Summary
Для изучения взаимности между
Protocol
1. Строительство Флуоресцентные бактериальный штамм с помощью сопряжения
- Расти получателя деформации (симбионт должны быть рассмотрены) и доноров штамм в течение ночи. Донор деформации, как правило, кишечная палочка, должны быть способны отдавать ДНК через сопряжение и должны быть трансформированы плазмидой (табл. 2), который несет ген, кодирующий флуоресцентный белок. В зависимости от плазмиды штамма сопряжения помощник может также потребоваться. Если так, то это напряжение должно быть также выращивали в течение ночи. Штамма донора и вспомогательные деформации должны быть выращены с антибиотиками, чтобы выбрать для поддержания плазмид.
- Субкультура донора, помощник, и получатель штаммов в богатых питательными веществами средах роста не хватает антибиотиков в соотношении 1:100 культуры в среду.
- Рост культур при температуре соответствующей для каждого штамма пока они не достигают середины журнала стадии роста (OD 600 ~ 0,6). Для Xenorhabdus и E. палочки этом этапе растутм достигается примерно от 3 до 4 ч после пересева. Это может варьировать в зависимости от штамма, а в некоторых случаях плазмиды, используется.
- Смешать напряжения в трубе микроцентрифужных и центрифуги в течение 2 мин при 17900 мкг (13,000 оборотов в минуту в большинстве microfuges). Доля донора и реципиента, который дает наилучшие результаты будут различаться для разных комбинаций, и, возможно, придется быть определены эмпирически. Для Xenorhabdus получателя и E. палочка-доноров, мы используем 3:1 или 1:1. Если помощник штамм необходимости (например, кишечная палочка), оно должно быть добавлено в таком же соотношении, как донор.
- Слейте супернатант.
- Повторное приостановить осадок клеток в 30 мкл свежей среды.
- Найди подвески на богатых питательными веществами пластины средствах массовой информации без каких-либо антибиотиков, и позволяют месте для просушки.
- Инкубировать, перевернутый, в течение ночи при температуре оптимальной для бактерий получателя и допустимо для доноров (и помощник, если это применимо). Пластина должнабыть выведены по крайней мере 18 часов.
- Собрать место и для отжима одной колонии на селективные антибиотики пластины. Антибиотики должны выбрать от донора и получателя содержащие плазмиды. Одна или две дополнительные полосы изоляции может быть необходимо изолировать чистую культуру.
- Убедитесь, что в результате колонии получателя симбионтов, а не донора штамма, путем скрининга на наличие конкретного получателя фенотипов, таких как морфологии колонии, или полимеразной цепной реакции обнаружения получателем конкретных генов. Экран колоний на наличие плазмид с помощью полимеразной цепной реакции известной последовательности плазмиды и флуоресценции. В колониях должны светиться под правильным длиной волны, соответствующей флуоресцентного белка.
2. Производство стерильный Яйца нематод
- Расти 5 мл естественный бактериальный симбионта ночь. Чтобы начать культуры, бактерии могут быть привиты лизогении бульон (LB) или других у.е.lture средств массовой информации непосредственно из морозильной камеры акций или от полосы пластины.
- Распределите 600 мкл бактериальной культуры на 10 мм липидов агар (LA) пластин 29. От восьми до десяти пластин даст достаточно нематод для большинства видов.
- Инкубировать в темноте без влаги при 25 ° C в течение двух дней.
- Добавить 5000 инфекционного несовершеннолетних нематоды, или другие этапы в зависимости от нематод используются, в 500 мкл среды с бактериальным газонов. Инкубируйте пластины при температуре 25 ° С в течение 3 дней.
- Проверьте пластины на наличие взрослых нематод и яйца. Поместите 20 мкл воды на предметное стекло микроскопа. С помощью стерильной палочкой-царапина на небольшое количество нематод от бактериального газона. Положите палку в воду и позволяют нематод отплыть. Посмотрите на слайд при низком увеличении. Более подробную информацию о появлении см. обсуждение и рисунке 2.
- Если яйца и женщины являются видимыми, продолжать, в противном случае, инкубировать пластин при 25 и Dнапример, C и проверьте для правильного развития каждые 6-12 часов. Когда женщины содержат яиц, положите на несколько мл воды на поверхности пластины. Осторожно вращать тарелки и залить воду в 50 мл коническую трубку. Нематоды должны оторваться от плиты и быть не видна на поверхности пластины. Несколько полоскания может быть необходимым.
- Разрешить нематод оседают на дно пробирки.
- Промыть нематод. Внесите излишки воды из верхней части трубки. Пополнение с чистой водой и дайте взрослых нематод, чтобы обосноваться. Внесите лишнюю воду.
