Summary
質量分析法の進歩により、組織の宿主におけるタンパク質発現および変更のハイスループット解析を可能にした。細胞下分画と疾患モデルと組み合わせることで、定量的質量分析法とバイオインフォマティクス、生物学的システムに新しい特性を明らかにすることができます。本明細書に記載される方法は、心臓病の設定でクロマチン関連タンパク質を解析し、他に容易に適用可能である
Abstract
核の中でその機能が最も密接な遺伝子調節にリンクされているプロテオームを常駐しています。哺乳類成体心筋細胞核DNAの大部分はヘテロクロマチン状態、相間の永続的な状態にある成人核をレンダリングする心筋細胞の非分裂性質1、二核細胞の割合が高いのために独特である。2転写調節は、開発時とこの病気は、このオルガンでよく研究されて3月5日が、何が比較的未開拓のままでは、DNAのパッケージングおよび発現に関与する核タンパク質が果たす役割であり、どのように病気の経過中に生じる転写プログラムにおけるこれらのタンパク質制御の変更。開発した6世界では、心臓病は、男性と女性両方のため死亡原因の第1位です。核タンパク質は、この病気の進行を調節するために協力する方法について7 Insightは、現在の治療oを進めるために重要であるptions。
質量分析法は、それが病気とどのようにこれらのタンパク質の量が変化するため、核プロテオームと相対定量の公平な注釈を可能として、これらの質問に対処するための理想的なツールです。最近まで哺乳類の核タンパク質複合体、8月13日にいくつかのプロテオミクス研究がなされているものの14は、心臓核プロテオームを調べるだけで一つの研究がなされており、それはむしろ核サブコンパートメントのレベルでプロテオームを探索するのではなく、核全体を考慮15大部分では、仕事のこの不足は、心臓核を単離することが困難なためである。心臓核が筋収縮を変化させるが、その全体的な形状図16はさらに、心筋細胞は17巻までに40％ミトコンドリアである限り、彼らは小胞体からの複数の拡張子を介して接続されている硬質かつ緻密なアクチン-ミオシン装置内で発生するnecessita他の細胞小器官は別に核の濃縮をTES。ここでは、心臓の核濃縮と生物学的に関連したコンパートメントにさらに分別するためのプロトコルを記述します。さらに、代謝標識が不可能な様々な動物モデルや器官系を用いたin vivo実験で影響を受けやすいこれらの画-技法のラベルフリー定量的質量分析解離の詳細メソッド。
Protocol
実験のワークフローの主要7の手順を実行します（ 図1）が含まれています。質量分析計で実行されるサンプルを含む任意の仕事のために、実験者は白衣、手袋、ヘアネットを着用し、粉塵やケラチンの個人的な脱落による汚染を避けるために世話をする必要があります。
1。ハート均質化と核分離
マウスの心臓は均質化され、無傷の核ペレット（ 図2）を単離する。
- 2ミリリットルを含む、心臓消費税、成体マウスを生け贄に（私たちは、フィッシャーから＃08-414-13Aをウィートン組織グラインダーを好むが、他の方法が均等にうまくいくかもしれませんが）を氷冷PBSですすぎ、ガラスダウンス氷上でホモジナイズ溶解バッファー（10 mMトリスpH 7.5、15 mMのNaCl、0.15％（v / v）のノニデットP-40 [NP-40]脱イオン水に加えて（差動核を含む細胞内小器官を介して細胞膜を溶解低張液）のプロテアーゼおよびホスファターゼInhibitor混合液：10mMの酪酸ナトリウム、0.1mMのフッ化フェニル[PMSF]、0.2 mMののNa 3 VO 4、0.1mMのNaFおよび1ロシュプロテアーゼpellet/10ミリリットル-溶解緩衝液を-20℃で1週間まで保存することができる）。 （ 注：私達は私達の質量分析データとして、PBSで心臓を灌流することが必要になると分析は、主に心筋血液汚染とは対照的に、起源は[p値3.8E-22] [p値5.0としてタンパク質を同定行かないE-2]。）
- 100μmのストレーナーを通してライセートおよび1.5 mlの遠心チューブ内を通る流れを集める注ぐ。指定がない限り、この時点で、サンプルを氷上で保たれるべきである。
- 4℃で5分間4000 rpmで遠心
- 上清を除去します。 （これは細胞質であり、-80℃で保存してくださいC.それは溶解ミトコンドリアが含まれています）。摩により200μlの溶解バッファーでペレットを再懸濁します。 （これは粗核ペレットです。）
- スクロースバフ1mlの1.5 mlの遠心管を埋めるER（24％ショ糖重量/体積の10mMトリス（pH7.5）、およびプロテアーゼ/ホスファターゼ阻害剤の混合物とイオン水のNaCl 15mMの - スクロースバッファーは、使用当日に新鮮なされるべきである）。 4℃で10分間5,000 rpmでスクロースパッドと遠心の上にそっと層、再懸濁したペレットを
