Summary
השיטה המתוארת כאן מנצלת הזרקה ישירה של חיידקי entomopathogenic לhemocoel של
Abstract
Manduca סקסטה, הידוע בכינויו hornworm הטבק, נחשבת למזיק חקלאי משמעותי, האכלה על צמחי solanaceous כוללים טבק ועגבנייה. רגישותו של מ ' זחלי סקסטה למגוון מיני entomopathogenic חיידקי 1-5, כמו גם השפע של מידע הזמין לגבי מערכת חיסון של חרק 6-8, ואת רצף הגנום עד 9 להפוך אותו לאורגניזם מודל טוב לשימוש בחקר אינטראקציות מארח חיידק במהלך פתוגנזה. בנוסף, מ ' זחלי סקסטה גדולים יחסית וקלים לתפעל ולתחזק במעבדה היחסית למיני חרקים רגישים אחרים. ממדיהן גדולים גם מאפשרים מיצוי רקמה / hemolymph יעיל לניתוח של תגובת המארח לזיהום.
השיטה שהוצגה כאן מתארת הזרקה הישירה של חיידקים לhemocoel (חלל דם) של מ ' זחלי סקסטה. גישה זוניתן להשתמש בו כדי לנתח ולהשוות את המאפיינים הארסיים של מינים שונים של חיידקים, נקע, או פשוט על ידי מוטציות ניטור הזמן למות חרק לאחר הזרקה. שיטה זו פותחה ללמוד פתוגניות של Xenorhabdus ומיני Photorhabdus, אשר בדרך כלל לקשר עם וקטורים נמטודות כאמצעי לזכות כניסה לחרקים. נמטודות Entomopathogenic בדרך כלל להדביק זחלים דרך עיכול טבעי או פתחי נשימה, ולשחרר את תוכנם לתוך החיידקים סימביוטיים hemolymph החרקים (דם) זמן קצר לאחר מכן 10. שיטת ההזרקה המתוארת כאן עוקפת את הצורך בוקטור נמטודות, ובכך מתירה את ההשפעות של חיידקים ונמטודות על החרקים. שיטה זו מאפשרת לספירה מדויקת של חומר מדבק (תאים או חלבונים) בבידוד, דבר שאינו אפשרי בשיטות קיימות אחרות לניתוח entomopathogenesis, כוללות לסחוב 11 ומבחני רעילות אוראליים 12 התועלת של שיטת ההזרקה הישירה כפי שתואר כאן היא לנתח פתוגנזה חיידקים על ידי ניטור תמותת חרקים. עם זאת, שיטה זו יכולה בקלות להיות מורחבת לשימוש בחקר ההשפעות של זיהום על מ ' מערכת חיסונית של סקסטה. החרקים מגיבים לזיהום באמצעות שתי תגובות הומורלית ותאיות. התגובה הומורלית כוללת זיהוי תבניות חיידקים הקשורים והפקה הבאה של פפטידים שונים מיקרוביאלית 7; הביטוי של גני מקודדי חלבונים אלה יכול להיות במעקב לאחר זיהום ישיר באמצעות RNA חילוץ וכמותית PCR 13. התגובה התאית לזיהום כרוך nodulation, אנקפסולציה, וphagocytosis של חומרים מזהמים על ידי hemocytes 6 13, 14.
Protocol
1. עיקור ביצת חרקים וגידול
- הכן את הדיאטה של 15 גרם מעוקר הראשון של אגר ספק ב900-1,000 המ"ל H 2 O. מייד לאחר מעוקר, לערבב עם דיאטה 166 גר 'ניבט חיטה ותערובת היטב במעבדת בלנדר. יוצק לצלחת (או צלחות) להתקרר, ואז להעביר לדיאטת רדיד אלומיניום, עוטף היטב, ולאחסן ב 4 ° C.
- עם הגעתו, לעקר מ ' ביצי סקסטה עם 250 מ"ל של 0.6% בתמיסת כלור ל2-3 דקות בבעל זכוכית מסנן ומכשירים ירמסו עם נייר סינון 90 מ"מ, תוך ערבוב מדי פעם.
- הפעל ואקום לניקוז תמיסת כלור וביצי 3-4 פעמים לשטוף עם 250 המ"ל סטרילי המזוקק H 2 O לשטיפה.
- העברת ביצים לנייר חדש 90 מ"מ מסנן להציב מכסה צלחת הפטר ולאפשר להם להתייבש עד שהם כבר לא ביחד מקל (כ 20-30 דקות).
