Summary
Los avances en la espectrometría de masas han permitido el análisis de alto rendimiento de la expresión de proteínas y la modificación en un huésped de tejidos. En combinación con el fraccionamiento subcelular y modelos de enfermedad, espectrometría de masa cuantitativa y bioinformática puede revelar nuevas propiedades en los sistemas biológicos. El método descrito en la presente memoria analiza asociadas a la cromatina proteínas en el contexto de las enfermedades del corazón y es fácilmente aplicable a otras
Abstract
En el núcleo residen los proteomas cuyas funciones están íntimamente vinculadas con la regulación de genes. Núcleos de cardiomiocitos adultos de mamíferos son únicos debido al alto porcentaje de células binucleadas, un estado predominantemente heterochromatic del ADN, y la naturaleza no división de los cardiomiocitos que hace que los núcleos adulto en un estado permanente de interfase. 2 Regulación transcripcional durante el desarrollo y enfermedad han sido bien estudiados en este órgano, 3-5, pero lo que permanece relativamente inexplorado es el papel que desempeñan las proteínas nucleares responsables de empaquetamiento del ADN y la expresión, y cómo estas proteínas controlan los cambios en los programas transcripcionales que ocurren durante la enfermedad. 6 En los países desarrollados mundo, la enfermedad cardíaca es la principal causa de mortalidad tanto en hombres como en mujeres. 7 Insight sobre cómo las proteínas nucleares cooperar para regular la progresión de esta enfermedad es fundamental para avanzar en el tratamiento actual opciones.
La espectrometría de masas es la herramienta ideal para abordar estas cuestiones, ya que permite una anotación imparcial de la cuantificación nuclear proteoma y relativo de cómo la abundancia de estas proteínas cambia con la enfermedad. Si bien se han realizado varios estudios proteómicos para mamíferos complejos de proteínas nucleares, 8-13 hasta hace 14 sólo ha habido un estudio que examina el proteoma nuclear cardíaca, y se considera el núcleo entero, en lugar de explorar el proteoma a nivel de sub-compartimentos nucleares . 15 En gran parte, esta escasez de trabajo se debe a la dificultad de aislar núcleos cardíaco. Núcleos cardiacos ocurren dentro de un rígido y denso de actina-miosina aparato al que están conectados a través de múltiples extensiones desde el retículo endoplásmico, en la medida en que altera la contracción de miocitos su forma general. 16 Además, los cardiomiocitos son 40% mitocondrias en volumen 17 que necessitàtes enriquecimiento del núcleo aparte de los otros orgánulos. Aquí se describe un protocolo para el enriquecimiento nuclear cardíaca y fraccionamiento adicional en compartimentos biológicamente relevantes. Además, los métodos de detalle de la etiqueta libre de disección de espectrometría de masa cuantitativa de estas fracciones-técnicas susceptibles de experimentación in vivo en varios modelos animales y sistemas de órganos en el etiquetado metabólico no es factible.
Protocol
El flujo de trabajo experimental contiene siete pasos principales (Figura 1). Para cualquier trabajo relacionado con las muestras que se ejecutan en el espectrómetro de masas, el experimentador debe usar una bata de laboratorio, guantes y redecilla para el pelo y tener cuidado para evitar la contaminación por polvo y derramamiento personal de la queratina.
1. Corazón homogeneización y Aislamiento Nuclear
Corazones de ratón se homogeneizó y un intacta núcleos de pellets es aislado (Figura 2).
- Sacrificar el ratón adulto, escindir el corazón, enjuagar en PBS enfriado en hielo, y se homogeneiza sobre hielo en Dounce de vidrio (se prefiere que el triturador de tejidos Wheaton de Fisher, # 08-414-13A, pero otros métodos pueden funcionar igual de bien) que contiene 2 ml de tampón de lisis (una solución hipotónica que diferencialmente lisa la membrana celular a través de los orgánulos, incluyendo el núcleo) (10 mM Tris pH 7,5, 15 mM NaCl, y 0,15% v / v de Nonidet P-40 [NP 40-] en agua desionizada más proteasa y fosfatasa imezcla nhibitor: 10 mM de butirato de sodio, 0,1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo [PMSF], 0,2 mM Na 3 VO 4, 0,1 mM de NaF y 1 Roche proteasa pellet/10 ml - tampón de lisis que se puede almacenar hasta por una semana a -20 ° C ). (Nota: Nosotros no consideramos que sea necesario para perfundir los corazones con PBS, ya que nuestros datos de espectrometría de masas y análisis IR identificar las proteínas como predominantemente cardiomiocitos [p-valor de 3.8E-22] en origen frente a la contaminación de la sangre [p valor 5,0 E-2].)
- Verter lisado a través de filtro de micras 100 y recoger el flujo a través de tubo de centrífuga de 1,5 ml. En este punto, salvo que se especifique, la muestra debe mantenerse en hielo.