- 上に薄膜と同様にスクロースパッド（膜を含む）を削除します。 200μlの氷冷PBS / EDTA（1mMのEDTAの1x PBS）で残ったペレットを洗浄します。 （これは核ペレットで、ウエスタンブロット法や電子顕微鏡で使用するための可溶化または固定することができます[手順4.1と4.2を参照してください]濃縮を定量化する。）
2。核質と洗剤に抽出されたクロマチン分画
粗製核ペレットを緩くするDNAに関連するタンパク質を含む、核質と洗剤抽出クロマチン画分とに分離される。
- 200μlの洗剤抽出緩衝液（2のステップ1.6からペレットをひいて粉にする0 mMのHEPES緩衝液pH 7.6、7.5 mMのMgCl 2。 0.2mMのEDTA、30mMのNaCl、1mMのM尿素、1％NP-40プロテアーゼ/ホスファターゼ阻害剤の混合物との脱イオン水で - 洗剤抽出バッファー）は-20℃で1週間用に保存することができます。
- 渦サンプル2回、10秒毎に。氷上で10分間の上に置きます。
- 4℃で5分間、13,000 rpmで遠心する
- 上清を除去します。 （これは核質であり、-80℃で保存してください）。氷冷PBS / EDTAでペレットを洗浄します。 （これはクロマチンペレットです。）
- トリス、SDS、EDTA緩衝液で1週間のために状態に保つことができます - プロテアーゼ/ホスファターゼ阻害剤の混合物を用いて脱イオン水で1％SDSを300μlのトリス、SDS、EDTA緩衝液（50mMトリスpH7.4、10mMのEDTA、ペレットを砕いて粉にする-20℃）。
- 10秒毎にDNAを分割するための3-6倍を超音波洗浄します。 sonications間にサンプルを氷上に保つ。
- 4℃で5分間、13,000 rpmで遠心する上清をキープする。 （上清洗剤抽出されたクロマチンタンパク質fractioですnとは-80℃）で保たれるべきである。残ったペレットは小さくなければならず、廃棄することができる。
- 10％ウシ胎児血清（FBS）を含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、1％のインスリンで培養した酵素消化を用いて、出生後の仔ラット1日から新生仔ラット心室筋細胞を分離：全体ではなく、心の孤立した筋細胞を使用している場合 - トランスフェリン - 亜セレン酸ナトリウム（ITS）、および1％ペニシリン。 24時間後、無血清培地（上記と同じですが、FBSを欠く）に転送されます。収穫溶解緩衝液中の細胞（1.1に記載されている）、ステップ1.3で核分別を開始します。
3。酸抽出分画 - DNA結合タンパク質の濃縮
ヒストンを含めしっかりとDNAに結合したタンパク質に対して、個別の分別を豊かに。
- ステップ1.1から2.4を繰り返します。
- 0.4 N硫酸400μlのクロマチンペレットを砕いて粉末にする。塊を削除する渦。
- 30分またはovern 4℃でインキュベートIGHT回転させながら。
- 4℃で10分間16000×gで遠心°C核破片を除去する。
- 新しいチューブに上清を移してください。
- トリクロロ酢酸の132μlの上清に滴下を追加します。数回転倒。氷上で30分間インキュベートします。
- 4℃で10分間16000×gで遠心分離し、
- 上清を捨てる。優しく氷冷アセトンでペレットをすすいでください。 （これはヒストンペレットです。）
- 4℃で10分間16000×gで遠心分離し、
- 洗浄、ステップ3.8から3.9を繰り返します。
- 空気乾燥ペレット。
- トリス、SDS、EDTA緩衝液100μl中にペレットを再懸濁します。 1MのTrisを添加することによりpHを8に設定します。 （pH調整しない1 Mトリスの在庫を使用してください。）
- 15分間水浴中で超音波洗浄します。水浴に氷を追加することで過熱を防止。 （これは、酸抽出画分であり、-80℃で保存してください）
4。純度チェック
ウエスタンブロット法および電子顕微鏡核や他の細胞小器官の枯渇の成功濃縮を確認します。以下の品質管理検定のすべての典型的な結果を表示するには、我々の前の出版物を参照してください。18