- Заполните конических труб с яйцом решение. Как только яйцо раствор добавляют сроки всех этапов с яйцом решение должно исходить именно так, как описано для максимального выхода яйцеклетки. Инкубировать пробирки при осторожном встряхивании ровно 10 мин. Большинство нематод должен быть распущен в конце инкубации.
- Сразу центрифуги конических труб при 1250 х г в течение ровно 10 минут (это включает в себя приведение центрифуг до скоростино не до 0 х гр. Используйте тормоз).
- Сразу переливать супернатант.
- Сразу повторно приостановить гранул с яйцом решение с помощью пипетки.
- Сразу заполнить коническую трубку с яйцом решения и хорошо перемешать путем обращения в 3-5 раз. Затем сразу же вращаться как в 2.10.
- Сразу переливать супернатант.
- Повторное приостановить гранул в LB с помощью пипетки, трансфер в 15 мл коническую трубку для улучшения гранулирования во время промывания. LB является стандартным для Steinernema SPP. Другие буферы (например, минимальной средней соли) могут быть использованы в зависимости от нематоды и бактерии, имея в виду буфера не должно вредить или нематоды или бактерии.
- Заполнить трубу с LB и спина, как и в 2.10.
- Слейте супернатант, и вновь приостановить LB.
- Промойте нематод в общей сложности 3 раза, повторяя 2,14 и 2,15.
- Развести повторно приостановил яйца нематод в соответствующем объеме. Там должно быть не менее 10 яиц в мкл. Например,GS могут быть сохранены в 6-см чашки Петри в 5 мл LB, по крайней мере, четыре дня, добавив антибиотиков, которые подавляют рост колонизации бактериями и упаковка пластины в парафильмом. Яиц нужно мыть раз в 15 мл LB (как и в 2,13 и 2,14) до посева на бактериальную газонов. Обратите внимание, что яйцо будет люк в это время и не могут быть синхронизированы развитием при использовании в колонизации анализов.
3. Совместное выращивание анализа с флуоресцентной бактерии
- Расти флуоресцентные бактерий в течение ночи, выбрав для плазмиды, если необходимо.
- Распределите 600 мкл бактериальной культуры на 10 мм пластины липидов Агар стерильной палочкой. Инкубировать при 25 ° С в течение 2 дней.
- Место 500-5,000 стерильный яйца нематод в общей сложности от 100 до 400 мкл (оптимально 2000 нематоды в 200 мкл) на каждую пластину агара липидов.
- Инкубировать в темноте без влаги при температуре 25 ° C до IJs или других этапов интерес, форма. IJs будет видно, как фуЗЗЫ белое кольцо на край тарелки. Чтобы посмотреть на других этапах жизни, см. Протокол 4.
- Установите пластины в измененном Белый ловушку 30. Снимите крышку пластины агара липидов и поместить нижний на дно пустого 100 мм х 20 мм чашки Петри. Наполните большую чашку Петри с водой или другой буфер подходящий для вашей нематоды, чтобы окружить небольшую тарелку. Уровень воды должна быть примерно половину высоты маленькую тарелку.
- Выдержите воду ловушки, пока потомство IJs появились в буфер.
- Нематоды Инфекционный несовершеннолетних могут быть сохранены в воду в колбе культуре ткани.
4. Коллекция ранних стадиях жизни для скрининга
- Использование шаги 3,1 через 3,4 до настройки анализа.
- Инкубируйте пластины нужный этапах жизни нет. Ежедневный визуальный осмотр может быть необходимо для определения времени. Для проверки пластин, использовать процедуру, описанную в протоколе 2.5. Для С. carpocapsae X. nematophila на пластинах Лос-Анджелесе, беременных самок будет присутствовать в течение 4-5 дней, несовершеннолетним будет присутствовать в 7 дней, и инфекционный несовершеннолетних начнет производиться на 15-17 дней.
- Когда желаемый этапах жизни присутствуют, собирать ваши образца. Заполните лунку 96-луночный планшет с 200 мкл PBS или другого соответствующего буфера. Аккуратно очистите от некоторых бактериальных газон, который содержит нематод. Величиной с горошину (~ 50 мг) обеспечит по крайней мере, несколько сотен нематод раз F1 потомство производят, но еще может быть необходимо для более ранних моментов времени. Положите палку в лунку, содержащую буфер.
- Выдержите в течение 30 секунд до минуты. Снимите палку и соскоблить оставшиеся остатки. Используйте палку, чтобы удалить агара из колодца. Нематоды должны быть видны в буфер. Переместить буферную смесь в чистую пробирку отцентрифугировать.