- Centrifugar a 4.000 rpm durante 5 min a 4 ° C.
- Eliminar el sobrenadante. (Este es el citosol, y deben ser almacenados a -80 ° C; contiene el lisado mitocondrias.) Resuspender el sedimento en 200 l de tampón de lisis por trituración. (Este es el sedimento nuclear bruto.)
- Llenar 1,5 ml tubo de centrífuga con 1 ml de sacarosa buffer (24% en peso de sacarosa / volumen, 10 mM Tris pH 7,5, y 15 mM de NaCl en agua desionizada con proteasa / mezcla de inhibidor de fosfatasa - tampón de sacarosa debe ser fresca en el día de uso). Suavemente capa del precipitado resuspendido en la parte superior de la almohadilla de sacarosa y se centrifuga a 5.000 rpm durante 10 min a 4 ° C.
- Eliminar la película delgada en la parte superior, así como la almohadilla de sacarosa (que contienen la membrana). Enjuague el sedimento remanente con 200 l de hielo frío PBS / EDTA (1x PBS con 1 mM EDTA). (Esta es la núcleos de pellets y pueden solubilizarse o fijada para el uso en microscopía electrónica de Western Blot o [Véanse los pasos 4,1 y 4,2] para cuantificar enriquecimiento.)
2. Nucleoplasma y detergente a extraer Fraccionamiento cromatina
El crudo núcleos de pellets se separa en una nucleoplasma y detergente a extraer la fracción de cromatina, que contiene proteínas estrechamente asociados con el ADN.
- Triturar pellet de paso 1.6 en 200 l tampón de extracción de detergente (20 mM HEPES pH 7,6, 7,5 mM de MgCl 2. 0,2 mM EDTA, 30 mM NaCl, 1 M de urea, 1% de NP-40 en agua desionizada con proteasa / mezcla de inhibidor de fosfatasa - tampón detergente extracción se puede almacenar hasta por una semana a -20 ° C).
- Vórtice de la muestra 2 veces, 10 segundos cada uno. Se coloca sobre hielo 10 min.
- Centrifugar a 13.000 rpm durante 5 min a 4 ° C.
- Eliminar el sobrenadante. (Este es el nucleoplasma y debe almacenarse a -80 ° C). Enjuague pellet con PBS enfriado en hielo / EDTA. (Este es el sedimento de cromatina.)
- Se tritura el pellet en 300 l de Tris, SDS, tampón de EDTA (50 mM Tris pH 7,4, 10 mM EDTA, 1% SDS en agua desionizada con proteasa / mezcla de inhibidor de fosfatasa - Tris, SDS, tampón de EDTA se puede mantener durante un máximo de una semana a -20 ° C).
- Sonicar 3-6 veces durante 10 segundos cada uno para romper el ADN. Mantenga la muestra en hielo entre sonicaciones.
- Centrifugar a 13.000 rpm durante 5 min a 4 ° C. Mantener el sobrenadante. (Sobrenadante es el detergente extraído cromatina proteína fraccionamienton y debe mantenerse a -80 ° C). El sedimento remanente debe ser pequeña y puede ser desechado.
- Si se utiliza miocitos aislados en lugar de todo el corazón: Aislar neonatales miocitos ventriculares de rata a partir de crías de rata de un día después del nacimiento mediante digestión enzimática, seguido por cultivo en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con fetal 10% de suero bovino (FBS), 1% de insulina -transferrina-selenito sódico (ITS), y 1% de penicilina. Después de 24 h, la transferencia a medios libres de suero (igual que el anterior, pero que carecen de FBS). Cosecha de células en tampón de lisis (que se enumeran en el punto 1.1), y comenzar fraccionamiento nuclear en el paso 1.3.
3. Ácido-extracción Fraccionamiento - ADN enlazado enriquecimiento proteico
A enriquece de fraccionamiento para separar las proteínas fuertemente unidas al ADN, incluyendo histonas.
- Repita los pasos 1.1-2.4.
- Se tritura el sedimento de cromatina en 400 l de ácido sulfúrico 0,4 N. Vortex para eliminar grumos.
- Incubar a 4 º C durante 30 min o Overnight mientras gira.
- Se centrifuga a 16.000 xg durante 10 min a 4 ° C para eliminar los desechos nucleares.
- Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo.
- Añadir 132 l de ácido tricloroacético gota a gota al sobrenadante. Voltear varias veces. Incubar en hielo durante 30 min.
- Centrifugar a 16.000 xg durante 10 min a 4 ° C.
- Desechar el sobrenadante. Enjuague suavemente pellet con helado de acetona. (Esta es la histona pellet.)
- Centrifugar a 16.000 xg durante 10 min a 4 ° C.
- Repita el lavado, los pasos 3.8-3.9.
- Aire seco en pelets.
- Resuspender el precipitado en 100 l de Tris, SDS, EDTA tampón. Ajuste de pH a 8 mediante la adición de 1 M Tris. (Utilizar un stock de Tris 1 M que no es de pH ajustado.)
