Summary
Om de mutualisme tussen studeren
Abstract
Symbiose, het samenleven van twee of meer organismen, zijn wijdverspreid in alle koninkrijken van het leven. Als twee van de meest gebruikte organismen op aarde, nematoden en bacteriën vormen een breed scala van symbiotische associaties die variëren van gunstig pathogene 1-3. Een van deze vereniging is de wederzijds voordelige relatie tussen Xenorhabdus bacteriën en Steinernema nematoden, die zich ontpopt als een modelsysteem van symbiose 4. Steinernema nematoden zijn entomopathogene, met behulp van hun bacteriële symbiont te doden insecten 5. Voor overdracht tussen insect gastheren, de bacteriën koloniseren de darm van besmettelijke de nematode de juveniele fase 6-8. Onlangs hebben diverse andere nematode species aangetoond bacteriën gebruiken insecten te doden 9-13, en onderzoeken begonnen onderzoeken van de interacties tussen de nematoden en bacteriën in deze systemen <sup> 9.
We beschrijven een werkwijze voor visualisatie van een bacteriële symbiont in of op een nematode gastheer te maken van de optische transparantie van nematoden wanneer bekeken door microscopie. De bacteriën zijn ontworpen om een fluorescent eiwit tot expressie, zodat de visualisatie met fluorescentiemicroscopie. Veel plasmiden beschikbaar die dragen genen die coderen voor eiwitten die fluoresceren bij verschillende golflengten (bijvoorbeeld rood of groen), en conjugatie van plasmiden van een donor Escherichia coli-stam in een ontvanger bacteriële symbiont is succesvol voor een groot aantal bacteriën. De beschreven methoden zijn ontwikkeld om de associatie tussen Steinernema carpocapsae en Xenorhabdus nematophila 14 te onderzoeken. Soortgelijke methoden zijn gebruikt om andere nematode-bacterie associaties 9, 15-18 onderzoeken en de aanpak derhalve algemeen toepasbaar is.
The Method maakt karakterisering van bacteriële aanwezigheid en lokalisatie binnen nematoden in verschillende stadia van ontwikkeling, het verstrekken van inzicht in de aard van de vereniging en het proces van kolonisatie 14, 16, 19. Microscopische analyse onthult zowel kolonisatie frequentie binnen een populatie en lokalisatie van bacteriën gastheerweefsels 14, 16, 19-21. Dit is een voordeel ten opzichte van andere methoden om bacteriën in nematode populaties, zoals sonicatie 22 of slijpen 23, welke kan gemiddelde niveau van kolonisatie, maar mag bijvoorbeeld populaties onderscheid met een hoge frequentie van laag symbiont ladingen van populaties met een lage frequentie van hoge belastingen symbiont. Discrimineren de frequentie en belasting van koloniserende bacterie kan vooral van belang bij het screenen of het karakteriseren van bacteriële kolonisatie mutanten fenotypes 21, 24. Inderdaad, fluorescentie microscopie gebruikt in high throughput screening van bacteriële mutanten voor gebreken in kolonisatie 17, 18, en is minder arbeidsintensief dan andere methoden, zoals sonicatie 22, 25-27 en individuele nematode dissectie 28, 29.
Protocol
1. Bouw van een TL-bacteriestam via Vervoeging
- Grow de ontvangende stam (symbiont te onderzoeken) en donorstam 's nachts. De donor stam, gewoonlijk Escherichia coli, moeten kunnen doneren DNA via conjugatie en worden getransformeerd met een plasmide (Tabel 2) dat een gen dat codeert voor een fluorescent eiwit draagt. Afhankelijk van het plasmide kan een conjugatie helper stam ook nodig. Als dat zo is, moet deze stam ook 's nachts worden gekweekt. De donor stam en helper stam worden gekweekt met antibiotica om te selecteren op handhaving van het plasmide.
- Subculture de donor, helper, en de ontvanger stammen in voedselrijk groei medium zonder antibiotica in een 1:100 verhouding van cultuur aan medium.
- De kweken groeien in de juiste temperatuur voor elke stam tot zij mid-log fase groei (OD 600 ~ 0,6). Voor Xenorhabdus en E. coli dit stadium van de groeith bereikt ongeveer 3 tot 4 uur na subcultuur. Dit kan variëren afhankelijk van de stam, of in sommige gevallen het plasmide, gebruikt.