- Лечить нематод с левамизол или других парализующих агента. Растворите несколько зерен левамизол в 30-ти; Л воды. Добавить 1-2 мкл этой смеси для каждого 50 мкл образца. После левамизол лечение нематоды будет нежизнеспособным.
- Если образцы будут рассматриваться позднее, установить, как описано в этом шаге. Если нет, перейдите к шагу 4.6. Добавить 200 мкл фиксирующего раствора, содержащего 1X буфере и 4% параформальдегида. Осторожно перемешать, пипетирование может привести к тонким этапах жизни лизировать. Накрыть фольгой, и инкубировать при комнатной температуре на шейкере на низко в течение по крайней мере 18 часов.
- Поместите трубы в трубу стойки, и позволяют нематод оседают на дно пробирки.
- Промыть нематоды, чтобы удалить фон. Внесите лишнюю жидкость и добавить 200 - 500 мкл буфера и аккуратно перемешать. Повторить. Это может быть повторен несколько раз, чтобы удалить больше фона при желании.
- Разрешить нематод оседают на дно пробирки и вновь приостановить в нужном объеме.
- Если нематоды не фиксированы, экран практически мгновенно. Исправлена нематоды могут храниться в холодильнике в течениедо двух недель. Хранить в темноте.
5. Скрининг Нематоды для бактериальной ассоциацией по микроскопии
- Выберите некоторых нематод, чтобы посмотреть под микроскопом, удаляя небольшой образец вашей смеси.
- Чтобы убедиться, что нематоды еще за картину, относиться с паралитического агента, как описано в протоколе 4.5. Если вы не принимаете изображения или нематоды уже зафиксированы, этот шаг можно пропустить.
- Добавить 20-30 мкл нематод в воде, чтобы ваше стекло микроскопа и поместите покровное на вершине.
- Просмотреть все нематод с помощью световой микроскопии для обеспечения нематоды находятся в поле зрения.
- Просмотр нематод использованием флуоресцентных установка на микроскоп, который соответствует флуоресценции выраженные бактерий.
- Для выявления бактериальной локализации, сфотографировать нематод под флуоресцентным установки и настройки световой микроскопии, а затем наложить изображения. Фотографии должны быть одного и того же Фиэльд зрения. Это может быть необходимо, чтобы попробовать несколько увеличений и виды нематод, чтобы найти бактерии.
- Распределение нематод колонизации может быть определена количественно путем подсчета населения нематод, забив на наличие или отсутствие бактерий, и расчет процентов колонизирована. Мы рекомендуем счет до по крайней мере 30 нематоды в популяции насчитывается в каждой категории (с или без колонизации), чтобы получить надежные значения.
- Когда только несколько нематод в популяции колонизирована, это может быть необходимо, чтобы насчитать несколько тысяч нематод до 30 не наблюдается. Для высокой пропускной подсчета выполните следующие действия.
- Вместо подсчета нематод отдельно, аликвоты населения в мульти-луночный планшет (например, 24-луночный планшет). После того, нематодами осели на дно тарелки, каждую лунку могут быть проверены на микроскоп и число колонизированных нематод может быть засчитан.
- Общее количество нематод яН.А. населения могут быть определены последовательные разведения нематод в скважине. Например, 1 мл нематоды могут быть добавлены к хорошо, хорошо перемешивают при перемешивании с пипетки наконечник, и 3 мкл может быть удалена и считал для количественного определения общей численности населения в скважине.
- Процент колонизировали нематоды могут быть получены путем деления числа колонизировали общее количество нематод в скважине.
6. Представитель Результаты
Пример микроскопа, нематоды Steinernema, связанные с Xenorhabdus бактерий показано на рисунке 3. Для создания составного изображения показано на рисунке 3А, изображение фазового контраста был обложен флуоресцентные изображения. Стрелка на рисунке указывает 3A бактерий, присутствующих в инфекционных несовершеннолетних нематода (бар = 100 мкм). 3В был построен аналогичным образом и изображает несовершеннолетних нематоды Wiм зеленый флуоресцентный белок меченых бактерий (зеленый стержни), локализованных по всему нематоды просвете кишечника (бар = 20 мкм). Население нематод из двух сред были подсчитаны и забил для колонизации бактериальных симбионтов (табл. 1). Для надежной статистики, то лучше рассчитывать по меньшей мере 100 нематоды на образец, по крайней мере, 30 попадающие в каждой категории. Как видно из таблицы 1, эти нематоды колонизировали на уровне примерно 14,6% при росте на агаре липидов и 68,6% при росте на агаре печень почки. Другие нематоды и бактериальных видов было показано, что различные уровни колонизации. Например X. nematophila колонизирует 99% S. carpocapsae несовершеннолетних инфекционный (Martens 2003) и П. luminescens колонизирует 26% H. bacteriophora инфекционного несовершеннолетних (Ciche 2003).