- ウエスタンブロット分析を実行します。ヒストンH2AまたはヌクレオポリンP62（濃縮を確認するために核のマーカーとして）、およびアデニンヌクレオチドトランスポーター、BIPおよびチューブリン（ミトコンドリアマーカー、小胞体マーカー、それぞれ純度を検証するための細胞骨格マーカーなど）の各画分を含むプローブメンブレン。核の亜分画に成功、ヒストンH3またはフィブリラリン（洗剤と酸抽出したクロマチンと無傷核）とSNRP70またはE2F（核質）用プローブを確認します。網膜芽細胞腫または低酸素誘導因子-1用プローブ（酸抽出画分オーバー洗剤抽出クロマチンに富む）。 HeLa細胞ライセートと心臓全体溶解物の追加の制御サンプルも同じゲルで実行することができます：ED、トリス、SDSを加えることによってHeLa細胞ライセートコントロールを準備培養皿にバッファTAとサンプルを収集するために、セルスクレーパーを使用しています。超音波処理およびステップ2.6から2.7のように試料を遠心分離する。 2mlの緩衝液（20mMトリスpH7.4、150mMのNaCl、1mMのEDTA、1mMのEGTA、1％トリトンX-100、2.5mMのピロリン酸ナトリウム、脱イオン水で1 mMのグリセロリンに心を均質化することにより、心臓全体のライセートのコントロールを準備プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤の混合物を含む）。超音波処理およびステップ2.6から2.7のように遠心分離します。 SDS-PAGE用のタンパク質試料を調製するためのステップ5を参照してください。
- 電子顕微鏡：2％グルタルアルデヒドを含む溶解緩衝液中でステップ1.6から核ペレットを再懸濁し、4℃でサンプルを修正℃にオスミウム酸でサンプルをすすぎ、脱水、エポキシ樹脂中に埋め込みます。ライヘルトUltracutウルトラミクロトームを用いた70nmのスライスをカット。 JEOL 100CX透過型電子顕微鏡を用いて酢酸ウラニルと、リードと画像のサンプルを染色。画像化された材料の総面積に対する無傷核の面積を測定することによって濃縮を定量化する。 我々は核 の60から80パーセントを見つける無傷で14
核を豊かに対浄化するための重要な考慮事項について説明します。このプロトコルは、病気の間にグローバルな遺伝子制御プロセスの勉強のために、心臓のクロマチンのプロテオーム解析を可能にするために開発されました。全プロテオーム質量分析実験を設計の主要なコンポーネントは、ダイナミックレンジと低濃度タンパク質を同定し、特徴づけることができるという問題です。核のプロテオームを濃縮、核およびクロマチン固有の生物学に関する情報の提供を第一の目標に加えて、核のさらなる亜分画が行うように、これらの低濃度タンパク質を検出らしさを向上させます。説明したようにしかし、成体心筋細胞は核膜に接続されている高密度の細胞骨格成分を持っています。我々は完全にこれらの他の細胞成分から核を精製していることを信じていません。しかし、核だけ豊かで、我々は入手していED説明解析の種類を有効にするには、許容可能なしきい値。
具体的には、我々は原油核ペレットの純度を評価するためにEMを使用し、無傷核、ミトコンドリアは約10％、残りの破片であることが分画の60から80パーセントを発見した。さらに、我々は無傷核集団における我々の以前の研究から、知っている多くの筋フィラメントは、このプロトコルの特定のタンパク質（calsarcin-1）濃縮されている（西によって測定されたチューブリンやアクチンを含む）の真の生物学的な人口を示唆することによって豊かにされていない間心臓核におけるこれらのタンパク質19
さらに、我々は、遺伝子オントロジーによって、これらのタンパク質の予測ロールに、酸抽出したクロマチン分画に存在することが判明したタンパク質を比較した。重要なのは、この遺伝子オントロジー分析はアカウントの異なるタンパク質の相対量（当社のウエスタンブロットデータの場合と同様に）を考慮していないのではなく、識別されたすべてのタンパク質（豊かカウント等しいとしてEDかどうかにかかわらず）共通の経路と細胞区画を識別する。これらの経路と細胞区画我々の以前の出版物で見つけることができるの分析。18,20最も重要なことは、酸抽出したクロマチン分画の濃縮の成功は、私たちは成体マウスの心筋細胞の54ヒストン変異体の存在を識別するために許可され、18そのうちの多くは、その身分を示す1ユニークなペプチドに頼って、従っておそらく合計心筋細胞プロテオームの膨大な複雑さを指定して、この濃縮プロトコルなしで検出可能でなかったでしょう。我々は心臓核から同定1048タンパク質のうち、そのうちの56例（5.3％）がヌクレオソーム（関心の核の1コンポーネント）の一部であるとの分析をGOで注釈された。心臓全体を見て別の研究では、わずか11タンパク質（0.18％）がヌクレオソーム21の一部であることを注釈されたうち、6180のタンパク質を同定した。これは、さらなるmeaningfuに、我々のプロトコルの強さを示してLLY核タンパク質を濃縮する。