- Meng de stammen in een microcentrifuge en centrifugeer gedurende 2 minuten bij 17.900 xg (13.000 rpm in de meeste microfuges). Het aandeel van donor en ontvanger dat de beste resultaten oplevert varieert voor verschillende combinaties, en kan empirisch worden bepaald. Voor een Xenorhabdus ontvanger en E. coli donor, gebruiken we een 3:1 of 1:1 verhouding. Als een helper stam nodig is (bijvoorbeeld E. coli), moet worden toegevoegd in dezelfde verhouding als de donor.
- Schenk de supernatant.
- Resuspendeer de celpellet in 30 pl vers media.
- Spot de suspensie op een voedingsstof rijke media-plaat zonder antibiotica, en laat de plek om te drogen.
- Incubeer de plaat, omgekeerde, 's nachts bij een temperatuur optimaal is voor de ontvanger bacterie en toegelaten voor de donor (en helper, indien van toepassing). De plaat moetworden geïncubeerd tenminste 18 uur.
- Schraap de vlekken en strepen voor enkele kolonies op een selectieve antibiotica plaat. De antibiotica moet selecteren tegen de donor en de ontvanger die het plasmide. Een of twee extra isolatie stroken nodig zijn om een reincultuur isoleren.
- Zorgen de resulterende kolonies de ontvanger symbiont, en niet de donor stam, door screening op de aanwezigheid van specifieke fenotypes ontvanger, zoals koloniemorfologie, of polymerasekettingreactie detectie van ontvanger-specifieke genen. De kolonies te screenen op de aanwezigheid van het plasmide door polymerasekettingreactie van een bekende plasmidesequentie en fluorescentie. De kolonies moeten fluoresceren onder de juiste golflengte die overeenkomt met het fluorescerende eiwit.
2. Productie van eieren Axenische Nematode
- 'S nachts Grow 5 ml van de natuurlijke bacteriële symbiont. Een cultuur start, bacteriën worden geënt in Lysogeny Broth (LB) of andere culture media direct van een vrieslade of van een streak plaat.
- Verspreid 600 ul van de bacteriecultuur op 10 mm Lipid Agar (LA) platen 29. Acht tot tien platen levert voldoende voor de meeste soorten nematoden.
- Incubeer in het donker zonder vocht bij 25 ° C gedurende twee dagen.
- Voeg 5000 infectieuze juveniele nematoden, of in andere stadia afhankelijk van de gebruikte nematode, in 500 ui van media met bacteriële gazons. Incubeer de platen bij 25 ° C gedurende 3 dagen.
- Controleer platen voor de aanwezigheid van volwassen nematoden en eieren. Plaats 20 gl water op een microscoopglaasje. Een steriel stok scrape-een kleine hoeveelheid van de nematoden bacteriedek. Plaats de stok in het water en laat de nematoden te zwemmen. Kijk naar je schuif ze onder lage vergroting. Voor meer informatie over het uiterlijk zie de discussie en Figuur 2.
- Als eieren en vrouwen zichtbaar zijn, blijven, anders Incubeer de platen bij 25 & dbijvoorbeeld, C en controleer voor een goede ontwikkeling om de 6-12 uur. Bij vrouwtjes eieren bevatten, plaatst u een paar ml water op het oppervlak van de platen. Zwenk de borden en giet het water in een 50 ml conische buis. Nematoden moeten loskomen van de platen en niet meer zichtbaar zijn op het plaatoppervlak. Verschillende spoelingen nodig zijn.
- Laat de nematoden tot naar de bodem van de buis.
- Spoel nematoden. Pipetteer het overtollige water uit de top van de buis. Vul bij met schoon water en laat volwassen nematoden om zich te vestigen. Pipetteer het overtollige water.
- Vul de conische buizen met ei oplossing. Zodra ei oplossing wordt de timing van alle stappen met ei oplossing moet verder precies zoals beschreven voor maximale ei opbrengst. Incubeer de buizen tijdens het zachtjes schudden gedurende precies 10 minuten. De meeste nematoden worden opgelost door het einde van de incubatie.
- Centrifugeer het conische buizen op 1250 xg gedurende precies 10 minuten (dit omvat brengen van de centrifuge op snelheidmaar niet tot 0 x g. Gebruik de rem).