- העברת ביצים לתחתית מכלי פלסטיק עם דיאטת חרקים, צבת כ 40 ביצים בכל מכולה(איור 1 א). ביצים מופרדות מדיאטה על מנת למנוע זיהום פטרייתי לחות מושרה. לשמור על ביצים על 26 ° C עם אור 16 שעות: 8 השעות photoperiod הכהה. ביצים תהיינה להאיר לצבע צהוב לבן לפני הבקיעה.
- כאשר הבקיעה היא מוחלטת, להעביר בזהירות כ 25 זחלים לכל מכולות חדשות עם דיאטה בתחתית (1B איור). חשוב לאסוף את כל זחל על ידי הקרן השחורה הארוכה באמצעות מלקחיים, כדי למנוע פגיעה בם במהלך שלבי ההתפתחות המוקדמים השבירים שלהם. דגירה עבור 2 ימים כאמורים לעיל. בעוד מות זחל הוא יוצא דופן בשלב זה, חלק הזחלים מתים או, סבירים יותר, ננסי התפתחותית אפשר לראות. חרקים כאלה צריכים להיות מחוץ למחקר נוסף והקריבו על ידי הקפאה.
- כדי להימנע מהתנהגויות קניבליות, זחלי העברה למכלים נפרדים עם חתיכות קטנות של אוכל (התרשים 1C) ודגירה כאמורה לעיל. לעקוב אחר התפתחות חרקים, צואת החלפת מזון וניקוי ouלא של מכולות בכל יום אחר עד שהם עוברים את נשירת הזחל השלישית (בדרך כלל 6-9 ימים לאחר בקיעה). זה שלב ה 4 instar הזחל, המתאפיין במראה של crochets קרס השחור על כל גדולת proleg ומוגברת של פסים לאורך גוף החרק (1D איור). הזחלים עשויים להשתנות במידה ניכרת בגודלה, אך בדרך כלל שוקלים 0.15-0.4 גרם עם כניסתו לבמת instar -4. זחלים בגודל דומה צריכים להיבחר להזרקה.
2. הכנה של חיידקים להזרקה
- לגדול זן החיידקים (הים) להיבדק על פי נהלים הרגילים לשלב הצמיחה ברצונך לבדוק.
- 500 μl הגלולה של כל זן חיידקים שנבדק על ידי ספינינג עבור 2 דקות בmicrocentrifuge ב13000 סל"ד בטמפרטורת חדר.
- תאי resuspend בפוספט 1x סטרילי 1 המ"ל נאגרו מלוחים (PBS) וגלולה שוב כאמור לעיל.
- תאי resuspend ב 0.5 המ"ל סטרילי 1x PBS וmeaבטוח הצפיפות האופטית (OD) של ההשעיה. לדלל את כל ההשעיות לאותו OD, במידת צורך. תקשורת צמיחה סטריליים עשויה לשמש גם לresuspension תא ודילול במקום 1x PBS, אם תרצה בכך.
3. הזרקה של 4 זחלי Instar ה
- הכן דילולים סידוריים 10-קיפול של זן החיידקים הראשון ב6 בארות של צלחת 96-microtiter גם ב1x PBS סטרילי, באמצעות קצה פיפטה טריה עבור כל דילול (איור 2 א). הנפח הסופי של השעית תא בכל אחד גם צריך לחרוג הנפח נדרש להזרקה (10 μl לחרקים) בתוספת 20 μl לצלחת הבידוד (ראה שלבים 3.2 ו -3.7).
- 10 μl ספוט כל במשך 5 דילולים -2 (10 עד 10 -6) בחלק העליון של צלחת פטרי המכיל מדיום גידול מתאים. הטה את הצלחת כך שהכתמים התפשטו למרכז (איור 2 ב ').
- הסר דיאטת חרקים וצואה וחרקי מקום במכולות על קרחכ 5 דקות.
- לעקר את מחט המזרק על ידי שטיפת 3 פעמים כל אחד ב 2 צינורות של אתנול 70-100%, ואחריו צינור אחד H 2 O סטרילי (האיור 2C). הנפח נוזלי חייב להיות מספיק כדי להטביע את המחט.
- לכמת את המתלים הסלולריים לדלל תחת מיקרוסקופ באמצעות hemocytometer. בהתאם לבידוד הרצוי, לצייר 10 μl מmicrotiter המתאים היטב (האיור 2D).
- ספוגית משטח החרקים עם אתנול 95%, ולהזריק את השעית תא 10 מ"ל לחרקים בזווית (פחות מ 45 מעלות) מאחורי אחד מprolegs הבטן. יש להיזהר שלא לנקב את המעי ולהזריק את התוכן בדיוק מתחת לשכבת האפידרמיס (2E איור). בעוד שחלק אובדן hemolymph (נוזל שקוף, ירוק כחול) הוא נורמלי, חומר חלקיקים ונוזל צהוב יוצא מאתר ההזרקה מעיד על לנקב מעי. במקרה זה, להקריב את החרק ולהשיג זחל חדש מחדשלמקם אותו.
