Summary
De hier beschreven methode maakt gebruik van directe injectie van entomopathogene bacteriën in de hemocoel van
Abstract
Manduca sexta, algemeen bekend als de tabak hornworm, wordt beschouwd als een belangrijke en tuinbouw en daarbuiten, het voeden op Solanaceae planten, met inbegrip van tabak en tomaat. De gevoeligheid van M. sexta larven van verschillende bacteriesoorten entomopathogene 1-5, evenals de rijkdom aan informatie beschikbaar over het insect immuunsysteem van 6-8 en de hangende genoomsequentie 9 het een goede modelorganisme voor gebruik bij het bestuderen gastheer-microbe interacties tijdens pathogenese. Bovendien M. sexta larven zijn relatief groot en gemakkelijk te manipuleren en te behouden in het laboratorium opzichte van andere gevoelige insectensoorten. Hun grote formaat maakt het ook efficiënt weefsel / hemolymfe extractie voor de analyse van de gastheer respons op infectie.
Werkwijze hier gepresenteerde beschrijft de directe injectie van bacteriën in de hemocoel (bloedholte) van M. Sexta larven. Deze benaderingkunnen worden geanalyseerd en de virulentie kenmerken van verschillende bacteriesoorten, stammen, of mutanten vergelijken eenvoudig bewaken van de tijd insect dood na injectie. Deze methode is ontwikkeld om de pathogeniteit van Xenorhabdus en Photorhabdus species die typisch associëren met nematode vectoren als middel om toegang tot het insect krijgen bestuderen. Entomopathogene nematoden meestal besmetten larven via natuurlijke spijsvertering of respiratoire openingen, en laat hun symbiotische bacteriën inhoud in het insect hemolymfe (bloed) kort daarna 10. De injectiemethode hier beschreven omzeilt de noodzaak van een nematode vector, waardoor het loskoppelen van de effecten van bacteriën en nematode op het insect. Deze methode zorgt voor nauwkeurige kwantificering van besmet materiaal (cellen of eiwit) in de inoculum, wat niet mogelijk is met andere bestaande methodes voor het analyseren entomopathogenesis, zoals knikken 11 en 12 assays orale toxiciteit Het nut van de directe injectie methode zoals hier beschreven bacteriële pathogenese analyseren bewaken insect mortaliteit. Echter, deze werkwijze eenvoudig worden uitgebreid voor het bestuderen van de effecten van besmetting van het M. sexta immuunsysteem. Het insect reageert op infectie via zowel humorale als cellulaire responsen. De humorale respons omvat herkenning van bacterieel geassocieerde patronen en daaropvolgende productie van diverse antimicrobiële peptiden 7, de expressie van genen die coderen voor deze peptiden kunnen worden bewaakt na directe infectie via RNA extractie en kwantitatieve PCR 13. De cellulaire respons op infectie omvat nodulatie, inkapselen en fagocytose van ziekteverwekkers door hemocyten 6 13, 14.
Protocol
1. Insect Egg Sterilisatie en grootbrengen
- Bereid voeding door eerst autoclaaf 15 g van de ontvangen agar in 900-1,000 ml H 2 O. Onmiddellijk na behandeling in een autoclaaf, meng met 166 g tarwekiemen dieet en mix goed in een laboratorium blender. Giet het mengsel in een schaal (of gerechten) om af te koelen, vervolgens overbrengen dieet om aluminiumfolie, strak wikkelen, en bewaar bij 4 ° C.
- Bij aankomst, steriliseren M. sexta eieren met 250 ml 0,6% bleekmiddeloplossing gedurende 2-3 minuten in een glazen filterhouder en vacuumfles inrichting met een 90 mm filter papier roeren.
- Schakel vacuüm bleekoplossing en wassen eieren 3-4 keer afvoer met 250 ml steriel gedestilleerd H 2 O per wasbeurt.
- Overdracht eieren in de frisse 90 mm filtreerpapier geplaatst in een Petri plaat deksel en laat ze drogen tot ze niet meer bij elkaar blijven (ongeveer 20-30 min).
- Breng eieren op de bodem van plastic containers met insect dieet, het ongeveer 40 eieren per container(Figuur 1A). Eieren worden gescheiden van dieet vocht veroorzaakte schimmelbesmetting te voorkomen. Handhaven eieren bij 26 ° C met 16 uur licht: 8 uur donker fotoperiode. Eieren voorafgaand verlichten op een geel-witte kleur aan het uitkomen.