- Onmiddellijk decanteer de bovenstaande.
- Onmiddellijk resuspendeer de pellet met ei-oplossing door het pipetteren.
- Onmiddellijk vul conische buis met ei-oplossing en meng goed door het omkeren van 3-5 keer. Daarna onmiddellijk draaien zoals in 2.10.
- Onmiddellijk decanteer de bovenstaande.
- De pellet opnieuw te suspenderen in LB door pipetteren, over in een 15 ml conische buis voor verbeterde pellets tijdens wasstappen. LB is standaard voor Steinernema spp. Andere buffers (bijvoorbeeld een minimaal medium zouten) worden gebruikt afhankelijk van de nematode en bacterie, rekening houdend met de buffer niet schadelijk hetzij de nematode of bacterie.
- Vul de buis met LB en spin als in 2.10.
- Giet het supernatant en resuspendeer in LB.
- Spoel de nematoden in totaal 3 keer door het herhalen van 2.14 en 2.15.
- Verdunnen geresuspendeerd nematode eieren naar een geschikt volume. Er moet ten minste 10 eieren per microliter. Bvgs kunnen worden opgeslagen in een 6-cm Petrischaal in 5 ml LB gedurende ten minste vier dagen door het toevoegen antibiotica die de groei van bacteriën te remmen kolonisatie en verpakken van de plaat in parafilm. De eieren moeten keer in 15 ml LB (zoals in 2.13 en 2.14) worden gewassen vóór enten op bacteriële gazons. Merk op dat eitjes in deze tijd en mag niet ontwikkelingsachterstand worden gesynchroniseerd wanneer gebruikt in kolonisatie assays.
3. Co-teelt test met TL-Bacteriën
- Overnacht groeien fluorescerende bacteriën te selecteren voor het plasmide indien nodig.
- Spread 600 pi van de bacteriecultuur op 10 mm Lipid Agar platen met een steriele stick. Incubeer bij 25 ° C gedurende 2 dagen.
- Place 500-5000 axenische nematode eieren in een totaal van 100 tot 400 pl (optimaal 2,000 nematoden in 200 pi) op elk lipide agarplaat.
- Incubeer in het donker zonder vocht bij 25 ° C totdat IJs of andere stadia plaats, vorm. IJs is zichtbaar als een fuzzy witte ring aan de rand van de plaat. Om te kijken naar andere levensfasen, zie protocol nr. 4.
- Plaats de platen in een gewijzigde White trap 30. Verwijder het deksel van het lipide agar en plaats de onderkant in de bodem van een lege 100 mm x 20 mm petrischaal. Vul de grote petrischaal met water of andere geschikte buffer om nematode, omringen het plaatje. Het waterniveau ongeveer de halve hoogte van het plaatje zijn.
- Incubeer het waterslot tot nakomelingen IJs naar voren zijn gekomen in de buffer.
- Infectieuze juveniele nematoden worden opgeslagen in water in een weefselkweekfles.
4. Het verzamelen van de vroege levensfasen voor Screening
- Gebruik de stappen 3.1 tot 3.4 het opzetten van de test.
- Incubeer de platen tot de gewenste levensstadia aanwezig. Dagelijkse visuele inspectie niet noodzakelijk timing te bepalen. De platen inspecteren u de procedure beschreven in 2.5 Protocol. Voor S. carpocapsae X. nematophila op LA-platen, zwangere vrouwen aanwezig in 4-5 dagen zullen jongeren aanwezig in 7 dagen en infectieuze jonge zal beginnen worden door 15-17 dagen.
- Wanneer de gewenste levensfasen aanwezig zijn, het verzamelen van uw monster. Vul een putje van een plaat met 96 putjes met 200 ul PBS of andere geschikte buffer. Voorzichtig afschrapen enkele van de bacteriële gazon dat nematoden bevat. Een erwt hoeveelheid (~ 50 mg) zal ten minste enkele honderden nematoden eenmaal F1 nakomelingen worden geproduceerd, maar kan nodig zijn voor eerdere tijdstippen. Plaats de stok in de put bevattende buffer.