5。タンパク質ゲルおよび酵素タンパク質消化
タンパク質は、質量分析計で実行されるように消化された一次元SDS-PAGEおよびトリプシンで区切られています。
- サンプルを氷上で解凍し、ビシンコニン酸（BCA）タンパク質アッセイを用いて、各サンプルのタンパク質濃度を決定する。
- 一次元SDS-PAGEのために-20℃で10分間、店舗用に5倍Laemmliバッファー、ボイルを使用して、既知の濃度になるように試料を希釈します。 2次元ゲル-20℃で尿素抽出バッファーとストアを使用して既知の濃度にサンプルを希釈します。
- 各レーンに等量のタンパク質をロードする選択肢のゲルを実行します。タンパク質ウェスタンブロット法（ステップ4.1のコントロールと同じように）またはバンドに使用されるニトロセルロース膜に転写することができますが、質量分析のためにカットすることができます。次の手順を参照してください。
- 清潔な容器にそれを転送するために脱イオン水を使用している装置からゲルを取り出します。オリオールでゲル染色し、光を遮断するためアルミホイルでラップ容器をカバーしています。ゲルは少なくとも90分間シェーカーで室温でインキュベートすることができます。
- バンドはイメージにカットされた画像オリオール染色し、UV光を用いたゲル（ 図3）、マーク。 我々は合計プロテオームを測定する研究のために約25 mmの2バンドに各レーンを切った。
- 清浄表面上にゲルを置きます。シール性を保持されているか、またはケラチン汚染を防止するために、エタノールを噴霧するだけの材料を使用してください。各バンドを切り出した後、さらに3等分にスライスする。独自のラベルの付いた1.5 mlチューブにまとめて、各バンドのすべての3つのピースを置きます。ゲル片は数ヶ月のために-20℃で保存することができます。
- 酵素消化のためにゲルプラグを準備します。ダイジェストゲル片を37℃で一晩トリプシンを使用しています。詳細なゲル試料プロトコルのための私達の前の資料を参照してください。22あなたは、トリプシンの代わりにキモトリプシンで低分子量のバンドを消化することができ、ヒストン尾部のトリプシンの広範な谷間を解消します。
6。質量分析とデータ解析
サンプルは、LCで分離し、MS / MSによって分析される。スペクトルは、タンパク質同定のタンパク質データベースに対して検索されます。
- LC / MS / MSを介して各サンプルの10μlを実行します。我々は、75μmの逆相カラムを用いたナノフローEskigent LCを使用しています。タンパク質およびペプチドの範囲に最適化LC分析を使用しています。 （0.1％ギ酸、2％アセトニトリル[ACN]水）移動相から移動相Bの直線勾配を採用（0.1％ギ酸、ACN中20％水）：5％移動相Bの50から60分％Bは、定数95％Bで50％Bからついに95％B、10分〜15分は200 NL / minの流量を使用します。データ依存モードでの質量分析データを取得する。 我々はトップ6最も豊富な親イオンを断片サーモオービトラップを使用しています。
- 繰り返しは、少なくとも3つの生物のために動作し、2つの技術的には複製されます。 （Recommended）
- 検索アルゴリズム（例えばSEQUESTまたはマスコットとして）を経由して、選択したUNIPROTデータベースに対してスペクトルを検索し、（公に利用可能なオプションは、徘徊を含む、Xタンデム、SpectraST！市販オプションはBioWorksとXcaliburを含む）には、ソフトウェアを使用してください。
- カルバミドメチルシステイン及びメチオニン酸化、サンプルの処理中に作成された2つの一般的な変更を可能にするために、検索パラメータを変更することを検討します。
- 逆にデータベース検索を使用して偽陽性率を計算します。
- しきい値の信頼のマッチだけを受け入れるようにタンパク質同定をフィルタリングします。我々は、で開始するには、次のパラメータをお勧めします。xcorrは> 3（2）> 4（3）> 5（4）; deltaCN> 0.1、コンセンサススコア≥20、親イオンの質量公差2 DA、質量公差プロダクトイオンは0.5 DAの、少なくとも2つのユニークなタンパク質あたりのペプチドおよびこれ以上より3裂を逃した。
7。ラベルフリー定量
Deteラベルフリー定量（ 図4）を用いたタンパク質の相対量をrmine。
- ソフトウェアプログラムの数は、国勢調査（教授Yatesのグループ）、23説明者（マイクロソフト）、24篩（サーモサイエンティフィック）、25足場（プロテオームソフトウェア）を含む質量分析データのラベルフリー定量化のために公にまたは市販されている。26これらのプログラムは、無傷のペプチドまたは2つ以上の状態との間の相対的なタンパク質の量を有するペプチドシークエンシングのイベント数の質量信号を相関させることを目指しています。