- Wanneer broedeieren voltooid, voorzichtig overbrengen ongeveer 25 larven elke nieuwe containers met voeding op de bodem (Figuur 1B). Het is belangrijk op te halen elke larve door de lange zwarte hoorn behulp van een tang om te vermijden dat ze tijdens hun kwetsbare vroege ontwikkelingsstadia. Incubeer gedurende 2 dagen zoals hierboven. Terwijl larvale dood is ongebruikelijk in dit stadium, kan een aantal dode of, meer waarschijnlijk, ontwikkelingsachterstand onvolgroeide larven worden waargenomen. Dergelijke insecten moeten worden uitgesloten van verdere studie en geofferd door bevriezing.
- Om kannibalistische gedrag, transfer larven aan individuele containers met kleine stukjes voedsel (figuur 1C) te vermijden en incubeer als hierboven. Monitor insect opgericht ter vervanging van voedsel en schoonmaken uitwerpselen out van containers om de andere dag totdat ze ondergaat het derde larvale vervelling (meestal 6-9 dagen na het uitkomen). Dit is het 4e instar larvale stadium, gekenmerkt door het verschijnen van zwarte haakvormige crochets op elke proleg en grotere bekendheid van strepen langs de insect lichaam (Figuur 1D). De larven kunnen aanzienlijk variëren in grootte, maar meestal 0.15-0,4 g zou wegen bij het betreden van de 4 e instar stadium. Larven van vergelijkbare grootte worden gekozen voor injectie.
2. Bereiding van bacteriën voor Injectie
- Groeien de bacteriestam (s) wordt getest volgens standaard procedures de groeifase u testen.
- Pellet 500 pi van elke bacteriële stam die getest door het draaien gedurende 2 minuten in een microcentrifuge bij 13.000 rpm bij kamertemperatuur.
- Resuspendeer cellen in 1 ml steriele 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en pellet opnieuw zoals hierboven.
- Resuspendeer cellen in 0,5 ml 1x PBS en meaof de optische dichtheid (OD) van de suspensie. Verdun alle suspensies dezelfde OD, indien nodig. Steriele groeimedia kunnen eveneens worden gebruikt voor mobiele resuspenderen en te verdunnen in plaats van 1x PBS, indien gewenst.
3. Injectie van 4 e instar larven
- Bereid serial 10-voudige verdunningen van de eerste bacteriestam in 6 wells van een 96-well microtiterplaat in steriele 1x PBS, met een verse pipetpunt voor elke verdunning (figuur 2A). Het eindvolume van celsuspensie in elk putje groter zijn dan de vereiste volume voor injectie (10 ul per insect) plus 20 pi aan de plaat inoculum (zie stap 3.2 en 3.7).
- Spot 10 pi telkens 5 verdunningen (10 -2 tot 10 -6) boven aan een Petri plaat met een geschikt groeimedium. Kantel de plaat, zodat de spots verspreid naar de (Figuur 2B).
- Verwijder insecten dieet en uitwerpselen en plaats insecten in containers op ijsongeveer 5 min.
- Steriliseer de naald door spoelen 3 maal elk in 2 tubes van 70-100% ethanol, gevolgd door een buis van steriele H 2 O (figuur 2C). De hoeveelheid vloeistof moet voldoende onderdompelen naald.
- Kwantificeren van de verdunde celsuspensies onder een microscoop met een hemocytometer. Afhankelijk van de gewenste inoculum opneming 10 ul van de juiste microtiterputje (Figuur 2D).
- Swab het insect oppervlak met 95% ethanol en injecteer de 10 ml celsuspensie in het insect een hoek (kleiner dan 45 °) achter een van de buikpoten. Zorg ervoor dat u doorboren de darm en injecteer de inhoud net onder de epidermale laag (figuur 2E). Terwijl sommige verlies van hemolymfe (helder, groen-blauwe vloeistof) is normaal, fijn stof en gele vloeistof die uit de injectieplaats zijn een indicatie van darm punctie. Als dit gebeurt, offeren het insect en het verkrijgen van een nieuwe larve opnieuwplaatsen.
