractérisation des protéines dans les compartiments sous cardiaques nucléaires. Cœurs de souris entiers sont homogénéisées et le lysat enrichi pour les noyaux. Les noyaux sont fractionnés en nucléoplasme, détergent extrait chromatine, et les fractions de chromatine acide extraits. Les protéines de chacun sont isolés et séparés par une dimension SDS-PAGE, et les bandes de trypsine digérés et géré par LC / MS / MS. Après une recherche de base de données, sans étiquette quantification est utilisée pour identifier les tendances d'abondance des protéines dans les différentes fractions.
Figure 2. Schéma de fractionnement nucléaire. Noyaux sont enrichis de l'homogénat de tout cœur au moyen d'un gradient de saccharose. Chaque échantillon noyaux peuvent être séparés en nucléoplasme et du détergent extraites fractions ou dans un acid-extrait fraction qui enrichit pour les histones.
Figure 3. Unidimensionnelle gel des différentes fractions. 20 pg de lysat de tout cœur (WHL), les noyaux intacts (Nuc), nucléoplasme (NUP), détergent extrait chromatine (DE), et à l'acide extrait chromatine (AE) fraction de cœur de souris ont été effectués sur une approche unidimensionnelle gel SDS-PAGE (12% acrylamide) avec fraction d'acide chromatine extraite à partir de cellules HeLa et colorées avec Oriole. La structuration différente de l'abondance des protéines totales dans les différents poids moléculaires démontrer l'existence des protéomes uniques pour les différents compartiments, y compris sous l'enrichissement des histones faible poids moléculaire dans la chromatine détergent extrait qui sont ensuite enrichis dans les fractions acides extraits . A noter également la nature beaucoup moins complexe de la fraction AE à partir de cellules HeLas par rapport à celui du coeur.
Figure 4. Quantification relative abondance des souris de trois différents états cardiaques:. Base (bleu) hypertrophie (rouge) et de l'échec (vert) ont été recueillies en trois exemplaires et leurs échantillons de protéines couru dans deux techniques reproduit par LC / MS / MS. Indiqué sur la gauche se trouvent les pics monoisotopiques pour un peptide spécifique (dont les spectres est indiquée sur la droite). L'abondance relative a été calculée par l'intégration et la moyenne entre les répétitions de chaque état phénotypique (panneau central) afin de comparer l'abondance relative du peptide (et la protéine dont il est issu) dans les différents états de l'insuffisance cardiaque. Le panneau supérieur montre un peptide de HMGB1, dont l'abondance est altérée dans la maladie, tandis que le panneau de fond (histone H4) ne change pas. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 5. Analyse en composantes principales révèle reproductibilité. Analyse de variance pour chaque souris (3 réplicats biologiques / cardiaque état technique x 2 répétitions) tracée pour l'intensité peptide (axes) montre le regroupement par état pathologique (basale en bleu, en rouge hypertrophie, insuffisance en vert), qui indique la reproductibilité réussie des données en spectrométrie de masse et d'importantes différences physiologiques entre les différents états pathologiques.
Figure 6. Caractérisation globale des différents compartiments nucléaires sous. Nous avons identifié 1048 protéines totales uniques sur l'ensemble fr 4actions. 146 protéines ont été partagées par l'ensemble des 4 fractions, par rapport à 749 protéines identifiées dans le nucléoplasme, 380 dans la fraction extraite chromatine détergent, 426 dans la fraction acide chromatine extraite, et 428 dans les noyaux intacts. Le diagramme de Venn illustre le chevauchement modéré en protéines identifiées entre les fractions, mettant en évidence l'existence de régions distinctes in vivo et la capacité de ce fractionnement de les isoler. En outre, la caractérisation nettement incomplète du protéome nucléaire totale réalisable que par l'analyse de noyaux non fractionnée (orange) justifie un fractionnement supplémentaire.