- 各プログラムは類似した解析パイプラインを組み込んだが、一部のプログラムがデータに対して実行できる特定の分析のタイプに制限されます。当初は、異なる実行からデータが整列し、信号強度が正規化されたペプチドのピークは分析のために選択される。
- 二つの最も一般的な方法は、スペクトルカウントまたはLC-MSピーク面積に基づいて定量化されています。豊富比率が異なるグループ間のペプチド量の変化を決定するために計算されます。
- これらのプログラムは、タンパク質の同定に定量情報を相関させるためにプロテオミクス検索アルゴリズム（マスコット、SEQUEST、X！タンデム）とインタフェースすることができます。
- それは（質量分析計で複数回同じサンプルを実行している）生物（異なる実験試料）と技術の両方を組み込むことが重要であるデータの精度と再現性を確保するための質量分析データのレプリケートされます。
- 実験条件との間のペプチド豊かさの変動をANOVAによって評価およびPCA（ 図5）を介してプロットすることができます。
ラベルフリー定量化のための重要な考慮事項。ラベルフリー定量を行う場合は、特別な注意は、各試料が処理され、別々に分析しなければならないので、一貫性のある試料調製、消化時間とLC-MS/MS条件を確保するために与えられなければならない。 METとは対照的に（ラベリングの欠如が一緒にそれらを実行する可能性を回避するため）abolicラベリング·アプローチは、ラベルフリーの実験で比較することにより、（サンプル準備のすなわち 、サンプル分析のすべての面で高い再現性を必要と、異なる質量分析実行からのデータに作られていますLCとMSの手順）と高質量精度質量分析計を用いる。
試料調製及び分析知られている標準のわずかな変化を把握するために、データの正規化を支援するために、各試料に添加してもよい。また、ほとんどのソフトウェアプログラムは、注射、イオン化し、断片化の違いを考慮するために、データ取得後のシグナル強度（バックグラウンドノイズまたは既知の豊富な検体に調整することによって、 など ）の標準化を可能にします。整列アルゴリズムは、ペプチド溶出プロファイルの違いを補正するのに役立つ上に参照したソフトウェアプログラムのほとんどに存在します。生物学的および技術的レプリケートの使用が不可欠であるそれは統計解析は、タンパク質が豊富で、任意の観測された変化の再現性と一貫性を確認することができるように、研究のこのタイプでは必須の条件です。
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Representative Results
図4は、相対定量のこの形式の有用性を強調しています。左側のパネルに表示されているタンパク質HMGB1（データベース検索を経由して識別される）に属するものとして指定されている個々のモノペプチドのピークは（異なるマウスから重ねて）である。各ピークは、本質的に与えられたペプチドの抽出イオンクロマトグラフは、異なるマウスから来ている。 3生物学的なグループごとに複製して、基底、心肥大、心不全：グループは、3つの異なる生理状態を表す。曲線の下の面積を積分することにより、相対的な存在量を計算することができます。中央のパネルでこれらの存在量の平均値が示されています。それは、HMGB1タンパク質の存在量は、疾患の経過中に変化していることがこのタイプの分析からも明らかである。これとは対照的に、下部のパネルは、病気では変更されませんヒストンH4の一例を示す。両方の場合において、ペプチドは同じphenotの動物から来るypic状態は、サンプル調製およびLC / MS / MSの再現性を実証し、同様の溶出プロファイルと相対的な豊かさを示しています。
この手法の再現性をさらに主成分分析（PCA）を用いて確認された。 図5に示すように、分析された各動物の総プロテオーム結果にANOVAのアプリケーションは、同じ動物からレプリケート間の技術的なタイトなアソシエーション（異なる質量スペックは同一サンプルの実行）で心臓の表現型（生物が複製）によって異なるクラスタリングを明らかに。これは、興味のある個々のタンパク質について観察された資源量変化は確かに生理的な状態の違いに起因するものであることの信頼性を提供する。