- חזור על שלב 3.6 לכל חרק שנותר בקבוצת הזריקה הראשונה. מחט העיקור אינו הכרחי בין כל חרקים הזריקו עם אותו הדילול והזן של חיידק אלא אם זיהום מתרחש. לחלופין, מנפק חוזר עשוי לשמש לעקביות רבה יותר בנפח הזרקה בין דגימות.
- לאחר ההזרקה כל חרקים במתח הראשון של חיידקים, חזור על שלב 3.2, הפעם ייכון השעיות סלולריות באמצע הצלחת ולתת להם לזרום לכיוון החלק התחתון (האיור 2F). דגירת צלחות בטמפרטורה המתאימה ולסמוך מושבות למנות בידוד. צעד 2 ציפוי זה משמש כדי לוודא שהדגימות אינן מזוהמות במהלך תהליך ההזרקה, שכן דבר יגרום למספרי מושבה שונים בין platings הראשון והשני.
- חזור על שלבים 3.1 עד 3.8 לכל זן של חיידק בניסוי. לבסוף, להזריק 3-5 חרקים עם 1x PBS סטרילי באמצעות sterמחט איל כקבוצת ביקורת שלילית. דגירת חרקים ב 26 ° C עם אור 16 שעות: 8 השעות photoperiod הכהה.
- פקח על הישרדות חרקים לאורך זמן לאחר הזרקה. מות חרק מאופיין כחוסר תנועה רצונית על גירוי. חרקים מציגים לעתים אובדן תיאבון, שלשולים (צואה מימית, צהובה), ו / או אובדן מים ("זעה") במהלך זיהום לפני המוות; מאפיינים אלו עשויים להיות ראויים לציון גם כן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
דוגמה מייצגת של assay תמותת חרקים מתואר באיור 3. בניסוי זה, חרקים הוזרקו כ 50 יחידות להרכיב מושבה (CFU) של כל אחד מסוגים פרא (ATCC19061) או זן מוחלש מוטציה (LRP 13) של Xenorhabdus nematophila גדל שלב יומן האמצע (n = 6 חרקים למתח). חרקים נצפו במשך כ 72 שעות, ואחוזים מהחרקים הזריקו עדיין בחיים בכל timepoint נרשמו. במקרה זה, הזן נחלש הציג עיכוב ברור בהריגת חרק; הזן פראי הסוג נהרג כל 6 הזחלים בתוך לאחר הזרקת 30 שעות, לפני מותו של כל זחל מוטציה נגועה.
איור 1. גידול חרקים בהכנה להזרקה. א) אודות 40 ביצי משטח מעוקר-ממוקמות בתחתית כוס עם 5 מ"לדיאטת חרקים עקרה נחה על פקק גומי. B) עשרים חרקים בקעו זה עתה מועברים ל5 כוסות עוז עם תזונת חרקים עקרות בתחתית ודגרו על 2 ימים. ג) חרקים מועברים בנפרד הבא ל1oz כוסות עם דיאטה סטרילית בתחתית ודגרו עד שהם מתבגרים. ד) הרביעי instar מ ' זחלי סקסטה עם פסים בולטים לאורך הגוף (עליון) וcrochets שחור על prolegs הבטן (תחתון).
איור 2. הזרקה של 4 בinstar מ ' זחלי סקסטה. א) חיידקים בדילול סדרתי בצלחת 96 היטב. B) עשר microliters של דילולים מרובים מצופים למנות בידוד. ג) המזרק מעוקר עם 3 שטיפות באתנול (2x) ומים מעוקרים. ד) עשר microliters מהדילול המתאים נמשכים לתוך המזרק. E) השעית התא מוזרקת ב45 °זווית מאחורי proleg הבטן הראשונה. F) דילולים מצופים שוב כדי לספק מדד שני של הבידוד.