- Someter a ultrasonidos en baño de agua durante 15 min. Evitar el sobrecalentamiento mediante la adición de hielo al baño María. (Esta es la fracción extraída con ácido y debe almacenarse a -80 º C)
4. Pureza Check
Western blot y microscopía electrónicaconfirmar enriquecimiento exitoso de los núcleos y el agotamiento de otros orgánulos. Para ver los resultados típicos para todos los ensayos de control de calidad siguientes, por favor lea nuestra publicación anterior 18.
- Realizar un análisis de transferencia Western. Sonda de membrana que contiene cada fracción para la histona H2A o nucleoporin p62 (como marcadores nucleares para verificar el enriquecimiento), y para el transportador de nucleótido adenina, BIP y la tubulina (como un marcador mitocondrial, marcador del retículo endoplásmico y marcador citoesquelético respectivamente para verificar la pureza). Para verificar subfraccionamiento éxito de los núcleos, sonda para la histona H3 o fibrilarina (detergente y extraída con ácido núcleos de cromatina y intacto) y SNRP70 o E2F (nucleoplasma). Sonda para el retinoblastoma o inducible de hipoxia factor-1 (enriquecido en detergente a extraer la cromatina durante extraída con ácido fracción). Las muestras adicionales de control de lisado de células HeLa y lisado de todo corazón también se puede ejecutar en el mismo gel: Preparar lisado de células HeLa de control mediante la adición de Tris, SDS, EDTA tampón para placa de cultivo y el uso de un rascador de células para recoger la muestra. Someter a ultrasonidos y centrifugar la muestra como en los pasos 2.6-2.7. Preparar el control conjunto lisado corazón homogeneizando el corazón en 2 ml de tampón (20 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM de pirofosfato de sodio, 1 mM de glicerofosfato en agua desionizada con la proteasa y la mezcla de inhibidor de la fosfatasa). Someter a ultrasonidos y centrifugar como en los pasos 2.6-2.7. Vea el paso 5 para la preparación de muestras de proteína por SDS-PAGE.
- Microscopía electrónica: Resuspender el pellet a partir de núcleos de 1,6 a paso en tampón de lisis que contiene 2% de glutaraldehído y fijar la muestra a 4 ° C. Enjuague las muestras en ácido ósmico, deshidratar e incrustar en resina epoxi. Cortar rebanadas de 70 nm utilizando un Reichert Ultracut ultramicrótomo. Mancha de muestras en acetato de uranilo y luego el plomo y la imagen con un microscopio JEOL 100CX electrónico de transmisión. Cuantificar el enriquecimiento mediante la medición del área de los núcleos intactos contra área total de material filmado. Encontramos 60-80% de los núcleos aestar intacto. 14
Consideraciones importantes para enriquecer frente a purificar núcleos. Este protocolo fue desarrollado para permitir a los análisis proteómicos de la cromatina cardíaco con el fin de estudiar los procesos globales de regulación génica durante la enfermedad. Un componente importante del diseño de todo el proteoma experimentos de espectrometría de masas es el problema de rango dinámico y ser capaz de identificar y caracterizar las proteínas de baja abundancia. Además del objetivo principal de proporcionar información sobre la biología y de la cromatina nuclear específico, enriqueciendo para el proteoma nuclear, aumenta la probabilidad de detectar estas proteínas de baja abundancia, como lo hace el subfraccionamiento adicional de los núcleos. Sin embargo, como se discutió, el cardiomiocito adulto tiene una alta densidad de componentes del citoesqueleto conectado a la membrana nuclear. No creemos que hemos purificado por completo los núcleos de estos componentes celulares. Sin embargo, mediante el enriquecimiento sólo para los núcleos, hemos obtenidoed de un umbral aceptable para permitir a los tipos de análisis descrito.
Específicamente, hemos EM utilizado para evaluar la pureza de nuestra núcleos pellet crudo y encontraron 60-80% de la fracción a ser núcleos intactos, aproximadamente el 10% mitocondrias, y el resto escombros. Además, sabemos por nuestro anterior estudio sobre la población de núcleos intactos, mientras que los miofilamentos muchos no se enriquecen con este protocolo (incluyendo la tubulina y actina, medido a través de Western) ciertas proteínas (calsarcin-1) se enriquecen, lo que sugiere una verdadera población biológica de estas proteínas en los núcleos cardíaco. 19
Además, se compararon las proteínas que se encuentran a estar presente en la fracción de cromatina extraído con ácido, a las funciones de estas proteínas predichas por la ontología de genes. Es importante destacar que este análisis de genes ontología no tiene en cuenta la abundancia relativa de las diferentes proteínas (como lo hace nuestros datos de Western blot), sino que cuenta todas las proteínas identificadas (enriquecered o no) como igual al identificar vías comunes y compartimentos celulares. El análisis de estas vías y compartimentos celulares se pueden encontrar en nuestras publicaciones anteriores. 18,20 es más importante, el éxito del enriquecimiento en la fracción de cromatina extraída con ácido nos permitió identificar la presencia de 54 variantes de las histonas en el miocito ratón adulto, 18 muchos de los cuales se basó en un péptido único de identificación, por lo que probablemente no hubiera sido detectable sin este protocolo de enriquecimiento dada la enorme complejidad del proteoma cardiomiocitos total. De las 1.048 proteínas que hemos identificado a partir de los núcleos cardiaca, 56 de ellos (5,3%) fueron anotados por análisis IR para ser parte de la nucleosoma (un componente del núcleo de interés). Otro estudio que analiza todo el corazón, identificado 6.180 proteínas, de las cuales sólo 11 proteínas (0,18%) fueron anotados para ser parte de la nucleosoma 21. Esto ilustra la fuerza de nuestro protocolo de meaningfuLLY enriquecer para las proteínas nucleares.