- Incubeer gedurende 30 seconden tot een minuut. Verwijder de stick en schraap de resterende residu. Gebruik de stok om een agar te verwijderen uit de put. De aaltjes moet zichtbaar zijn binnen de buffer. Verplaats de buffer mengsel een schone microfugebuis.
- Behandel de nematoden met levamisol of andere verlammende middel. Los een paar korreltjes levamisol in 30 & mu, L water. Voeg 1-2 ul van dit mengsel per 50 pl monster. Na behandeling levamisool de nematoden wordt niet levensvatbaar.
- Als voorbeelden worden bekeken op een later tijdstip vast zoals beschreven in deze stap. Zo niet, ga dan naar stap 4.6. Voeg 200 pl fixeeroplossing oplossing die 1X buffer en 4% paraformaldehyde. Meng voorzichtig, kan pipetteren veroorzaken delicate levensstadia te lyseren. Dek af met folie en incubeer bij kamertemperatuur op een shaker op laag tenminste 18 uur.
- Plaats de buizen in een buis rack, en laat de nematoden tot naar de bodem van de buis.
- Spoel nematoden om de achtergrond te verwijderen. Pipetteer overtollige vloeistof af en toe 200 tot 500 ul buffer en meng. Herhalen. Dit kan enkele malen herhaald om meer achtergrond te verwijderen indien gewenst.
- Laat de nematoden tot naar de bodem van de buis-resuspendeer in het gewenste volume.
- Als de nematoden zijn niet vast, scherm onmiddellijk. Vaste nematoden worden opgeslagen in de koelkasttwee weken. Bewaar in het donker.
5. Screening Nematoden voor bacteriële Association door Microscopie
- Selecteer een aantal nematoden onder de microscoop te bekijken door het verwijderen van een kleine steekproef van uw mengsel.
- Dat de nematoden nog voor de foto, te behandelen met een spierverslapper zoals beschreven in protocol 4.5. Als u niet het nemen van een foto of de nematoden al vastligt, kan deze stap worden overgeslagen.
- Voeg 20 tot 30 ul van nematoden in het water om je microscoopglaasje en plaats een dekglaasje op de top.
- Bekijk hele nematoden met behulp van licht microscopie om ervoor te zorgen nematoden zijn in het gezichtsveld.
- Zie nematoden met de instelling op de fluorescerende microscoop die overeenkomt met de fluorescentie die door de bacteriën.
- Om bacteriële lokalisatie identificeren, foto's maken van de nematode onder fluo-omgeving en een lichte microscopie instelling en superponeren de beelden. De foto moet van hetzelfde field gezien. Het kan nodig zijn om verschillende vergrotingen en uitzicht op de nematode proberen de bacteriën vinden.
- De verdeling van nematode kolonisatie kan worden gekwantificeerd door het tellen van een populatie van nematoden, scoren voor de aanwezigheid of afwezigheid van bacteriën en berekenen van het percentage gekoloniseerd. We raden tellen tot ten minste 30 nematoden binnen de populatie worden geteld in elke categorie (met of zonder kolonisatie) een betrouwbare waarde.
- Wanneer slechts enkele nematoden in de populatie gekoloniseerd, kan het nodig zijn om duizenden nematoden rekenen voor 30 waargenomen. Voor high-throughput tellen u de volgende stappen.
- Plaats van het tellen nematoden afzonderlijk aliquot de bevolking in een multi-well plaat (bijvoorbeeld een plaat met 24 putjes). Nadat de nematoden zich op de bodem van de schaal, kan elk putje worden gescand op de microscoop en het aantal gekoloniseerde nematoden gescoord.
- Het aantal nematoden ina populatie kunnen worden geïdentificeerd door seriële verdunningen van nematoden in de put. Kan bijvoorbeeld 1 ml van nematoden worden toegevoegd aan een goed kan goed gemengd door roeren met een pipet, en 3 ul verwijderd en geteld voor het bepalen van de totale bevolking in de put.
- Het percentage gekoloniseerde nematoden kan worden verkregen door het getal gekoloniseerd door het totale aantal nematoden in de put.