Рисунок 1. Схема схема метода. А. бактерии разработан, чтобы выразить флуоресцентного белка. Яиц нематод B. изолированы от взрослых нематод для производства стерильных нематод. C. стерильную нематоды совместно культивируют с люминесцентными бактериями. D. В результате этапах жизни рассматривается под Микроскоп для оценки бактериального присутствия в нематодой.
Рисунок 2. Изображение взрослых самок, содержащие яйца. А. Схема показывает общий вид женщины Steinernema. Врезка: DIC образ С. feltiae беременной женщины. Черная стрелка указывает на наружных половых органах. Белые стрелки показывают видимые яйца. Изображение на 20-кратным увеличением, и шкалы составляет 100 мкм. B. DIC образом разработаны, но невылупившиеся С.feltiae нематоды яйцо. Изображение 40-кратном увеличении, а шкалы составляет 50 мкм. C. DIC изображение яйца изолированы от S. feltiae нематод при 10-кратном увеличении. Шкала бар 100 мкм.
Рисунок 3. Пример микроскопа, нематоды-бактериальных ассоциаций. А. С. puntauvense нематод, связанных с их бактериальных симбионтов, X. bovienii, выражая GFP. Изображение составного изображения производится путем наложения изображений фазового контраста с флуоресцентное изображение из того же поля зрения. Стрелка указывает на флуоресцентные бактериальных симбионтов в нематодой хозяина. Шкала бар составляет 100 мкм. B. Это изображение показывает S. carpocapsae несовершеннолетних нематод с GFP-экспрессирующих X. nematophila локализованы в пределах нематоды кишечника.Этот снимок был построен через наложение флуоресцентное изображение более контрастное изображение вмешательства дифференциала. Шкалы составляет 20 мкм.
| Напрягаться | Количество нематод с acteria | Всего Нематоды Подсчитано | Процент от нематоды olonized |
| С. puntauvense липидов Агар | 30 | 205 | 14,60% |
| С. puntauvense Печень Почки Агар | 72 | 105 | 68,60% |
Таблица 1. Пример озвучивание нематоды населения для бактериального присутствия. В этом эксперименте, стерильный С. puntauvense нематоды были выращены с их GFP-экспрессирующих симбионта на различные питательные среды (агар липидов печени и почек агар 32) для проверки колонизации дефектов. В общей сложности по меньшей мере одной hundreг нематод за образец были подсчитаны и забил на наличие бактерий. Для статистической мощности, три экспериментальных повторяет следует считать, по крайней мере, 30 нематоды падения в каждой категории.
Таблица 2. Флуоресцентные белки, содержащие плазмиды. Список потенциальных плазмиды для введения флуоресцентных белков в бактериальных симбионтов дается перечисленные по имени плазмиды. Другая информация включены флуоресцентного белка закодированного, антибиотик кассеты использовались для поддержания плазмид, другие инструкции по применению, источник плазмиды. Концентрация отметил в скобках концентрация антибиотиков, используемых для X. nematophila. Каждый из этих плазмид был успешно использован в любом Xenorhabdus или Photorhabdus. Дополнительная информация может быть получена из отметили, цитаты. В зависимостина бактерии проходят испытания, некоторые плазмиды не могут работать основанные на флуоресцентных белков, антибиотиков выбора, вставки сайте, или происхождение репликации. Плазмиды содержат перечисленные выше различные функции, которые могут позволить использование в бактерию интерес. Например, мини-Tn7-KSGFP вставляет в attTn7 сайте хромосомы, в то время как pECM20 вставляет в X. nematophila хромосомы гомологичной рекомбинации. Кроме того, pPROBE плазмиды сохраняются хромосомы, и каждый pPROBE плазмида имеет те же основы и флуорофор, но имеют разные селективных маркеров или происхождение репликации для обеспечения возможности их использования в различных таксономических или мутантного происхождения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол, описанный здесь, предоставляет метод для оптического обнаружения бактерий в нематодой хост (рис. 1). Этот метод использует оптическую прозрачность нематод и способности флуоресцентной меткой бактерий, что позволяет в естественных условиях анализа бактерий в нематодой хост (рис. 3). В частности, этот подход определяет бактериальной локализации в рамках своего хозяина. Путем подсчета населения нематод и очки для бактериального присутствия, частота бактериальной колонизации через нематоды населения может быть определена (табл. 1). Этот метод является одним из многих потенциальных методов, которые могут быть использованы для изучения взаимодействий между хосты нематод и бактериальных симбионтов. Теме методы были описаны ранее, чтобы изолировать бактериальных симбионтов, растут нематод axenically, и управлять обоими партнерами 25-27.