5. Protein Gel y enzimática de proteínas Resumen
Las proteínas se separan mediante uno dimensional SDS-PAGE y se digirieron con tripsina para ser ejecutado en el espectrómetro de masas.
- Descongelar las muestras en hielo y determinar la concentración de proteína para cada muestra usando el ácido bicinconínico (BCA) ensayo de proteínas.
- Diluir las muestras con una concentración conocida utilizando 5x tampón de Laemmli, hervir durante 10 min y se almacena a -20 ° C para una dimensión SDS-PAGE. Diluir las muestras a una concentración conocida utilizando tampón de extracción de urea y almacenar a -20 ° C para geles de dos dimensiones.
- Ejecutar gel de elección cargar la misma cantidad de proteína en cada carril. Las proteínas pueden ser transferidos a una membrana de nitrocelulosa que se utilizará para la transferencia Western (como con los controles en el paso 4,1) o las bandas pueden ser cortadas para el análisis de espectrometría de masas; consulte los pasos siguientes.
- Retirar el gel de aparatos que utilizan agua desionizada para transferirlo a un recipiente limpio.Cubra gel en Oriole mancha, y el envase envuelva en papel de aluminio para bloquear la luz. Permitir gel de incubar a temperatura ambiente en un agitador durante al menos 90 min.
- Imagen Oriole manchado de gel (Figura 3) con luz UV, y la marca donde las bandas se reducirá en la imagen. Cortamos cada carril en aproximadamente 25 2-mm bandas para los estudios de medición del proteoma total.
- Coloque gel sobre una superficie limpia. Utilice sólo los materiales que se han mantenido cerrado o se rocían con etanol para evitar la contaminación de la queratina. Corte cada banda, y luego se lo rebana en 3 pedazos iguales. Coloque las tres piezas de cada banda junto a su propio tubo etiquetado de 1,5 ml. Los trozos de gel se pueden almacenar a -20 ° C durante varios meses.
- Preparar los tapones de gel para la digestión enzimática. Digest piezas de gel utilizando tripsina a 37 ° C durante la noche. Para el protocolo detallado muestra de gel ver nuestra publicación anterior. 22 Puede digerir bajo peso molecular bandas con quimotripsina en lugar de tripsina,para eliminar la escisión extensa de tripsina de colas de las histonas.
6. Espectrometría de Masas y Análisis de Datos
Las muestras se separaron en un LC y se analizaron mediante MS / MS. Los espectros se registraron en contra de una base de datos de proteínas para la identificación de proteínas.
- Ejecutar 10 l de cada muestra a través de LC / MS / MS. Usamos un nano-flujo Eskigent LC con una columna de fase inversa 75 micras. Utilice una ejecución de LC optimizado para un rango de proteínas y péptidos. Emplear un gradiente lineal de fase móvil A (acetonitrilo 0,1% de ácido fórmico, 2% [ACN] en agua) a la fase móvil B (0,1% de ácido fórmico, 20% de agua en ACN): 60 min de la fase B 5% a 50 móvil % B, 15 min luego de 50% B a 95% B y finalmente 10 minutos a 95% constante B. Utilizar una velocidad de flujo de 200 nl / min. Adquirir datos de espectrometría de masas de un modo dependiente de los datos. Usamos un Orbitrap Thermo que fragmenta las 6 iones primarios más abundantes.
- Repetición ejecuta durante al menos tres repeticiones biológica y dos técnicos. (Recommended)
- Utilice el software (las opciones disponibles en el mercado incluyen BioWorks y Xcalibur;! Públicamente opciones disponibles incluyen PROWL, X Tandem, SpectraST) para buscar los espectros de la base de datos Uniprot de elección a través de un algoritmo de búsqueda (como SEQUEST o mascota).
- Considerar la modificación de los parámetros de búsqueda para permitir carbamidomethylation cisteína y la oxidación de metionina, dos modificaciones comunes creados durante el procesamiento de la muestra.