- Herhaal stap 3.6 voor elke resterende insect in de eerste injectie groep. Naald sterilisatie niet noodzakelijk is tussen de insect geïnjecteerd met dezelfde verdunning en bacteriestam tenzij vuil. Als alternatief kan een herhalende dispenser worden gebruikt voor grotere consistentie in injectievolume tussen monsters.
- Na injecteren van elk insect met de eerste bacterie, herhaal stap 3.2, nu spotten celsuspensies in het midden van de plaat en te laten stromen naar beneden (figuur 2F). Incubeer de platen op de juiste temperatuur en tel kolonies aan het inoculum te sommen. Deze tweede stap plating wordt gebruikt om te verifiëren dat de monsters niet zijn die tijdens het injectieproces, aangezien dit zou leiden tot uiteenlopende kolonie getallen tussen de eerste en tweede platings.
- Herhaal stap 3.1 tot 3.8 voor elke bacterie in het experiment. Tot slot, injecteren drie-vijf insecten met steriele PBS 1x met een sterile naald als negatieve controlegroep. Incubeer insecten bij 26 ° C met 16 uur licht: 8 uur donker fotoperiode.
- Monitor insecten overleven in de tijd na de injectie. Insect dood wordt gekenmerkt als een gebrek aan vrijwillige beweging na stimulatie. Insecten vertonen vaak verlies van eetlust, diarree (waterig, geel uitwerpselen), en / of verlies van water ("zweten") tijdens besmetting die voorafging aan de dood; deze kenmerken kunnen zijn vermeldenswaard ook.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een representatief voorbeeld van een insect mortaliteit assay is weergegeven in figuur 3. In dit experiment werden insecten geïnjecteerd met ongeveer 50 kolonievormende eenheden (CFU) van hetzij wild type (ATCC19061) of een verzwakte mutante stam (LRP 13) van Xenorhabdus nematophila gekweekt tot mid-log fase (n = 6 insecten per stam). Insecten waargenomen ongeveer 72 uur en het percentage geïnjecteerde insecten nog in leven elk tijdpunt opgenomen. In dit geval is de verzwakte stam vertoonde een duidelijke vertraging in insect doden, de wild-type stam gedood 6 larven binnen 30 uur na injectie, voor de dood van elke mutant geïnfecteerde larve.
Figuur 1. Insect kweken in samenstelling voor injectie. A) Ongeveer 40 oppervlak gesteriliseerd eieren geplaatst op de bodem van een 5 oz kop metsteriele insecten dieet rustend op een rubberen stop. B) Twintig pas uitgekomen insecten naar 5 oz cups met steriele insect voeding op de bodem en gedurende 2 dagen. C) Insecten naast individueel overgebracht naar 1oz kopjes met steriele voeding op de bodem en geïncubeerd totdat ze volwassen worden. D) Vierde instar M. Sexta larven met prominente strepen langs het lichaam (boven) en zwart haakt op de buikpoten (onder).
Figuur 2. Injectie van 4 e instar M. Sexta larven. A) Bacteriën worden serieel verdund in een 96-well plaat. B) Tien microliter van meerdere verdunningen uitgeplaat het inoculum sommen. C) De spuit is gesteriliseerd met 3 spoelingen in ethanol (2x) en steriel water. D) Tien microliter van de juiste verdunning in de injectiespuit. E) De celsuspensie geïnjecteerd in een 45 °hoek achter de eerste buik proleg. F) Verdunningen weer uitgeplaat een tweede maat van het inoculum leveren.