結果の定量性や再現性と同等に重要なのは核の亜分画では有効になって核プロテオームの増加カバレッジです。 図6は、その分析を示す単独で全体の核があっても別々の区画（無傷核から識別428対分数全体の合計で同定1048ユニークな蛋白質）から、個々の分析を組み合わせたときに特定の核タンパク質の大部分を明らかにするために失敗します。さらに、種々の画分の間に適度な重なりが個別に核機能と遺伝子調節に追加された洞察力のためのこれらの区画を考慮しての生物学的関連性を示しています。最後に、能力に特異的に分画し、酸抽出や、ヒストンなどの主要なクロマチン構造タンパク質のためのクロマチンを豊かに洗剤を抽出し、それによってタンパク質のグループにもっと焦点を当てた質量分析（例えば、それらのそのターゲットは、翻訳後修飾など）を有効にせずに各変異体およびアイソフォームに特異的な抗体を必要とする。
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図1。心臓核サブコンパートメント内でのタンパク質の特性評価のためのフローチャートを全マウス心臓を均質化し、溶解物は核が濃縮されています。核は核質、洗剤抽出さクロマチン、酸抽出されたクロマチン画分に分画されています。それぞれからのタンパク質を単離し、一次元SDS-PAGEにより分離し、トリプシンは、LC / MS / MSにより消化し、実行するバンド。アールデータベース検索した後、ラベルフリー定量は異なる画分中のタンパク質のための豊富な傾向を識別するために使用されます。
図2。核分別概略図。核はショ糖勾配を介して心臓全体のホモジネートから濃縮されている。それぞれの核のサンプルはどちら核質と洗剤抽出された画分にするか、ACに分けることができるヒストンのための豊かそのid-抽出画分。
図3。異なる画分の一次元ゲル。心臓全体のライセート（WHL）、無傷核（NUC）の20μg、核質（NUP）、界面活性剤抽出クロマチン（DE）は、マウスの心臓から酸抽出されたクロマチン（AE）画HeLa細胞から抽出された抗酸クロマチン画分と一緒に一次元SDS-PAGEゲル（12％アクリルアミド）上で実行され、オリオールで染色した。様々な分子量での総タンパク質の量の異なるパターニングはさらに、酸抽出した画分に濃縮されている界面活性剤抽出されたクロマチンにおける低分子量のヒストンの濃縮など、様々なサブコンパートメントのユニークなプロテオームの存在を実証。また、ノートのAE分数の実質的にそれほど複雑な性質は、HeLa細胞からのものであるSは、心臓からのものと比較。
図4。相対的な存在量の定量化三つの異なる心臓の状態からマウス：基底（青）肥大（赤）と障害（緑）三連で収集され、それらのタンパク質サンプルは、次の二つの技術に走ったLC / MS / MSにより複製されます。左図のように、特定のペプチド（そのスペクトルが右に表示されます）のためのモノアイソトピックピークである。相対的な豊かさは、統合によって計算され、心不全の異なる状態のペプチドの相対量（そして、それが来たタンパク質）を比較するために、各表現型の状態（中央のパネル）の複製の間で平均した。ボトムパネル（ヒストンH4）は変更されませんが上部パネルには、豊富な病気で変更されるHMGB1、からペプチドを示しています。 拡大図を表示するにはここをクリック 。
図5。主成分分析では、再現性を明らかにしていますが、マウスのANOVA分析（3生物が複製/心臓の状態x 2技術的には複製）ペプチド強度（軸）に対してプロットされ、病気の状態によってクラスタリング（青色の基底は、赤色の肥大、緑の故障）を示しています質量分析データと異なる病気の状態との間に有意な生理的な違いの成功した再現性を示します。
図6。異なる核サブコンパートメントのグローバルな特性。我々は、すべての4 FR全体で1048総ユニークなタンパク質を同定アクション。 146タンパク質は無傷核で749核質で同定されたタンパク質、界面活性剤を抽出したクロマチン画分中380、酸抽出されたクロマチン画分中426、428に比べて、すべての4分画によって共有されていました。ベン図は 、in vivoおよびそれらを単離するために、この分別の能力の異なる領域が存在することを強調して、分数の間で同定されたタンパク質の緩やかな重複を示す。さらに、唯一の未分画核を分析することによって、達成可能な総核プロテオーム（オレンジ）の著しく不完全な特性は、さらに分別を正当化している。
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Discussion
核の単離のための2つの主な方法は、以前に検討されている：27 1は、水性スクロース/塩溶液中で組織を均質化する非水系溶媒に凍結乾燥組織を均質化するベーレンス技術そして第二に、我々はここで使用しているかに変更、です続く差動または密度勾配遠心分離による。