- Calcular una tasa de falsos positivos mediante la búsqueda de base de datos inversa.
- Filtrar identificación de proteínas a aceptar sólo los partidos de la confianza umbral. Recomendamos los siguientes parámetros para empezar: Xcorr> 3 (2),> 4 (3),> 5 (4); tolerancia deltaCN> 0,1, la puntuación de consenso ≥ 20, la tolerancia masa 2 Da ion para padres, masa Da de 0,5 por iones producto, por lo menos 2 péptidos únicos por proteína y 3 no es más que perder divisiones.
7. Etiqueta libre de cuantificación
Determine la abundancia relativa de proteínas utilizando la etiqueta libre de cuantificación (Figura 4).
- Una serie de programas de software son públicamente o disponibles comercialmente para la etiqueta libre de cuantificación de datos de espectrometría de masas, incluyendo Censos (grupo del Prof. Yates), 23 Elucidator (Microsoft), 24 SIEVE (Thermo Scientific), 25 Andamio (Software Proteoma) 26. Estos programas tienen como objetivo correlacionar la señal de espectrometría de masas de péptidos intactos o el número de eventos de secuenciación de péptidos de proteínas con cantidades relativas entre dos o más estados.
- Si bien cada programa incorpora un análisis de tuberías similar, algunos programas se limitan a los tipos de análisis específicos que se pueden realizar sobre los datos. Inicialmente, los datos de diferentes ejecuciones está alineado, intensidad de la señal se normaliza y picos de péptidos se seleccionan para su análisis.
- Los dos métodos más comunes son la cuantificación basada en el recuento espectral o LC-MS área del pico. Abundanciacoeficientes se calculan para determinar los cambios en la abundancia peptídico entre los diferentes grupos.
- Estos programas pueden ser interconectados con algoritmos de búsqueda de proteómica (Mascot, Sequest, X! Tandem) para correlacionar la información cuantificación para la identificación de proteínas.
- Para asegurar la precisión y reproducibilidad de los datos es crucial para incorporar tanto biológicos (diferentes muestras experimentales) y técnicos (ejecutando la misma muestra en el espectrómetro de masas múltiples veces), repeticiones de los datos de espectrometría de masas.
- Variación de la abundancia de péptidos en y entre las condiciones experimentales se puede evaluar por ANOVA y se representa a través de PCA (Figura 5).
Consideraciones importantes para la etiqueta sin cuantificación. Cuando se realiza sin etiquetas cuantificación, se prestará especial se debe dar para asegurar la preparación de la muestra constante, el tiempo de digestión y condiciones LC-MS/MS como cada muestra deben ser procesados y analizados por separado. En contraste con metenfoques Abolic etiquetado, las comparaciones libres en la etiqueta experimentos se realizan sobre los datos de espectrometría de masas distintas carreras (ya que la falta de etiquetado evita la posibilidad de correr juntos), lo que requiere una alta reproducibilidad en todos los aspectos del análisis de la muestra (es decir, de preparación de muestras, LC y pasos MS) y el uso de espectrómetros de masas de alta precisión en masa.
Para tener en cuenta los cambios leves en la preparación de muestras y análisis de un estándar conocido puede ser añadido a cada muestra para ayudar en la normalización de los datos. Además, la mayoría de los programas de software permiten la normalización de las intensidades de la señal (por ejemplo, mediante el ajuste al ruido de fondo o un analito conocido abundante) después de la adquisición de datos para tener en cuenta diferencias en la inyección, la ionización y fragmentación. Algoritmos de alineación existe en la mayoría de los programas de software referencia anteriormente que ayudan en la corrección de las diferencias en los perfiles de elución de péptidos. El uso de repeticiones biológica y técnica es esencialcial en este tipo de estudio, ya que permite que los análisis estadísticos para confirmar la reproducibilidad y consistencia de los cambios observados en la abundancia de proteínas.
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Representative Results
La figura 4 pone de manifiesto la utilidad de esta forma de cuantificación relativa. Se muestra en el panel de la izquierda son los picos individuales monoisotópicas péptidos (superpuesta de diferentes ratones), que han sido designados como pertenecientes a la proteína HMGB1 (identificados mediante una búsqueda de base de datos). Cada pico, esencialmente un cromatógrafo iónico extrae para el péptido dado, proviene de un ratón diferente. Los grupos representan tres diferentes estados fisiológicos: hipertrofia basal, cardíaco e insuficiencia cardíaca, con tres repeticiones biológica para cada grupo. Al integrar el área bajo la curva, una abundancia relativa se puede calcular. En el panel medio de la media de estas abundancias se muestra. Es evidente a partir de este tipo de análisis que la abundancia de la proteína HMGB1 está cambiando durante el curso de la enfermedad. En contraste, los paneles inferiores muestran el ejemplo de la histona H4 que no cambia con la enfermedad. En ambos casos, los péptidos procedentes de animales de la misma phenotestado YPIC muestran perfiles similares y la abundancia relativa de elución, lo que demuestra la reproducibilidad de la preparación de la muestra y LC / MS / MS.