Протокол описан чпрежде чем была разработана в Xenorhabdus nematophila-Steinernema carpocapsae модель системы 14 и аналогичные подходы были использованы в других энтомопатогенных нематод-бактериальных ассоциаций 9,15,17,18. Некоторые условия должны быть выполнены для того, чтобы применить этот метод к другим нематоды-бактериальных системах. Во-первых, бактериальных симбионтов должны быть в состоянии быть изолирован от хозяина и самостоятельно выращивают в культуре. Во-вторых, симбионт должны быть в состоянии занять ДНК посредством трансформации или сопряжения для того, чтобы ввести флуоресцентный белок. В-третьих, для достижения наилучших результатов, нематоды должны иметь этап, который можно сделать стерильный и вновь к бактериям. Однако, даже если нематода не может быть изолирована от бактерий, он все еще может быть возможность визуализировать ассоциации: вместо добавления стерильный яйца на лужайке люминесцентными бактериями, добавить условно подняла жизненный этап и приступить к протоколу, как описано. Любой результат будет страдать от той оговоркой йна бактерии, которые не выражают GFP будет конкурировать с GFP-экспрессирующих бактерий для локализации специфических тканях нематод, и из-за этого, колонизация не должно быть измерено микроскопического подсчета. Однако, если бактерии, которые не выражают GFP резко вытеснять GFP-экспрессирующих бактерий, GFP-экспрессирующих бактерии должны локализуются в тканях нематод, по крайней мере, некоторых животных в популяции и предложить важные участки ткани для бактериальной колонизации. Давно предостережение помощью флуоресцентного белка выражения штамма является то, что они могут колонизировать хозяина с различной эффективностью, чем штамм, который не выражают флуоресцентные белки (например, 12).
Шаги, описанные в этом протоколе может потребовать оптимизации в зависимости от нематод и видов бактерий, которые используются. Для сопряжения бактерии некоторые условия, которые могут быть изменены, являются длина и температура роста, соотношение донора к реципиенту, и плазмаID используется. Примеры соответствующих плазмид приведены в таблице 2. Все эти плазмиды были успешно использованы в любом Xenorhabdus или Photorhabdus бактерий в связи с их нематоды хозяин 14,17,20,24,33-35. Для обеспечения стабильного поддержания флуоресцентный белок во время колонизации нематод лучше всего использовать плазмиды, что будет вставить в хромосому бактерии цель. Кроме того, некоторые бактерии не могут взять эти плазмиды. Например, pECM20 использовался только в X. nemtaophila и очень тесно связанные бактериальные штаммы 14, потому что эта плазмида вставки в хромосому использованием гомологичной области между плазмидой и хромосомой; плазмиды не вставляет, если цель бактерии не хватает этого региона. Для этого плазмиду для других бактерий, X. nematophila конкретного региона должны быть заменены геномной области от цели бактерии. Некоторые плазмиды преобразования схемы также будет гequire некоторыми изменениями из протокола 1. Например, мини-Tn 7-KSGFP и ПБК-miniTn 7-ΩGm-DsRed требуется помощник плазмиды, содержащей транспозиция генов (tsnABCDE) 33,35,36 для вставки в хромосому бактерии. Сопряжение является наиболее эффективным с этими Tn 7-основе плазмид, при 2-часовой культуры (~ OD 600 0,3-0,4) смешивают в равных соотношениях.
После успешного сопряжения важно использовать правильную избирательный пластины соответствующей плазмиды используются. Селективные пластины должна содержать антибиотики закодированы на плазмиде, чтобы выбрать на присутствие плазмиды в получателем и борьбе с выбором в отношении доноров и вспомогательные штаммов. Например, когда сопрягающих pECM20 в X. nematophila борьбе с выбором используется ампициллин, потому что X. nematophila является ампициллин устойчивостью и донора штамма ампициллину чувствительны. Если антибиотик против выбора недоступен в унашей системы, диаминопимелиновой кислоты (DAP), требующих донора могут быть использованы. Чтобы вырастить DAP-требующей штаммов, DAP добавляют в твердой и жидкой питательной среды во время предварительного сопряжения и сопряжения шаги, и опущены в борьбе с выбором этапов. Когда DAP отсутствует донора штамма не будет расти и эффективно противостоять выбранным.