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Discussion
Deux principales méthodes d'isolement nucléaire ont été examinés précédemment: 27 on est la technique d'homogénéisation Behrens tissu lyophilisé dans un solvant non aqueux et le second, une modification, dont nous utilisons ici, d'homogénéisation des tissus dans une solution aqueuse de saccharose / solution saline suivie par différence de densité ou à gradient de centrifugation.
Sous-fractionnement des noyaux par extraction à l'acide sur des échantillons de tissus est un outil important pour l'étude de la chromatine qui a été utilisé depuis 1960, 28 avec l'objectif initial étant d'analyser les histones. Acide extraction protocoles ont été élaborés pour atteindre cet objectif de purifier les composants de base nucléosomiques histones 29 Une limitation de ces études antérieures est l'absence d'information sur les protéines non-histones constituant, et la modification de la chromatine;. Nous avons relevé ce défi avec le protocole actuel pour la caractérisation de sous-fractions distinctes biologiques du noyau et de la chromatine.Cette approche, qui utilise extraction par détergent acide ou l'extraction de la chromatine en parallèle, révèle la diversité de la chromatine molécules régulatrices et distingue trois niveaux de régulation endogène, servant ainsi une approche robuste pour la génération d'hypothèses.
L'application de la place acide extraction méthodologie pour le myocyte adulte pose quelques obstacles, y compris le cytosquelette dense et importante population mitochondriale. Alors que les versions de l'acide d'extraction ont été utilisées sur l'ensemble du tissu cardiaque 30, les expériences ont été menées de manière ciblée pour étudier les protéines connues, le protocole actuel a été conçu et a été exécuté pour permettre l'analyse du protéome impartiale. En outre, nous avons jugé utile d'examiner le détergent et l'acide extrait extrait par la chromatine séparément (seulement 37% de recouvrement n'a été observée entre les protéomes de ces deux fractions) afin de mieux comprendre les dynamiques par lesquelles ces populations protéines de la chromatine interact avec l'ADN. D'autres protocoles utilisant de l'urée à base de tampons ont également été décrites, 31,32 qui, effectuée avant l'extraction des acides, protéines enrichir moins étroitement liés au génome. En plus des fractions de chromatine, d'autres ont subfractionated le noyau d'isoler le nucléole, 33 sous-fractionnement, mais pour analyse par spectrométrie de masse des noyaux du myocarde isolé du coeur entier n'a pas été signalée.
Des études protéomiques fusil de chasse sur des noyaux intacts, c'est-organelles non fractionnée, ont été réalisées sur le tissu myocardique en utilisant une approche MudPIT 15. Cette étude a identifié 1044 protéines nucléaires cardiaques, à la même échelle que notre protocole, mais ils comptaient sur l'aide d'un moyen de 8.5 reproduit, avec chaque cycle d'une durée de 20 heures pour détecter les protéines de faible abondance. En revanche, nous avons utilisé des sous-fractionnement, à la fois augmenter le nombre de protéines identifiables (sans avoir besoin de longues chromatographie nos séries LC sont de 85 min) tout en importantly en offrant plus de données biologiques sur la localisation sub-nucléaire et l'abondance relative des protéines.
D'un cœur entier de souris (environ 0,14 g) on récupère environ 1,2 mg (0,85% du total) de protéines dans le noyau intact. À partir des noyaux intacts nous atteignons la reprise suivante pour chacun des sous-fractions (Remarque: les valeurs totales dépassent 100% en acide d'extraction et de détergent d'extraction sont effectués sur des coeurs séparés, pas en série): Nucléoplasme (15%), un détergent- extrait chromatine (85%), et de l'acide a extrait la chromatine (54%). Par comparaison, Thermo Scientific dispose d'un kit (NE-PER Réactifs nucléaire et cytoplasmique) qui leur fiche indique les rendements de protéine cytosolique 1,6 mg et 0,6 mg de protéine nucléaire (1,5%) de 40 mg de cœur de souris avec un entre 10% la contamination croisée les deux fractions. Sigma a un kit (NXTRACT, Kit CellLytic extraction nucléaire) qui ont testé le muscle de lapin, mais pas le cœur, et récupéré à partir de 100 tissus 0,4 mg6 mg de protéine nucléaire (0,46%) dans ce qu'ils appellent leur «nucléaire rudimentaire pellets" avec une "quelques pour cent" de la contamination cytoplasmique. D'autres sociétés, telles que Epigentek offrent également des kits, mais nous avons été incapables de trouver des détails spécifiques sur l'enrichissement et la pureté de leurs sites de comparaison.