איור 3. תוצאת נציגו של מ ' assay ההזרקה סקסטה. כ 50 יחידות מושבה להרכיב (CFU) של תאי Xenorhabdus nematophila בשלב נייח (10 μl מהדילול 10 -4) הוזרקו 6 4 בinstar מ ' זחלי סקסטה למתח. שניהם הסוג הפרוע ומתח מוטציה (LRP) עם פגם ארסיות הוקם הוזרקו והחרקים למעקב לתמותה לאורך זמן. תוצאות מדווחות כאחוז לשרוד חרקים לאורך זמן (בשעות). עקומות אלה הן סטטיסטיים מובהקות, עם p-value של 0.000458 באמצעות ניתוח לוגים מהשורה הראשונה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ההזרקה הישירה של מ ' זחלי סקסטה עם חיידקי entomopathogenic, כפי שמתוארים כאן, משמשים כאמצעי פשוט ויעיל לניתוח ארסיות חיידקים. השיטה היא גם ישימה מאוד כדי להתאים לנושאים ניסיוניים שונים ו / או תנאים. חיידקים יכולים להיות מוכנים בדרכים קודמות להזרקה שונות. במקרה של X. nematophila, תאים מסוג בר שגודלו בוריא-Bertani בינוני מזין עשיר (LB) לשלב אמצע יומן הוא בדרך כלל ארסי והורג את רוב או את כל החרקים בתוך 30 שעות לאחר הזרקה. תאים בשלב נייח לעתים קרובות לקחת שעות 5-10 כבר להרוג את הזחלים. למרות שלב צמיחה משפיע ארסיות, המספר הכולל של תאים המוזרקים נראה פחות חשוב 16, עם inocula הטיפוסי נע בין 20 ל 20000 CFU. למעשה, במקרה של Xenorhabdus ומיני Photorhabdus, כמה כמו 5 CFU מספיקים כדי להרוג את מארח החרקים 17. על מנת להעריך את נכס הארסיותrties סוגי חיידקים שעמידים לעיקור אתנול (למשל מיני Bacillus), מחטים חד פעמיות יכול לשמש כדי להזריק כל זן ייחודי במקום של עיקור אתנול (שלב 3.4).
התאמות נוספות בשיטה זו עשויות להיות כרוכות בשינויים בגידול ו / או מניפולציה של מ ' סקסטה. לדוגמה, חרקים עלולות להיות גדל על עלי עגבנייה או טבק כמקור מזון טבעי יותר. לחלופין, שלבי התפתחות שונים של מ ' זחלי סקסטה ניתן assayed בשיטה זו. זחלי instar הרביעיים נבחרו בהתבסס על הגודל גדול יחסית שלהם, אבל זחלים קטנים גם ניתן להזריק בשיטה זו. זחלי instar החמישיים ניתן להזריק, אולם השינויים במערכת החיסונית בשלב זה של התפתחות זחלים להפוך מאוחר instar ה 5 רגישים יותר מתחילת זחלי ה 5 instar 18, פוטנציאל מסבכים ניתוח נתונים.
לבסוף, הזרקה הישירהשיטה יכולה להיות מותאמת לשימוש עם מיני חרקים אחרים. מ ' סקסטה משמשת כמארח מודל למינים פתוגניים מאוד משום שהוא פחות רגיש לזיהום מאורגניזמים אחרים (רגיש יותר) מודל, כגון mellonella Galleria. ג mellonella ניתן להזריק בשיטה שתוארה בעבודת 19 זה, עם זאת, ועשוי להיות שימושי למיני חיידקי assay פחות ארסיים מXenorhabdus ומיני Photorhabdus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות לחברי העבר של גודריץ-בלייר המעבדה: סמנתה אורצ'רד, קימברלי קאולס, ארין הרברט-טראן, גרג ריצ'רדס, מייגן נרד, וYoungjin פרק על תרומתם לפיתוח של פרוטוקול זה. עבודה זו מומנה על ידי מענק קרן המדע הלאומי IOS-0950873 והמכונים הלאומיים לבריאות NRSA המלגה FAI084441Z.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 90 mm filter paper | Whatman | 1001 090 | |
| Glass filter holder | Millipore | XX1004700 | |
| Manduca sexta eggs | Carolina Biological Supply | 143880 | |
| Gypsy Moth Diet + agar | MP Biomedicals | 0296029301 | |
| 5.5 oz. plastic containers and lids | Solo Cup Company | URC55-0090 Pl4-0090 | |
| 1 oz. plastic containers and lids | DART Container Corporation | 100PC 100PCL25 | |
| 1x PBS | 137 mm NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1.46 mM KH2PO4, pH 7.4 | ||
| Syringe | Hamilton | 80208 | 30 gauge, 0.375" length, point style 2 |
References
- Bintrim, S. B., Ensign, J. C. Insertional inactivation of genes encoding the crystalline inclusion proteins of Photorhabdus luminescens results in mutants with pleiotropic phenotypes. J. Bacteriol. 180, 1261-1269 (1998).
- Schesser, J. H., Kramer, K. J., Bulla, L. A. Bioassay for homogeneous parasporal crystal of Bacillus thuringiensis using the tobacco hornworm, Manduca sexta. Appl. Environ. Microbiol. 33, 878-880 (1977).