6. Representatieve resultaten
Voorbeeld microscoopbeelden van Steinernema nematoden verbonden Xenorhabdus bacteriën worden getoond in Figuur 3. Om de samengestelde afbeelding te zien in figuur 3A te maken, werd een fase contrast imago bedekt met een fluorescerende beeld. De pijl in Figuur 3A geeft de bacteriën in de infectieuze juveniele nematode (bar = 100 urn). Figuur 3B werd geconstrueerd op dezelfde manier en toont een juveniele nematode wie green fluorescent protein gelabeld bacteriën (groen staafjes) gelokaliseerd in de nematode darmlumen (bar = 20 pm). Een populatie van nematoden van twee media werden geteld en scoorde voor kolonisatie door de bacteriële symbiont (tabel 1). Voor robuuste statistiek, het beste ten minste 100 nematoden per monster tellen met tenminste 30 die in elke categorie. Zoals blijkt uit tabel 1, worden deze nematoden gekoloniseerd op een niveau van ongeveer 14,6% bij groei op lipide agar en 68,6% bij groei op agar nier lever. Andere nematode en bacteriesoorten is aangetoond dat verschillende kolonisatie hebben. Bijvoorbeeld X. nematophila koloniseert 99% van S. carpocapsae infectieuze jongeren (Martens 2003), en P. luminescens koloniseert 26% van de H. bacteriophora infectieuze jongeren (Ciche 2003).
Figuur 1. Schematisch overzicht van de werkwijze. A. De bacterie wordt gemanipuleerd om een fluorescent eiwit tot expressie. B. Nematode eieren geïsoleerd uit volwassen nematoden tot steriele nematoden produceren. C. De steriele nematoden geco-cultiveerd met de fluorescerende bacteriën. D. De resulterende levensstadia worden bekeken onder een microscoop bacteriële aanwezigheid in de nematode te evalueren.
Figuur 2. Afbeelding van volwassen vrouwtjes met eieren. A. Het schema toont de algemene verschijning van Steinernema vrouwen. Inzet: DIC beeld van een S. feltiae zwangere vrouw. De zwarte pijl geeft de vulva. Witte pijlen zichtbare eieren. Het beeld is bij 20X vergroting, en de schaal balk vertegenwoordigt 100 um. B. DIC beeld van een ontwikkeld, maar unhatched S.feltiae nematode ei. Het beeld is 40X vergroting, en de schaal balk vertegenwoordigt 50 pm. C. DIC beeld van eieren geïsoleerd uit S. feltiae nematoden onder 10x vergroting. Schaalstaaf is 100 pm.
Figuur 3. Voorbeeld microscoop beelden van nematode-bacteriële vereniging. A. S. puntauvense nematoden werden geassocieerd met bacteriële symbiont, X. bovienii, GFP tot expressie brengen. Het beeld is een samengesteld beeld geproduceerd door bedekken van een fase-contrast beeld met een fluorescerende beeld van hetzelfde gezichtsveld. De pijl geeft de TL-bacteriële symbiont binnen de nematode gastheer. Scale balk vertegenwoordigt 100 um. B. Dit beeld toont een S. carpocapsae juveniele nematode met GFP-expressie X. nematophila gelokaliseerd binnen de nematode darm.Dit beeld werd geconstrueerd door overlay een fluorescerende beeld over een differentieel interferentie contrast beeld. De schaal balk vertegenwoordigt 20 urn.
| Spannen | Aantal Nematoden Met Bacteriën | Totaal Nematoden Geteld | Percentage van Nematoden olonized |
| S. puntauvense Lipid Agar | 30 | 205 | 14,60% |
| S. puntauvense Lever Nier Agar | 72 | 105 | 68,60% |
Tabel 1. Voorbeeld scoren van een nematodenpopulatie voor bacteriële aanwezigheid. In dit experiment axenische S. puntauvense nematoden werden gekweekt met hun GFP-expressie symbiont op verschillende groeimedia (lipide agar en lever nieren agar 32) om te testen op kolonisatie gebreken. Een totaal van ten minste een hundred nematoden per monster werden geteld en gescoord voor de aanwezigheid van bacteriën. Voor statistische power, drie experimentele repliceert moet worden gerekend met ten minste 30 nematoden vallen in elke categorie.