La reproducibilidad de esta técnica se confirma mediante análisis de componentes principales (PCA). Como se muestra en la Figura 5, la aplicación de ANOVA para los resultados totales del proteoma de cada animal analizado revela una agrupación distinta por fenotipo cardíaco (biológicas repeticiones) con la asociación más apretado entre repeticiones técnica (espectrometría de masa diferente se ejecuta de la misma muestra) del mismo animal . Esto proporciona la confianza de que los cambios de abundancia observados para las proteínas individuales de interés son, en efecto atribuible a la diferencia en el estado fisiológico.
De igual importancia como la cuantificación y la reproducibilidad de los resultados es el aumento de la cobertura del proteoma nuclear activado por subfraccionamiento nuclear. Figura 6 ilustra que el análisis de todo el núcleo solo tampoco detecta incluso una mayoría de las proteínas nucleares identificadas cuando la combinación de los análisis individuales de los compartimentos separados (1.048 proteínas únicas identificadas en total en las fracciones frente a 428 identificados a partir de los núcleos intactos). Además, la superposición moderadas entre las diferentes fracciones demuestra la importancia biológica de considerar estos compartimentos individualmente para la penetración añadido en función nuclear y la regulación de genes. Por último, la capacidad de fraccionar específicamente extraída con ácido o detergente a extraer enriquece la cromatina para las principales proteínas de la cromatina estructurales, tales como histonas, lo que permite más centrados análisis de espectrometría de masas (tales como aquellos que se dirigen a modificaciones post-traduccionales) en un grupo de proteínas sin requieren anticuerpos específicos para cada variante y la isoforma.
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Figura 1. Diagrama de flujo para la caracterización de las proteínas en compartimentos cardíacas sub nucleares. Corazones enteros de ratón se homogeneizan y el lisado enriquecido para núcleos. Los núcleos son fraccionados en nucleoplasma, detergente extraído cromatina, y extraída con ácido fracciones cromatina. Las proteínas de cada uno están aislados y separados por una dimensión SDS-PAGE, y las bandas digeridas con tripsina y dirigido por LC / MS / MS. Después de la búsqueda de base de datos, la etiqueta libre de cuantificación se utiliza para identificar tendencias de la abundancia de proteínas en las diferentes fracciones.
Figura 2. Esquemática fraccionamiento nuclear. Núcleos se enriquecen a partir de homogeneizado de todo el corazón a través de un gradiente de sacarosa. Cada muestra de núcleos o bien se puede separar en nucleoplasma y fracciones extraídas con detergente o en un acIdentificación extraído fracción que enriquece a las histonas.
Figura 3. Unidimensional en gel de las diferentes fracciones. 20 g de lisado de todo corazón (WHL), los núcleos intactos (Nuc), nucleoplasma (NUP), detergente extrajo de la cromatina (DE), y extraída con ácido fracción cromatina (AE) a partir de corazón de ratón se realizaron en un unidimensional en gel de SDS-PAGE (12% de acrilamida) junto con cromatina fracción extraída con ácido a partir de células HeLa y se tiñeron con Oriole. El patrón diferente de la abundancia de la proteína total en los pesos moleculares diferentes demostrar la existencia de proteomas únicos para los diferentes compartimentos sub, incluyendo el enriquecimiento de las histonas de bajo peso molecular en la cromatina detergente a extracción que son más enriquecido en las fracciones extraídas con ácido . También hay que resaltar el carácter bastante menos complejo de la fracción AE a partir de células HeLas en comparación con la del corazón.
Figura 4. Cuantificación relativa abundancia ratones de tres diferentes estados cardíaca:. Basal (azul) Hipertrofia (rojo) y fallo (verde) se recogieron por triplicado y sus muestras de proteínas corrió en dos técnicos repeticiones por LC / MS / MS. Se muestra en el lado izquierdo son los picos monoisotópicos para un péptido específico (cuyo espectro se muestra a la derecha). La abundancia relativa se calculó por integración y promediado entre los replicados de cada estado fenotípico (panel central) para comparar la abundancia relativa del péptido (y la proteína de la que procede) en los diferentes estados de insuficiencia cardíaca. El panel superior muestra un péptido de HMGB1, cuya abundancia se altera en la enfermedad, mientras que el panel inferior (histona H4) no cambia. Haga clic aquí para ampliar la cifra .
Figura 5. Análisis de componentes principales revela reproducibilidad. Análisis ANOVA para cada ratón (3 repeticiones biológica / estado cardíaco x 2 repeticiones técnica) representada por la intensidad de péptido (ejes) muestra la agrupación por estado de la enfermedad (en azul basal, hipertrofia en rojo, el fracaso en verde), que indica la reproducibilidad satisfactoria de los datos de espectrometría de masas y significativas diferencias fisiológicas entre los diferentes estados de la enfermedad.