Nous avons décrit une nouvelle technique pour répond au besoin actuel d'enrichissement succès de noyaux cardiaque pour les études protéomiques. En outre, nous décrivons la méthodologie pour le fractionnement compartiment sous, ce qui augmente à la fois la capacité de détecter des protéines moins abondantes ainsi que permet la résolution, plus la quantification et la détermination de la localisation des protéines. À cette fin, le protocole d'analyse par spectrométrie de masse offre des lignes directrices recommandées, mais au cas par cas, des considérations très probablement nécessaires. Par exemple, nous avons constaté que le grand nombre d'isoformes cardiaques des variantes des histones avec une similarité de séquence manuel d'inspection requis des spectres d'affecter maJor pics et confirmer masse des ions parents avant de pouvoir attribuer avec confiance les spectres. 14 paramètres de recherche peuvent également être personnalisés pour modification post-traductionnelle (PTM) d'identification et d'excellentes critiques détaillant existe des méthodes et des préoccupations avec l'interprétation des données pour l'analyse PTM (y compris l'enrichissement PTM , 34 logiciels pour PTM, 35 l'analyse des PTM combinatoires, 36 stratégies alternatives de fragmentation 37 et digestion alternative et traitement 38,39).
L'enrichissement et le fractionnement décrit est de tout coeur (ce qui est cardiomyocytes 50-70% en masse). Bien que ces aspects des sacrifices de spécificité cellulaire qui peut être particulièrement important pour certaines familles de protéines nucléaires, il permet une suspension beaucoup plus rapide des protéines dans des tampons appropriés, ce qui n'est pas possible avec des adultes myocytes protocoles d'isolement cellulaire. De cette façon, cette méthode préserve mieux l'intégrité of l'échantillon contre la dégradation. Cependant, également décrit des instructions d'application du présent protocole isolés myocytes ventriculaires de rats nouveau-nés, puisque les deux modèles organisme isolé des cellules et l'ensemble des outils nécessaires pour étudier l'insuffisance cardiaque. En principe, cette méthode pourrait également être appliquée à des myocytes adultes extraites par digestion enzymatique des coeurs isolés avec-la mise en garde que les changements dans la liaison aux protéines qui se produisent lors de l'isolement (qui peut durer plus d'une heure) sera fausser l'interprétation des observations protéomiques.
Nous avons développé cette méthodologie pour comprendre les changements dans le protéome nucléaire et maquillage chromatine qui contribuent à la maladie 14. Cependant d'autres applications comprennent l'étude de relance spécifiques changements dans la composition du protéome dans la physiologie normale. En outre, le sous-fractionnement offre la possibilité d'un nouveau niveau de qualification de la façon dont les protéines fonctionnent et localiser à travers différentes régions fonctionnelles du noyau.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Le laboratoire Vondriska est financée par des subventions de l'Institut National Heart, Lung and Blood du NIH et la Fondation Laubisch à l'UCLA. EM est destinataire de la Jennifer S. Buchwald bourse d'études supérieures en physiologie à l'UCLA; HC est le destinataire d'un American Heart Association pré-doctoral, le député est le récipiendaire d'une NIH Ruth Kirschstein post-doctoral, et SF est le récipiendaire du une NIH K99 Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbeco Modified Eagle Medium | Invitrogen | 11965 | |