Для обеспечения успешной изоляции яйцо важно, чтобы точно проверить для производства яиц (рис. 2). Во время изоляции, женщина нематоды должны быть полны яйца и яйца должны быть видны в средствах массовой информации (рис. 2A). Если самка нематоды производстве оплодотворенных яиц по крайней мере некоторые супернатант яйца будет заметно разработан как невылупившиеся нематод (рис. 2В). Для С. carpocapsae, яйца будет меняться от сферической или слегка продолговатые до разработки нематод и штриховки. Сроки и условия нематоды роста может также должны быть изменены, чтобы максимально оплодотворенной яйцеклеткидают, в том числе сокращение или удлинение периода времени, прежде чем яйцо сбора урожая, или с использованием альтернативных средств массовой информации, соответствующие конкретным видам нематод. В конце изоляции, яйца должны быть хорошо видны в буфере (рис. 2С). Параметры в протоколе яйца изоляции, что может потребовать оптимизации включают отбеливателя и КОН концентрации в яичном растворе, время инкубации яйца в растворе или центрифугирования. Если яйцо изоляции производит яйца нематод, но не развиваться во время совместного культивирования, вполне возможно, что изолированные яйца являются нежизнеспособными. Чтобы проверить жизнеспособность, оставьте изолированные яйца в буфер и ждать, нематоды, чтобы люк. Яйца должны люк в течение одного или двух дней, а затем изоляции несовершеннолетних нематоды могут быть использованы в совместном выращивании анализа. Если из яиц вылупляются, но не развиваться во время совместного культивирования анализа, это может быть необходимо изменить условия роста или среда, используемая для совместного культивирования. Отметим, что предыдущий Studieс выделили бактерии без нематод путем замачивания нематод в смесь антибиотиков (например, 3,37). Подход, который мы здесь описывать не содержит некоторые предостережения антибиотиков замачивания, в том числе осложнений с использованием бактериостатические антибиотики, устойчивые к антибиотикам бактерии загрязнения, а также антибиотик воздействие на нематод. Некоторые этапы нематоды могут также быть устойчивыми к антибиотикам и сохраняют свои бактериальных симбионтов 3. Наконец, отметим, что для микроскопии, концентрация левамизола необходимо для иммобилизации нематоды могут изменяться в зависимости от клады нематоды.
Как только этот метод был создан в системе интересов, можно изменять технику для получения дополнительной информации. Глядя на ранних моментов времени в цикл нематоды жизни (протокол 4), может быть в состоянии определить, каким образом бактерии и нематоды инициировать их ассоциации 14,16. Кроме того, этот подход может быть использован тØ провести высокой пропускной способности мутанта экраны для выявления бактериальных факторов, участвующих в симбиозе с помощью флуоресценции для выявления колонизации 17,18. Другие методы, такие как подписание отмеченных мутагенеза требуют использования радиоактивно меченых зондов и больше времени 22,28. Таким образом, использование флуоресцентной микроскопии для бактериальных симбионтов визуализации у нематод является эффективным и действенным инструментом отбора для исследования бактериальной взаимодействия с нематодой хозяина.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Eugenio Vivas, Курт Heungens, Эрик Мартенс, Чарльз Cowles, Дарби Sugar, Eric Стабб, и Тодд Ciche за их вклад в развитие этого протокола и инструменты, используемые. KEM и СКМ при поддержке Национального института здоровья (NIH) Национального исследовательского Service Award T32 (AI55397 "микробы в норме и патологии»). СКМ при поддержке Национального научного фонда (NSF) Высшее Research Fellowship. Эта работа была поддержана грантами от Национального научного фонда (IOS-0920631 и IOS-0950873).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipid Agar (sterile) |
8 grams nutrient broth, 15 grams agar, 5 grams yeast extract, 890 ml water, 10 ml 0.2 g/ml MgCl2. 6H20, 96 ml corn syrup solution*, 4 ml corn oil* Stir media while pouring plates *add sterile ingredient after autoclaving |
||
| Corn Syrup Solution (sterile) |
7 ml corn syrup, 89 ml water mix and autoclave |
||
| Egg Solution | 16.6 ml 12% sodium hypochlorite, 5 ml 5M KOH, 80 ml water | ||
| Lysogeny Broth (sterile) |
5 grams yeast extract, 10 grams tryptone, 5 grams salt, 1 L water mix and autoclave |
||
| Microfuge | Fisher | 13-100-675 | Any microfuge that holds microfuge tubes will work |
| Centrifuge | Beckman | 366802 | Large table top centrifuge that holds 15 ml and 50 ml conical tubes |
| Sterile 60 mm X 15 mm Petri Dish | Fisher | 0875713 | |
| 50 ml centrifuge tubes | Fisher | 05-539-6 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Fisher | 05-531-6 | |
| Sterile 100 mm X 20 mm Petri Dish | Fisher | 0875711Z | Deeper than standard Petri dishes |
| 24-well plate | Greiner Bio-One | 662000-06 | |
| Microscope | The microscope needs florescent capabilities compatible with your fluorophore | ||
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| PBS (sterile) |
8 g NaCL 0.2 g KCL 1.44 g Na2HPO4 0.24 g KH2PO4 1 L water Adjust to a pH of 7.4 and water to 1 L and autoclave |
||
| Microfuge tubes | Fisher | 05-408-138 | 2 ml or 1.5 ml tubes |
| Shaker | Any shaker that causes the liquid to gently move will work | ||
| Diaminopimelic acid | Sigma | D-1377 | If needed, supplement media to a concentration or 1 mM |
References
- Holterman, M., van der Wurff, A. Phylum-wide analysis of SSU rDNA reveals deep phylogenetic relationships among nematodes and accelerated evolution toward crown clades. Mol. Biol. Evol. 23, 1792-1800 (2006).