Figuur 3. Representatief resultaat van M. sexta injectie assay. Ongeveer 50 kolonievormende eenheden (CFU) van Xenorhabdus nematophila cellen in stationaire fase (10 pl van 10 -4 verdunning) geïnjecteerd in zes 4e instar M. sexta larven per stam. Zowel wildtype en mutant stam (LRP) met een vastgestelde virulentie defect geïnjecteerd en de insecten gecontroleerd sterfte tijd. Resultaten worden vermeld als percentage overlevende insecten tijd (in uren). Deze curven zijn statistisch verschillend, met een p-waarde van 0.000458 via log-rank analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De directe injectie van M. sexta larven met entomopathogene bacteriën, zoals hier beschreven, dient als een eenvoudig en effectief middel om bacteriële virulentie analyseren. De methode is ook zeer aanpasbaar aan te passen verschillende proefpersonen en / of voorwaarden. Bacteriën kunnen op diverse manieren bereid voor injectie. Bij X. nematophila, wild type cellen gekweekt in voedselrijke Luria-Bertani (LB) medium tot mid-log fase zijn typisch de meest virulente, doden meeste of alle insecten binnen 30 uur na injectie. Cellen in de stationaire fase vaak langer duurt 5-10 uur om de larven te doden. Hoewel groeifase invloed virulentie, het aantal geïnjecteerde cellen lijkt minder belangrijk 16, met typische inocula variërend van 20 tot 20.000 CFU. In feite bij Xenorhabdus en Photorhabdus species, zo weinig als 5 CFU volstaan om de gastheer te doden insect 17. Om de virulentie prope beoordelenrties bacteriesoorten die resistent zijn tegen ethanol sterilisatie (bijvoorbeeld Bacillus soorten), wegwerpnaalden kan worden gebruikt om elke unieke stam in plaats van ethanol sterilisatie (stap 3.4) injecteren.
Verdere aanpassingen van deze methode kan leiden tot wijzigingen in de opvoeding en / of manipulatie van M. sexta. kan bijvoorbeeld insecten worden gehouden tomatenplanten of tabaksbladeren als een natuurlijke voedingsbron. U kunt ook verschillende ontwikkelingsstadia van M. sexta larven worden getest door deze methode. Vierde instar larven werden gekozen op basis van hun relatief grote afmetingen, maar kleinere larven worden geïnjecteerd door deze methode. Vijfde instar larven geïnjecteerd, maar de veranderingen in het immuunsysteem tijdens deze fase van de ontwikkeling maken late 5e instar larven gevoeliger dan vroege 5 e instar larven 18 potentieel complicerende gegevensanalyse.
Tenslotte directe injectiewerkwijze kan worden aangepast voor gebruik met andere insectensoorten. M. sexta wordt als model gastheer hoogpathogene soorten omdat het minder gevoelig voor infectie dan andere (vatbaar) modelorganismen, zoals Galleria mellonella. G. mellonella worden geïnjecteerd volgens de methode in dit werk 19, echter, en kan nuttig zijn om assay bacteriesoorten minder virulent dan Xenorhabdus en Photorhabdus species.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De auteurs willen het verleden leden van de Goodrich-Blair lab bedanken: Samantha Orchard, Kimberly Cowles, Erin Herbert-Tran, Greg Richards, Megan Menard, en Youngjin Park voor hun bijdragen aan de ontwikkeling van dit protocol. Dit werk werd gefinancierd door de National Science Foundation subsidie IOS-0950873 en de National Institutes of Health NRSA gemeenschap FAI084441Z.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 90 mm filter paper | Whatman | 1001 090 | |
| Glass filter holder | Millipore | XX1004700 | |
| Manduca sexta eggs | Carolina Biological Supply | 143880 | |
| Gypsy Moth Diet + agar | MP Biomedicals | 0296029301 | |
| 5.5 oz. plastic containers and lids | Solo Cup Company | URC55-0090 Pl4-0090 | |
| 1 oz. plastic containers and lids | DART Container Corporation | 100PC 100PCL25 | |
| 1x PBS | 137 mm NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1.46 mM KH2PO4, pH 7.4 | ||
| Syringe | Hamilton | 80208 | 30 gauge, 0.375" length, point style 2 |
References
- Bintrim, S. B., Ensign, J. C. Insertional inactivation of genes encoding the crystalline inclusion proteins of Photorhabdus luminescens results in mutants with pleiotropic phenotypes. J. Bacteriol. 180, 1261-1269 (1998).
- Schesser, J. H., Kramer, K. J., Bulla, L. A. Bioassay for homogeneous parasporal crystal of Bacillus thuringiensis using the tobacco hornworm, Manduca sexta. Appl. Environ. Microbiol. 33, 878-880 (1977).
- Péchy-Tarr, M., Bruck, D. J., Maurhofer, M., Fischer, E., Vogne, C., Henkels, M. D., Donahue, K. M., Grunder, J., Loper, J. E., Keel, C. Molecular analysis of a novel gene cluster encoding an insect toxin in plant-associated strains of Pseudomonas fluorescens. Environ. Microbiol. 10, 2368-2386 (2008).