組織サンプルの酸抽出による核の亜分画は、ヒストンを分析するためにある本来の目的で1960年、28日から使用されてきたクロマチンを研究するための重要なツールです。酸抽出プロトコルがコアヌクレオソームのヒストン成分を精製する、この目標のために開発されました29、これらの先行研究の限界は、クロマチンを構成および変更非ヒストンタンパク質に関する情報の欠如であり、我々は現在のプロトコルを使用して、この課題に対処してきた核とクロマチンの異なる生物学的亜分画を特徴付ける。並行して、界面活性剤抽出やクロマチンの酸抽出を使用するこのアプローチは、クロマチン調節分子の多様性を明らかにし、それによって仮説生成のための堅牢なアプローチとして、内因性制御のレベルを区別します。
大人の筋細胞に確立酸抽出の方法論を適用すると、密な細胞骨格とミトコンドリアの大人口を含む一定の障害を引き起こします。酸抽出のバージョンは全体の心臓組織30日に使用されてきた実験が知られているタンパク質を研究する対象と方法で実施された、現在のプロトコルが設計されており、公平なプロテオーム解析を可能にするために実行されました。さらに、当社は、界面活性剤を抽出し、酸抽出したクロマチンは、別々に（わずか37％のオーバラップは、これら2つの画分のプロテオームの間で観察された）より良いダイナミクスを理解するために検討することが有益であることが分かっている介してクロマチンタンパクintのこれらの集団DNAとeract。尿素ベースのバッファを使用して、他のプロトコルにも、酸抽出に先立って行われ、31,32に記載されているが、あまりきつくゲノムに結合した蛋白質を豊かにする。クロマチン分画に加えて、他の人は核小体を単離するためsubfractionated核、33を持っていますが、全体の心から分離した心筋の核の質量分析のための亜分画は報告されていない。
上のショットガンプロテオミクス研究無傷核つまり、未分画オルガネラ-ましたMudPITアプローチを用いて心筋組織に行われて図15本研究では、1044核心臓のタンパク質を同定した同じスケールで、我々のプロトコルとしては、しかし、彼らはの平均を使用してに依存していた8.5は、低濃度タンパク質を検出するために、20時間持続する実行のたびに、複製されます。対照的に、我々はimportaながら両方の増加により、識別可能なタンパク質の数を（長いクロマトグラフィー - 私たちのLCのランが85分であるが必要ない場合）亜分画を採用ntlyもサブ核局在化とタンパク質の相対量で付加的な生物学的情報を提供しています。
全体のマウスの心臓（約0.14グラム）我々は無傷核内のタンパク質の約1.2ミリグラム（全体の0.85％）を回復。から無傷核から、我々はサブフラクションごとに次の回復を達成（注：酸抽出および洗剤抽出は別の心ではなく、シリーズの上で行われるように、合計値が100％を超えて）：核質（15％）、界面活性剤クロマチン（85％）、及び酸抽出されたクロマチン（54％）を抽出した。ちなみに、サーモサイエンティフィック社は、自社のデータシートには10％の交差汚染の間に収量1.6mg細胞質タンパク質とマウスの心臓の40mgから0.6mgの核タンパク質（1.5％）と言うキット（NE-PERの核と細胞質の試薬）を持つ2分数。シグマは、彼らはウサギの筋肉でテストされているキット（NXTRACT、CellLytic核抽出キット）はなく、心を持って、100 mgの組織から回収された0.4彼らは細胞質汚染の "数パーセント"と彼らの "粗核ペレットを" TERM何で核タンパク質6mgの（0.46％）。そのようなEpigentekなどの他の企業は、また、キットを提供しています、しかし、我々は比較のために自分のウェブサイト上の濃縮および純度の具体的な詳細を見つけることができませんでした。
私たちは、プロテオミクス研究のための心臓核の成功を濃縮するための現在の必要性に対処するための新たな手法を説明してきました。我々はさらに少なく豊富な蛋白質と同様に高い分解能、定量およびタンパク質局在の決定を可能にするを検出する能力を向上させ、両方のサブコンパートメント分別するための方法論を説明します。この目的を達成するために、質量分析のためのプロトコルは、しかし、ケース·バイ·ケースの考慮が必要な可能性が最も高いでしょう、推奨されるガイドラインを提供しています。たとえば、我々はスペクトルの配列類似性の必要な手動検査による心臓ヒストンバリアントのアイソフォームが多数ミリアンペアを割り当てることがことがわかったJORのピークと自信を持ってスペクトルを割り当てることができるようになる前に、親イオンの質量を確認し、図14検索パラメータは、翻訳後修飾（PTM）を識別するためにカスタマイズされ、優秀なレビューがPTM濃縮含むPTM分析（のデータ解釈に詳述の方法や懸念を存在させることができ、翻訳後修飾、翻訳後修飾の組合せ、36代替フラグメンテーションストラテジ37と代替消化し 、処理38,39の35解析用ソフトウェア34）。