- Lambshead, P. J. D., Boucher, G. Marine nematode deep-sea biodiversity - hyperdiverse or hype. J. Biogeogr. 30, 475-485 (2003).
- Poinar, G. O. J., Thomas, G. M. Significance of Achromobacter nematophilus Poinar and Thomas (Achromobacteraceae: Eubacteriales) in the development of the nematode, DD-136 (Neoaplectana sp. Steinernematidae). Parasitol. 56, 385-390 (1966).
- Herbert, E. E., Goodrich-Blair, H. Friend and foe: the two faces of Xenorhabdus nematophila. Nat. Rev. Microbiol. 5, 634-646 (2007).
- Kaya, H. K., Gaugler, R. Entomopathogenic nematodes. Annu. Rev. Entomol. 38, 181-206 (1993).
- Bird, A. F., Akhurst, R. J. The nature of the intestinal vesicle in nematodes of the family Steinernematidae. Int. J. Parasitol. 13, 599-606 (1983).
- Martens, E. C., Goodrich-Blair, H. The Steinernema carpocapsae intestinal vesicle contains a subcellular structure with which Xenorhabdus nematophila associates during colonization initiation. Cell. Microbiol. 7, 1723-1735 (2005).
- Snyder, H. A., Stock, S. P., Kim, S. K., Flores-Lara, Y., Forst, S. New insights into the colonization and release process of Xenorhabdus nematophila and the morphology and ultrastructure of the bacterial receptacle of its nematode host, Steinernema carpocapsae. Appl. Environ. Microbiol. 73, 5338-5346 (2007).
- Abebe, E., Abebe-Akele, F., Morrison, J., Cooper, V., Thomas, W. K. An insect pathogenic symbiosis between a Caenorhabditis and Serratia. Virulence. 2, 158-161 (2011).
- Abebe, E., Jumba, M. An entomopathogenic Caenorhabditis briggsae. J. Exp. Biol. 213, 3223-3229 (2010).
- Torres-Barragan, A., Suazo, A., Buhler, W. G., Cardoza, Y. J. Studies on the entomopathogenicity and bacterial associates of the nematode Oscheius carolinensis. Biol. Control. 59, 123-129 (2011).
- Ye, W. M., Torres-Barragan, A., Cardoza, Y. Oscheius carolinensis n. sp (Nematoda: Rhabditidae), a potential entomopathogenic nematode from vermicompost. Nematology. 12, 121-135 (2010).
- Zhang, C., Liu, J. Heterorhabditidoides chongmingensis gen. nov., sp. nov. (Rhabditida: Rhabditidae), a novel member of the entomopathogenic nematodes. J. Invertebr. Pathol. 98, 153-168 (2008).
- Martens, E. C., Heungens, K., Goodrich-Blair, H. Early colonization events in the mutualistic association between Steinernema carpocapsae nematodes and Xenorhabdus nematophila bacteria. J. Bacteriol. 185, 3147-3154 (2003).
- Ciche, T. A., Ensign, J. C. For the insect pathogen, Photorhabdus luminescens, which end of a nematode is out. Appl. Environ. Microbiol. 69, 1890-1897 (2003).
- Ciche, T. A., Kim, K. S., Kaufmann-Daszczuk, B., Nguyen, K. C., Hall, D. H. Cell invasion and matricide during Photorhabdus luminescens transmission by Heterorhabditis bacteriophora nematodes. Appl. Environ. Microbiol. 74, 2275-2287 (2008).
- Easom, C. A., Joyce, S. A., Clarke, D. J. Identification of genes involved in the mutualistic colonization of the nematode Heterorhabditis bacteriophora by the bacterium Photorhabdus luminescens. BMC Microbiol. 10, 45 (2010).