Tabel 2. Fluorescent eiwit bevattende plasmiden. Een lijst van potentiële plasmiden voor insertie van een fluorescerend eiwit in de bacteriële symbiont wordt gerangschikt op naam plasmide. Ook andere informatie zijn het fluorescerende eiwit gecodeerde, antibiotica cassette voor plasmide ander onderhoud gebruiksaanwijzingen, de bron van het plasmide. De concentratie vermeld tussen haakjes is de concentratie van het antibioticum gebruikt X. nematophila. Elk van deze plasmiden is met succes gebruikt in zowel Xenorhabdus of Photorhabdus. Aanvullende informatie kan worden verkregen bij de bekende citaten. Afhankelijkop de bacterie wordt getest, kunnen sommige plasmiden niet gebaseerd op de fluorescerende eiwit, antibioticumselectie, insertieplaats of replicatieoorsprong. De plasmiden hierboven genoemde bevatten verschillende functies die gebruik kunnen schakelen in de bacterie van belang. Bijvoorbeeld, mini-Tn7-KSGFP inserts in de attTn7 plaats van het chromosoom, terwijl pECM20 inserts in de X. nematophila chromosoom door homologe recombinatie. Als alternatief worden de pPROBE plasmiden extrachromosomaal blijven en elk pPROBE plasmide heeft dezelfde backbone en fluorofoor maar verschillende selecteerbare markers of replicatieoorsprongen tot het gebruik ervan in verschillende taxonomische of mutant achtergronden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hier beschreven protocol verschaft een werkwijze voor de optische detectie van bacteriën in een nematode host (figuur 1). Deze methode maakt gebruik van de optische transparantie van nematoden en het vermogen om fluorescent label bacteriën, waardoor in vivo analyse van bacteriën in de nematode host (figuur 3). Bijzonder heeft deze benadering identificeert bacteriële lokalisatie in ontvanger. Door het tellen van een nematodenpopulatie en scores voor bacteriële aanwezigheid kan de frequentie van bacteriële kolonisatie in de nematode populatie bepaald (Tabel 1). Deze methode is een van de vele mogelijke technieken die kunnen worden gebruikt voor onderzoek naar de interactie tussen nematode hosts en bacteriële symbionten. Verwante methoden zijn hiervoor beschreven aan de bacteriële symbiont isoleren axenisch kweken nematoden, en beide partners 25-27 manipuleren.
Beschreven protocol here werd ontwikkeld in de Xenorhabdus nematophila-Steinernema carpocapsae modelsysteem 14, en soortgelijke benaderingen zijn gebruikt in andere entomopathogene nematode-bacteriële verenigingen 9,15,17,18. Reeks voorwaarden worden voldaan om deze methode toe te passen andere nematode-bacteriële systemen. Ten eerste moet de bacteriële symbiont kunnen worden geïsoleerd uit de gastheer en onafhankelijk in kweek. Ten tweede moet de symbiont kunnen nemen DNA door transformatie of conjugatie om het fluorescerende eiwit voeren. Derde, voor de beste resultaten moet de nematode een podium kan worden gemaakt en opnieuw axenische bacteriën. Zelfs indien de nematode niet kan worden geïsoleerd uit de bacteriën kan het nog steeds mogelijk om de vereniging visualiseren: plaats van het toevoegen axenische eieren het gazon van fluorescerende bacteriën, voeg een conventioneel verhoogde levensfase en het protocol beschreven gaan. Alle resultaten zullen lijden onder de waarschuwing enaar bacteriën die niet uitdrukkelijk wordt met GFP GFP-expressie bacteriën concurreren voor lokalisatie specifieke nematode weefsels en daardoor moet kolonisatie niet worden gemeten door microscopische telling. Tenzij de bacteriën die GFP expressie drastisch wegconcurreren GFP-expressie bacteriën GFP-expressie bacteriën te lokaliseren nematode weefsels in tenminste sommige dieren in de populatie en suggereren belangrijk weefsel plaatsen voor bacteriële kolonisatie. Een langdurige nadeel van het gebruik van fluorescerende eiwit tot expressie stammen is dat zij een gastheer koloniseren met verschillende efficiëntie dan een stam die niet tot expressie fluorescerende eiwitten (bijv. 12).