| Protease pellet | Roche | 04 693 159 001 | |
| 100 μm strainer | BD Falcon | 352360 | |
| Ultracut ultramicrotome | Reichert | ||
| 100CX Transmission Electron Microscope |
JEOL USA, Inc. | ||
| Oriole | BioRad | 161-0496 | |
| Histone H2A antibody | Santa Cruz | sc-8648 | |
| Nucleoporin p62 antibody | BD Biosciences | 610498 | |
| Adenine nucleotide transporter antibody | Santa Cruz | sc-9299 | |
| BiP antibody | Santa Cruz | sc-1050 | |
| Tubulin antibody | Sigma | T1568 | |
| Histone H3 antibody | Abcam | ab1791 | |
| Fibrillarin antibody | Cell Signaling | C12C3 | |
| SNRP70 antibody | Abcam | ab51266 | |
| E2F-1 antibody | Thermo Fisher | MS-879 | |
| Retinoblastoma antibody | BD Biosciences | 554136 | |
| Hypoxia inducible factor-1 antibody | Novus Biologicals | NB100-469 | |
| BCA protein assay | Thermo Scientific | 23227 | |
| Reverse phase column | New Objective | PFC7515-B14-10 | |
| BioWorks Browser | Thermo Scientific |
References
- Li, F., Wang, X., Capasso, J. M., Gerdes, A. M. Rapid transition of cardiac myocytes from hyperplasia to hypertrophy during postnatal development. J Mol Cell Cardiol. 28, 1737-1746 (1996).
- Rumyantsev, P. P. Interrelations of the proliferation and differentiation processes during cardiact myogenesis and regeneration. Int Rev. Cytol. 51, 186-273 (1977).
- Olson, E. N., Schneider, M. D. Sizing up the heart: development redux in disease. Genes Dev. 17, 1937-1956 (2003).
- Molkentin, J. D., Dorn, G. W. 2nd Cytoplasmic signaling pathways that regulate cardiac hypertrophy. Annu Rev. Physiol. 63, 391-426 (2001).
- Fishman, M. C., Chien, K. R. Fashioning the vertebrate heart: earliest embryonic decisions. Development. 124, 2099-2117 (1997).
- Rajabi, M., Kassiotis, C., Razeghi, P., Taegtmeyer, H. Return to the fetal gene program protects the stressed heart: a strong hypothesis. Heart Fail Rev. 12, 331-343 (2007).
- Roger, V. L., et al. Heart disease and stroke statistics--2011 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 123, e18-e209 (2011).
- Schirmer, E. C., Florens, L., Guan, T., Yates, J. R. 3rd, Gerace, L. Nuclear membrane proteins with potential disease links found by subtractive proteomics. Science. 301, 1380-1382 (2003).
- Lambert, J. P., Mitchell, L., Rudner, A., Baetz, K., Figeys, D. A novel proteomics approach for the discovery of chromatin-associated protein networks. Mol. Cell Proteomics. 8, 870-882 (2009).
- Malik, P., et al. Cell-specific and lamin-dependent targeting of novel transmembrane proteins in the nuclear envelope. Cell Mol Life Sci. 67, 1353-1369 (2010).
- Tweedie-Cullen, R. Y., Reck, J. M., Mansuy, I. M. Comprehensive mapping of post-translational modifications on synaptic, nuclear, and histone proteins in the adult mouse brain. J. Proteome Res. 8, 4966-4982 (2009).
- Chu, D. S., et al. Sperm chromatin proteomics identifies evolutionarily conserved fertility factors. Nature. 443, 101-105 (2006).
- Uchiyama, S., et al. Proteome analysis of human metaphase chromosomes. J. Biol. Chem. 280, 16994-17004 (2005).
- Franklin, S., et al. Specialized compartments of cardiac nuclei exhibit distinct proteomic anatomy. Mol. Cell Proteomics. 10, (2011).
- Kislinger, T., et al. Global survey of organ and organelle protein expression in mouse: combined proteomic and transcriptomic profiling. Cell. 125, 173-186 (2006).
- Moore, D. H., Ruska, H. Electron microscope study of mammalian cardiac muscle cells. J. Biophys Biochem. Cytol. 3, 261-268 (1957).