説明濃縮と分別が心臓全体（質量50〜70％の心筋細胞である）からである。核タンパク質の特定の家族のために特に重要であるかもしれない細胞特異性のこの犠牲の側面が、それは大人の筋細胞単離プロトコルでは不可能です適当なバッファーにタンパク質のはるかに迅速サスペンション、することができます。このように、この方法論は、より良い整合性を保持するOfの劣化に対してサンプル。しかしながら、また、説明した両方の孤立セル、生物全体のモデルは心不全を研究するために必要なツールであるため、隔離された新生仔ラット心室筋細胞にこのプロトコルを適用するための手順です。原理的にはこの方法はまた、単離された心 - と警告アイソレーション（時間以上続くことができている）中に発生したタンパク質結合の変化がプロテオミクスの観測の解釈を混同することから酵素消化によって抽出された大人の筋細胞に適用することができる。
我々は、病気に貢献核プロテオームとクロマチンのメイクの変化を理解するには、この方法論を開発した。14しかし、他のアプリケーションでは、正常な生理におけるプロテオーム組成の刺激固有の変更を勉強含まれています。さらに、サブ画は、タンパク質が核の異なる機能領域にまたがって動作し、ローカライズする方法の特性の新しいレベルの機能を提供しています。
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Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
VondriskaラボはNIHやUCLAのLaubisch基金の国立心肺血液研究所からの助成金によってサポートされています。 EMは、UCLAの生理学のジェニファーS. Buchwaldの大学院奨学金の受取人である; HCは、アメリカ心臓協会の事前博士フェローシップの受賞者です、MPは、NIHルースキルシュシュタインポスドクフェローシップの受信者であり、SFはの受信者であるNIHのK99賞。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbeco Modified Eagle Medium | Invitrogen | 11965 | |
| Protease pellet | Roche | 04 693 159 001 | |
| 100 μm strainer | BD Falcon | 352360 | |
| Ultracut ultramicrotome | Reichert | ||
| 100CX Transmission Electron Microscope |
JEOL USA, Inc. | ||
| Oriole | BioRad | 161-0496 | |
| Histone H2A antibody | Santa Cruz | sc-8648 | |
| Nucleoporin p62 antibody | BD Biosciences | 610498 | |
| Adenine nucleotide transporter antibody | Santa Cruz | sc-9299 | |
| BiP antibody | Santa Cruz | sc-1050 | |
| Tubulin antibody | Sigma | T1568 | |
| Histone H3 antibody | Abcam | ab1791 | |
| Fibrillarin antibody | Cell Signaling | C12C3 | |
| SNRP70 antibody | Abcam | ab51266 | |
| E2F-1 antibody | Thermo Fisher | MS-879 | |
| Retinoblastoma antibody | BD Biosciences | 554136 | |
| Hypoxia inducible factor-1 antibody | Novus Biologicals | NB100-469 | |
| BCA protein assay | Thermo Scientific | 23227 | |
| Reverse phase column | New Objective | PFC7515-B14-10 | |
| BioWorks Browser | Thermo Scientific |
References
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