Stappen zoals beschreven in dit protocol kan eisen worden geoptimaliseerd afhankelijk van de nematode en bacteriële soorten die worden gebruikt. Voor conjugatie van de bacterie aan voorwaarden die kunnen worden gewijzigd zijn de lengte en de temperatuur van de groei, de verhouding van donor tot ontvanger, en plasmaid gebruikt. Voorbeelden van relevante plasmiden zijn opgesomd in Tabel 2. Al deze plasmiden zijn met succes gebruikt in zowel Xenorhabdus of Photorhabdus bacteriën in samenwerking met de nematode gastheer 14,17,20,24,33-35. Om stabiele handhaving van het fluorescerende eiwit verzekeren tijdens nematode kolonisatie het beste een plasmide dat stellen in het chromosoom van de bacterie doel. Verder kunnen sommige bacteriën niet nemen deze plasmiden. Zo is pECM20 alleen gebruikt in X. nemtaophila en nauw verwant bacteriestammen 14 omdat dit plasmide inserts in het chromosoom met een homoloog gebied tussen het plasmide en chromosoom het plasmide niet plaats als het doel bacterie mist deze regio. Dit plasmide voor andere bacteriën, de X. nematophila specifieke gebied moet worden vervangen door een genomisch gebied van het doel bacterie. Sommige plasmide-transformatie regelingen zullen ook rnoodzakelijk maken bepaalde wijzigingen van Protocol nr. 1. Bijvoorbeeld, mini-Tn 7-KSGFP en pBK-miniTn 7-ΩGm-DsRed vereisen een helper plasmide dat genen omzetting (tsnABCDE) 33,35,36 invoegen in het bacteriële chromosoom. Conjugatie is meest efficiënte deze Tn 7-gebaseerde plasmiden, wanneer 2-uur kweken (~ 0,3 tot 0,4 OD600) gemengd in gelijke verhoudingen.
Na succesvolle conjugatie is het belangrijk om gebruik te maken correct selectieve platen overeenkomt met de gebruikte plasmide. De selectieve platen bevat de antibiotica gecodeerd op het plasmide te selecteren op de aanwezigheid van het plasmide in de ontvanger en een tegen-selectie tegen de donor en helper stammen. Wanneer bijvoorbeeld conjugeren pECM20 in X. nematophila de gebruikte anti-selectie is ampicilline, omdat X. nematophila is ampicilline resistente en de donor stam is ampicilline gevoelig. Als antibiotica tegen-selectie is niet beschikbaar in yons systeem een diaminopimelinezuur (DAP) ter donor worden gebruikt. Om te groeien DAP-die stammen, wordt DAP toegevoegd aan vaste en vloeibare groeimedia tijdens de pre-conjugatie en conjugatie stappen, en weggelaten tijdens contra-selectie fasen. Wanneer DAP afwezig is de donor stam zal groeien niet en is effectief tegen de geselecteerde.
Te zorgen voor een succesvolle ei isolatie is het noodzakelijk om nauwkeurig controleren eierproductie (figuur 2). Bij de isolatie moeten vrouwelijke nematoden vol eieren en wat eieren zichtbaar in de media (Figuur 2A). Als vrouwelijke nematoden produceren bevruchte eieren ten minste enkele supernatant eieren zichtbaar zijn ontwikkeld unhatched nematoden (Figuur 2B). Voor S. carpocapsae, zal de eieren veranderen van bolvormig tot licht langwerpige voorafgaand aan het ontwikkelen nematoden en broedeieren. De timing of voorwaarden van nematoden groei kan ook moeten worden veranderd om bevruchte eicel te maximaliserenopleveren, met inbegrip van inkorten of verlengen van de periode van tijd voordat ei oogsten, of het gebruik van alternatieve media afgestemd op de specifieke nematode soort. Aan het einde van de isolatie moeten eieren gemakkelijk zichtbaar in de buffer (Figuur 2C). Parameters in het ei los protocol dat vereisen optimalisatie zijn bleekwater en KOH concentraties in het ei-oplossing, incubatietijd in ei-oplossing, of centrifugeersnelheid. Als het ei isolatie produceert maar geen eieren nematoden ontwikkelen tijdens de gelijktijdige kweek, is het mogelijk dat de geïsoleerde eieren niet levensvatbaar. Om te controleren op haalbaarheid, laat de geïsoleerde eieren in buffer en wacht tot nematoden om uit te komen. De eieren moeten komen binnen een of twee dagen van isolatie en de juveniele nematoden in de cocultivering assay. Als de eitjes, maar niet ontwikkelen tijdens de gelijktijdige kweek assay, kan het noodzakelijk zijn de groeiomstandigheden of medium voor co-kweek wijzigen. We merken op dat de vorige Studies hebben geïsoleerd bacterievrij aaltjes door het weken de nematoden in een antibiotica cocktail (bijv. 3,37). De aanpak hier beschreven is een aantal valkuilen van antibiotica inweken, waaronder complicaties met bacteriostatische antibiotica resistente besmettende bacteriën en antibiotische effecten op de nematoden. Bepaalde stadia van nematoden kunnen ook resistent zijn tegen antibiotica en behouden hun bacteriële symbionten 3. Tot slot merken wij op dat voor microscopie, de concentratie van levamisol die noodzakelijk zijn voor nematoden immobilisatie kan variëren met verschillende nematode clades.