- Anversa, P., Vitali-Mazza, L., Visioli, O., Marchetti, G. Experimental cardiac hypertrophy: a quantitative ultrastructural study in the compensatory stage. J. Mol. Cell Cardiol. 3, 213-227 (1971).
- Franklin, S., et al. Specialized compartments of cardiac nuclei exhibit distinct proteomic anatomy. Mol Cell. Proteomics. 10, (2011).
- Paulsson, A. K., et al. Post-translational regulation of calsarcin-1 during pressure overload-induced cardiac hypertrophy. Journal of molecular and cellular cardiology. 48, 1206-1214 (2010).
- Franklin, S., et al. Quantitative analysis of the chromatin proteome in disease reveals remodeling principles and identifies high mobility group protein b2 as a regulator of hypertrophic growth. Mol Cell Proteomics. 11, (2012).
- Gramolini, A. O., et al. Comparative proteomics profiling of a phospholamban mutant mouse model of dilated cardiomyopathy reveals progressive intracellular stress responses. Mol Cell Proteomics. 7, 519-533 (2008).
- Singh, H., Warburton, S., Vondriska, T. M., Khakh, B. S. Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels. J. Vis. Exp. (27), e1178 (2009).
- Park, S. K., Venable, J. D., Xu, T., Yates, J. R. 3rd A quantitative analysis software tool for mass spectrometry-based proteomics. Nat. Methods. 5, 319-322 (2008).
- Lomenick, B., et al. Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS). Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 21984-21989 (2009).
- Kamleh, A., et al. Metabolomic profiling using Orbitrap Fourier transform mass spectrometry with hydrophilic interaction chromatography: a method with wide applicability to analysis of biomolecules. Rapid Commun. Mass Spectrom. 22, 1912-1918 (2008).
- Searle, B. C. Scaffold: a bioinformatic tool for validating MS/MS-based proteomic studies. Proteomics. 10, 1265-1269 (2010).
- Murray, K. The Basic Proteins of Cell Nuclei. Annu Rev. Biochem. 34, 209-246 (1965).
- Johns, E. W., Phillips, D. M., Simson, P., Butler, J. A. Improved fractionations of arginine-rich histones from calf thymus. Biochem. J. 77, 631-636 (1960).
- Rodriguez-Collazo, P., Leuba, S. H., Zlatanova, J. Robust methods for purification of histones from cultured mammalian cells with the preservation of their native modifications. Nucleic Acids Res. 37, e81 (2009).
- Kuehl, L., Salmond, B., Tran, L. Concentrations of high-mobility-group proteins in the nucleus and cytoplasm of several rat tissues. J. Cell Biol. 99, 648-654 (1984).
- Gronow, M., Griffiths, G. Rapid isolation and separation of the non-histone proteins of rat liver nuclei. FEBS Lett. 15, 340-344 (1971).
- Mischke, B. G., Ward, O. G. Isolation and tissue specificity of chromatin-associated proteins in Vicia faba. Can J. Biochem. 53, 91-95 (1975).
- Andersen, J. S., et al. Directed proteomic analysis of the human nucleolus. Curr. Biol. 12, 1-11 (2002).
- Zhao, Y., Jensen, O. N. Modification-specific proteomics: strategies for characterization of post-translational modifications using enrichment techniques. Proteomics. 9, 4632-4641 (2009).
- Ahrne, E., Muller, M., Lisacek, F. Unrestricted identification of modified proteins using MS/MS. Proteomics. 10, 671-686 (2010).
- Young, N. L., Plazas-Mayorca, M. D., Garcia, B. A. Systems-wide proteomic characterization of combinatorial post-translational modification patterns. Expert Rev. Proteomics. 7, 79-92 (2010).
- Guthals, A., Bandeira, N. Peptide identification by tandem mass spectrometry with alternate fragmentation modes. Mol. Cell Proteomics. , (2012).
- Wu, C., et al. A protease for 'middle-down' proteomics. Nat. Methods. , (2012).
- Tran, J. C., et al. Mapping intact protein isoforms in discovery mode using top-down proteomics. Nature. 480, 254-258 (2011).