- Somvanshi, V. S., Kaufmann-Daszczuk, B., Kim, K. S., Mallon, S., Ciche, T. A. Photorhabdus phase variants express a novel fimbrial locus, mad, essential for symbiosis. Mol. Microbiol. 77, 1021-1038 (2010).
- Martens, E. C., Russell, F. M., Goodrich-Blair, H. Analysis of Xenorhabdus nematophila metabolic mutants yields insight into stages of Steinernema carpocapsae nematode intestinal colonization. Mol. Microbiol. 51, 28-45 (2005).
- Sugar, D. R., Murfin, K. E. Phenotypic variation and host interactions of Xenorhabdus bovienii SS-2004, the entomopathogenic symbiont of Steinernema jollieti nematodes. Env. Microbiol. 14, 924-939 (2012).
- Cowles, C. E., Goodrich-Blair, H. The Xenorhabdus nematophila nilABC genes confer the ability of Xenorhabdus spp. to colonize Steinernema carpocapsae nematodes. J. Bacteriol. 190, 4121-4128 (2008).
- Heungens, K., Cowles, C. E., Goodrich-Blair, H. Identification of Xenorhabdus nematophila genes required for mutualistic colonization of Steinernema carpocapsae nematodes. Mol. Microbiol. 45, 1337-1353 (2002).
- Goetsch, M., Owen, H., Goldman, B., Forst, S. Analysis of the PixA inclusion body protein of Xenorhabdus nematophila. J. Bacteriol. 188, 2706-2710 (2006).
- Bhasin, A., Chaston, J. M., Goodrich-Blair, H. Mutational Analyses Reveal Overall Topology and Functional Regions of NilB, a Bacterial Outer Membrane Protein Required for Host Association in a Model of Animal-Microbe Mutualism. J. Bacteriol. 194, 1763-1776 (2012).
- Ciche, T. A., Goffredi, S. K. Methods in General and Molecular Microbiology. Reddy, C. A. , ASM Press. 394-419 (2007).
- Goodrich-Blair, H., Clarke, D., Grewal, P. S., Ciche, T. A. Insect Pathogens, Molecular Approaches and Techniques. Stock, S. P., Boemare, N., Vandenberg, J., Glazar, I. , CABI Publishing. 239-269 (2009).
- Stock, S. P., Goodrich-Blair, H. Manual of Techniques in Invertebrate Pathology. Lacey, L. A. , Elsevier Press. 375-425 (2012).
- Martens, E. C., Gawronski-Salerno, J. Xenorhabdus nematophila requires an intact iscRSUA-hscBA-fdx locus to colonize Steinernema carpocapsae nematodes. J. Bacteriol. 185, 3678-3682 (2003).
- Vivas, E. I., Goodrich-Blair, H. Xenorhabdus nematophilus as a model for host-bacterium interactions: rpoS is necessary for mutualism with nematodes. J. Bacteriol. 183, 4687-4693 (2001).
- White, G. F. A method for obtaining infective nematode larvae from cultures. Science. 66, 302-303 (1927).
- Ciche, T. A., Ensign, J. C. For the insect pathogen Photorhabdus luminescens, which end of a nematode is out. Appl. Environ. Microbiol. 69, 1890-1897 (2003).
- Sicard, M., Brun, N. L. e Effect of native Xenorhabdus on the fitness of their Steinernema hosts: contrasting types of interaction. Parasitol. Res. 91, 520-524 (2003).
- Lambertsen, L., Sternberg, C., Molin, S. Mini-Tn7 transposons for site-specific tagging of bacteria with fluorescent proteins. Environ. Microbiol. 6, 726-732 (2004).
- Miller, W. G., Leveau, J. H., Lindow, S. E. Improved gfp and inaZ broad-host-range promoter-probe vectors. Mol. Plant Microbe Int. 13, 1243-1250 (2000).
- Teal, T. K., Lies, D. P., Wold, B. J., Newman, D. K. Spatiometabolic stratification of Shewanella oneidensis biofilms. Appl. Environ. Microbiol. 72, 7324-7330 (2006).
- Bao, Y., Lies, D. P., Fu, H., Roberts, G. P. An improved Tn7-based system for the single-copy insertion of cloned genes into chromosomes of Gram-negative bacteria. Gene. 109, 167-168 (1991).
- Woodring, J. L., Kaya, H. K. Steinernematid and Heterorhabditid Nematodes: A Handbook of Biology and Techniques. Southern Cooperative Series Bulletin 331. , Arkansas Agricultural Experiment Station. (1988).