Figura 6. Caracterización global de los distintos compartimentos sub nucleares. Se identificaron 1.048 proteínas únicas totales en todos los fr 4acciones. 146 proteínas fueron compartidos por todas las fracciones 4, en comparación con 749 proteínas identificadas en el nucleoplasma, 380 en la fracción de cromatina detergente extraída con 426, en la fracción de cromatina extraído con ácido, y 428 en los núcleos intactos. El diagrama de Venn representa la superposición moderados en proteínas identificadas entre las fracciones, destacando la existencia de regiones distintas en vivo y la capacidad de este fraccionamiento para aislarlos. Además, la caracterización notablemente incompleto del proteoma nuclear total alcanzable sólo por el análisis de núcleos no fraccionada (naranja) justifica fraccionamiento adicional.
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Discussion
Existen dos métodos principales para el aislamiento nuclear han sido revisados previamente: 27 una es la técnica Behrens de homogeneizar tejido liofilizado en un disolvente no acuoso y la segunda, una modificación de la que se utiliza aquí, de homogenizar el tejido en un acuosa de sacarosa / solución salina seguido por diferencial o centrifugación en gradiente de densidad.
Subfraccionamiento de los núcleos mediante extracción con ácido en muestras de tejido es una herramienta importante para el estudio de la cromatina que se ha utilizado desde 1960, 28 con el objetivo original de ser para analizar las histonas. Extracción de ácido protocolos fueron desarrollados para este objetivo de purificar los componentes principales de las histonas nucleosomal 29 Una limitación de estos estudios anteriores es la falta de información sobre las proteínas no histonas constituyentes, y la modificación, la cromatina,. Hemos abordado este reto con el protocolo actual para la caracterización de diferentes subfracciones biológicas del núcleo y de la cromatina.Este enfoque, que utiliza la extracción con detergente o extracción ácida de la cromatina en paralelo, revela la diversidad de la cromatina moléculas reguladoras y distingue entre niveles de regulación endógena, sirviendo por lo tanto como un sólido método para la generación de hipótesis.
La aplicación de lo establecido en ácido extracción metodología para el miocito adulto plantea algunos obstáculos, incluyendo el citoesqueleto y densa población mitocondrial grande. Mientras que las versiones de extracción de ácido se han utilizado en el tejido del corazón entero 30 se realizaron los experimentos de forma dirigida para estudiar las proteínas conocidas, el protocolo actual está diseñado y se ha ejecutado para permitir el análisis del proteoma imparcial. Además, hemos encontrado que es beneficioso para examinar el detergente a extraer y extraída con ácido cromatina por separado (sólo 37% de solapamiento se observó entre los proteomas de estas dos fracciones) para entender mejor la dinámica a través de las cuales las poblaciones de la cromatina proteínas interact con el ADN. Otros protocolos utilizando tampones a base de urea también se han descrito, 31,32, que, realizado antes de la extracción con ácido, enriquecer las proteínas menos fuertemente ligados al genoma. Además de las fracciones de cromatina, otros tienen subfractionated el núcleo para aislar el nucleolo, pero subfraccionamiento 33 para el análisis de espectrometría de masas de los núcleos de miocardio aislado de corazones enteros no ha sido reportado.
Escopeta proteómicos estudios sobre núcleos intactos, es decir, no fraccionada orgánulos-han llevado a cabo sobre el tejido de miocardio mediante un enfoque MudPIT. 15 Este estudio identificó 1.044 proteínas cardíacas nucleares, en la misma escala que nuestro protocolo, sin embargo, se basó en el uso de un promedio de 8,5 repeticiones, con cada serie que dura 20 horas para detectar proteínas de baja abundancia. En contraste, hemos empleado subfraccionamiento, tanto para aumentar el número de proteínas identificables (sin necesidad de largos cromatografía LC-nuestras carreras son 85 min), mientras que importantly también ofrece información adicional biológico en la sub-localización nuclear y la abundancia relativa de las proteínas.
Desde un corazón de ratón completo (aproximadamente 0,14 g) se recupera aproximadamente 1,2 mg (0,85% del total) de proteína en los núcleos intactos. De los núcleos intactos que lograr la recuperación siguiente para cada una de las subfracciones (Nota: los valores totales exceden 100% como ácido-extracción y detergente extracción se hacen con corazones separados, no en serie): nucleoplasma (15%), detergente se extrajo la cromatina (85%), y extraída con ácido cromatina (54%). En comparación, Thermo Scientific tiene un kit (NE-PER Reactivos nuclear y citoplasmática) que su hoja de datos dice rendimientos de 1,6 mg de proteína citosólica y 0,6 mg de proteína nuclear (1,5%) a partir de 40 mg de corazón de ratón con un 10% entre la contaminación cruzada las dos fracciones. Sigma tiene un kit (Kit NXTRACT, CellLytic extracción nuclear) que se han probado en músculo de conejo, pero no del corazón, y se recuperó a partir de tejido mg 100 0,46 mg de proteína nuclear (0,46%) en lo que ellos llaman su "crudo pellet nuclear" con un "pequeño porcentaje" de contaminación citoplasmática. Otras compañías, como Epigentek también ofrecen kits, sin embargo no hemos podido encontrar detalles específicos sobre el enriquecimiento y la pureza en sus sitios web de comparación.