- Nuñez-Valdez, M. E., Calderón, M. A., Aranda, E., Hernández, L., Ramírez-Gama, R. M., Lina, L., Rodríguez-Segura, Z., Gutiérrez Mdel, C., Villalobos, F. J. Identification of a putative Mexican strain of Serratia entomophila pathogenic against root-damaging larvae of Scarabaeidae (Coleoptera). Appl. Environ. Microbiol. 74, 802-810 (2008).
- Forst, S. A., Tabatabai, N. Role of the histidine kinase, EnvZ, in the production of outer membrane proteins in the symbiotic-pathogenic bacterium Xenorhabdus nematophilus. Appl. Environ. Microbiol. 63, 962-968 (1997).
- Kanost, M. R., Jiang, H., Yu, X. Q. Innate immune responses of a lepidopteran insect, Manduca sexta. Immunol. Rev. 198, 97-105 (2004).
- Yu, X. Q., Zhu, Y. F., Ma, C., Fabrick, J. A., Kanost, M. R. Pattern recognition proteins in Manduca sexta plasma. Insect Biochem. Mol. Biol. 32, 1287-1293 (2002).
- Eleftherianos, I., ffrench-Constant, R. H., Clarke, D. J., Dowling, A. J., Reynolds, S. E. Dissecting the immune response to the entomopathogen Photorhabdus. Trends Microbiol. 18, 552-560 (2010).
- Tobacco Hornworm Genome Project [Internet]. , Baylor College of Medicine. Houston, TX. Available from: http://www.hgsc.bcm.tmc.edu/content/tobacco-hornworm-genome-project (2012).
- Herbert, E. E., Goodrich-Blair, H. Friend and foe: the two faces of Xenorhabdus nematophila. Nat. Rev. Microbiol. 5, 634-646 (2007).
- D'Argenio, D. A., Gallagher, L. A., Berg, C. A., Manoil, C. Drosophila as a model host for Pseudomonas aeruginosa Infection. J. Bacteriol. 183, 1466-1471 (2001).
- Waterfield, N., Dowling, A., Sharma, S., Daborn, P. J., Potter, U., Ffrench-Constant, R. H. Oral toxicity of Photorhabdus luminescens W14 toxin complexes in Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. 67, 5017-5024 (2001).
- Park, Y., Herbert, E. E., Cowles, C. E., Cowles, K. N., Menard, M. L., Orchard, S. S., Goodrich-Blair, H. Clonal variation in Xenorhabdus nematophila virulence and suppression of Manduca sexta immunity. Cell. Microbiol. 9, 645-656 (2007).
- Park, Y., Kim, Y., Putnam, S. M., Stanley, D. W. The bacterium Xenorhabdus nematophilus depresses nodulation reactions to infection by inhibiting eicosanoid biosynthesis in tobacco hornworms, Manduca sexta. Arch. Insect Biochem. Physiol. 52, 71-80 (2003).
- Cowles, K. N., Cowles, C. E., Richards, G. R., Martens, E. C., Goodrich-Blair, H. The global regulator Lrp contributes to mutualism, pathogenesis and phenotypic variation in the bacterium Xenorhabdus nematophila. Cell. Microbiol. 9, 1311-1323 (2007).
- Cowles, K. N., Goodrich-Blair, H. Expression and activity of a Xenorhabdus nematophila haemolysin required for full virulence towards Manduca sexta insects. Cell. Microbiol. 7, 209-219 (2005).
- Goodrich-Blair, H., Clarke, D. J. Mutualism and pathogenesis in Xenorhabdus and Photorhabdus: two roads to the same destination. Mol. Microbiol. 64, 260-268 (2007).
- Eleftherianos, I., Baldwin, H., ffrench-Constant, R. H., Reynolds, S. E. Developmental modulation of immunity: changes within the feeding period of the fifth larval stage in the defence reactions of Manduca sexta to infection by Photorhabdus. J. Insect Physiol. 54, 309-318 (2008).
- Kavanagh, K., Reeves, E. P. Exploiting the potential of insects for in vivo pathogenicity testing of microbial pathogens. FEMS Microbiol. Rev. 28, 101-112 (2004).