- Péchy-Tarr, M., Bruck, D. J., Maurhofer, M., Fischer, E., Vogne, C., Henkels, M. D., Donahue, K. M., Grunder, J., Loper, J. E., Keel, C. Molecular analysis of a novel gene cluster encoding an insect toxin in plant-associated strains of Pseudomonas fluorescens. Environ. Microbiol. 10, 2368-2386 (2008).
- Nuñez-Valdez, M. E., Calderón, M. A., Aranda, E., Hernández, L., Ramírez-Gama, R. M., Lina, L., Rodríguez-Segura, Z., Gutiérrez Mdel, C., Villalobos, F. J. Identification of a putative Mexican strain of Serratia entomophila pathogenic against root-damaging larvae of Scarabaeidae (Coleoptera). Appl. Environ. Microbiol. 74, 802-810 (2008).
- Forst, S. A., Tabatabai, N. Role of the histidine kinase, EnvZ, in the production of outer membrane proteins in the symbiotic-pathogenic bacterium Xenorhabdus nematophilus. Appl. Environ. Microbiol. 63, 962-968 (1997).
- Kanost, M. R., Jiang, H., Yu, X. Q. Innate immune responses of a lepidopteran insect, Manduca sexta. Immunol. Rev. 198, 97-105 (2004).
- Yu, X. Q., Zhu, Y. F., Ma, C., Fabrick, J. A., Kanost, M. R. Pattern recognition proteins in Manduca sexta plasma. Insect Biochem. Mol. Biol. 32, 1287-1293 (2002).
- Eleftherianos, I., ffrench-Constant, R. H., Clarke, D. J., Dowling, A. J., Reynolds, S. E. Dissecting the immune response to the entomopathogen Photorhabdus. Trends Microbiol. 18, 552-560 (2010).
- Tobacco Hornworm Genome Project [Internet]. , Baylor College of Medicine. Houston, TX. Available from: http://www.hgsc.bcm.tmc.edu/content/tobacco-hornworm-genome-project (2012).
- Herbert, E. E., Goodrich-Blair, H. Friend and foe: the two faces of Xenorhabdus nematophila. Nat. Rev. Microbiol. 5, 634-646 (2007).
- D'Argenio, D. A., Gallagher, L. A., Berg, C. A., Manoil, C. Drosophila as a model host for Pseudomonas aeruginosa Infection. J. Bacteriol. 183, 1466-1471 (2001).
- Waterfield, N., Dowling, A., Sharma, S., Daborn, P. J., Potter, U., Ffrench-Constant, R. H. Oral toxicity of Photorhabdus luminescens W14 toxin complexes in Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. 67, 5017-5024 (2001).
- Park, Y., Herbert, E. E., Cowles, C. E., Cowles, K. N., Menard, M. L., Orchard, S. S., Goodrich-Blair, H. Clonal variation in Xenorhabdus nematophila virulence and suppression of Manduca sexta immunity. Cell. Microbiol. 9, 645-656 (2007).
- Park, Y., Kim, Y., Putnam, S. M., Stanley, D. W. The bacterium Xenorhabdus nematophilus depresses nodulation reactions to infection by inhibiting eicosanoid biosynthesis in tobacco hornworms, Manduca sexta. Arch. Insect Biochem. Physiol. 52, 71-80 (2003).
- Cowles, K. N., Cowles, C. E., Richards, G. R., Martens, E. C., Goodrich-Blair, H. The global regulator Lrp contributes to mutualism, pathogenesis and phenotypic variation in the bacterium Xenorhabdus nematophila. Cell. Microbiol. 9, 1311-1323 (2007).
- Cowles, K. N., Goodrich-Blair, H. Expression and activity of a Xenorhabdus nematophila haemolysin required for full virulence towards Manduca sexta insects. Cell. Microbiol. 7, 209-219 (2005).
- Goodrich-Blair, H., Clarke, D. J. Mutualism and pathogenesis in Xenorhabdus and Photorhabdus: two roads to the same destination. Mol. Microbiol. 64, 260-268 (2007).
- Eleftherianos, I., Baldwin, H., ffrench-Constant, R. H., Reynolds, S. E. Developmental modulation of immunity: changes within the feeding period of the fifth larval stage in the defence reactions of Manduca sexta to infection by Photorhabdus. J. Insect Physiol. 54, 309-318 (2008).
- Kavanagh, K., Reeves, E. P. Exploiting the potential of insects for in vivo pathogenicity testing of microbial pathogens. FEMS Microbiol. Rev. 28, 101-112 (2004).