Hemos descrito una nueva técnica para responde a la necesidad actual de enriquecimiento exitoso de núcleos cardíaca para estudios proteómicos. Nos describen adicionalmente metodología para el fraccionamiento sub compartimento, lo que aumenta tanto la capacidad de detectar las proteínas menos abundantes, así como permite la resolución más alta, la cuantificación y determinación de la localización de la proteína. Con este fin, el protocolo para el análisis de espectrometría de masas ofrece pautas recomendadas, sin embargo, caso por caso las consideraciones más probable es que sea necesario. Por ejemplo, se encontró que el gran número de isoformas cardíacas variante de la histona inspección con similitud de secuencia manual requerida de los espectros para asignar mapicos Jor y confirmar masa de iones padre antes de poder asignar con seguridad los espectros. 14 parámetros de búsqueda también se puede personalizar para post-translacional modificación (PTM) la identificación y excelentes críticas existen métodos que detallan y preocupaciones con la interpretación de datos para el análisis de PTM (incluyendo el enriquecimiento de PTM , 34 de software para PTMs, 35 análisis de PTMs combinatorias, 36 estrategias alternativas de fragmentación 37 y la digestión alternativo y procesamiento 38,39).
El enriquecimiento y el fraccionamiento descrito es de todo el corazón (que es un 50-70% de cardiomiocitos en masa). Si bien estos aspectos sacrificios de especificidad de la célula que puede ser especialmente importante para ciertas familias de proteínas nucleares, que permite una suspensión mucho más rápida de las proteínas en los búferes adecuados, que no es posible con protocolos de miocitos adultos celda de aislamiento. De esta manera, esta metodología conserva mejor la integridad of la muestra contra la degradación. Sin embargo, también se describen las instrucciones para la aplicación de este protocolo para los miocitos aislados de ratas neonatales ventriculares, ya que ambos modelos organismo aislado de las células y el todo son herramientas necesarias para el estudio de la insuficiencia cardíaca. En principio, este método también se podría aplicar a miocitos adultos obtenidos por digestión enzimática a partir de corazones aislados-con la salvedad de que los cambios en la unión a proteínas que se producen durante el aislamiento (que puede durar más de una hora) se confundir la interpretación de las observaciones proteómicos.
Hemos desarrollado esta metodología para entender los cambios en el proteoma nuclear y maquillaje cromatina que contribuyen a la enfermedad. 14 Sin embargo otras aplicaciones específicas incluyen el estudio de estímulo-cambios en la composición del proteoma en la fisiología normal. Además, sub-fraccionamiento ofrece la posibilidad de un nuevo nivel de caracterización de las proteínas de cómo operar y localizar a través de distintas regiones funcionales del núcleo.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
El laboratorio Vondriska es apoyado por subvenciones del Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre del NIH y la Fundación Laubisch de la UCLA. EM es beneficiaria de la Jennifer S. Buchwald de Becas de Postgrado en Fisiología de la UCLA; HC es el receptor de una Asociación Americana del Corazón Pre-doctoral Fellowship, MP es el destinatario de un NIH Ruth Kirschstein beca posdoctoral, y SF es el receptor de un NIH K99 Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbeco Modified Eagle Medium | Invitrogen | 11965 | |
| Protease pellet | Roche | 04 693 159 001 | |
| 100 μm strainer | BD Falcon | 352360 | |
| Ultracut ultramicrotome | Reichert | ||
| 100CX Transmission Electron Microscope |
JEOL USA, Inc. | ||
| Oriole | BioRad | 161-0496 | |
| Histone H2A antibody | Santa Cruz | sc-8648 | |
| Nucleoporin p62 antibody | BD Biosciences | 610498 | |
| Adenine nucleotide transporter antibody | Santa Cruz | sc-9299 | |
| BiP antibody | Santa Cruz | sc-1050 | |
| Tubulin antibody | Sigma | T1568 | |
| Histone H3 antibody | Abcam | ab1791 | |
| Fibrillarin antibody | Cell Signaling | C12C3 | |
| SNRP70 antibody | Abcam | ab51266 | |
| E2F-1 antibody | Thermo Fisher | MS-879 | |
| Retinoblastoma antibody | BD Biosciences | 554136 | |
| Hypoxia inducible factor-1 antibody | Novus Biologicals | NB100-469 | |
| BCA protein assay | Thermo Scientific | 23227 | |
| Reverse phase column | New Objective | PFC7515-B14-10 | |
| BioWorks Browser | Thermo Scientific |
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