Zodra deze methode werd aangetoond in het systeem van belang is het mogelijk om de techniek te wijzigen om beter informatie. Door te kijken naar eerdere tijdstippen in de nematode levenscyclus (Protocol 4), kan men in staat zijn om te bepalen hoe de bacterie en nematoden hun vereniging 14,16 starten. Bovendien kan deze benadering worden gebruikt to voert een high throughput mutant schermen bacteriële factoren die de symbiose identificeren met behulp van fluorescentie kolonisatie 17,18 detecteren. Andere methoden, zoals naam gelabeld mutagenese is het gebruik van radioactief gemerkte probes en zijn tijdrovend 22,28. Daarom is het gebruik van fluorescentiemicroscopie voor bacteriële symbiont visualisatie in nematoden is een effectief en efficiënt onderzoekshulpmiddel voor onderzoek bacteriële interacties met een nematode host.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De auteurs willen Eugenio Vivas, Kurt Heungens, Eric Martens, Charles Cowles, Darby suiker, Eric Stabb, en Todd Ciche bedanken voor hun bijdragen aan de ontwikkeling van dit protocol en instrumenten die worden gebruikt. KEM en JMC werden ondersteund door National Institutes of Health (NIH) National Research Service Award T32 (AI55397 "Microben in gezondheid en ziekte"). JMC werd ondersteund door een National Science Foundation (NSF) Graduate Research Fellowship. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Science Foundation (IOS-0920631 en IOS-0950873).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipid Agar (sterile) |
8 grams nutrient broth, 15 grams agar, 5 grams yeast extract, 890 ml water, 10 ml 0.2 g/ml MgCl2. 6H20, 96 ml corn syrup solution*, 4 ml corn oil* Stir media while pouring plates *add sterile ingredient after autoclaving |
||
| Corn Syrup Solution (sterile) |
7 ml corn syrup, 89 ml water mix and autoclave |
||
| Egg Solution | 16.6 ml 12% sodium hypochlorite, 5 ml 5M KOH, 80 ml water | ||
| Lysogeny Broth (sterile) |
5 grams yeast extract, 10 grams tryptone, 5 grams salt, 1 L water mix and autoclave |
||
| Microfuge | Fisher | 13-100-675 | Any microfuge that holds microfuge tubes will work |
| Centrifuge | Beckman | 366802 | Large table top centrifuge that holds 15 ml and 50 ml conical tubes |
| Sterile 60 mm X 15 mm Petri Dish | Fisher | 0875713 | |
| 50 ml centrifuge tubes | Fisher | 05-539-6 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Fisher | 05-531-6 | |
| Sterile 100 mm X 20 mm Petri Dish | Fisher | 0875711Z | Deeper than standard Petri dishes |
| 24-well plate | Greiner Bio-One | 662000-06 | |
| Microscope | The microscope needs florescent capabilities compatible with your fluorophore | ||
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| PBS (sterile) |
8 g NaCL 0.2 g KCL 1.44 g Na2HPO4 0.24 g KH2PO4 1 L water Adjust to a pH of 7.4 and water to 1 L and autoclave |
||
| Microfuge tubes | Fisher | 05-408-138 | 2 ml or 1.5 ml tubes |
| Shaker | Any shaker that causes the liquid to gently move will work | ||
| Diaminopimelic acid | Sigma | D-1377 | If needed, supplement media to a concentration or 1 mM |
References
- Holterman, M., van der Wurff, A. Phylum-wide analysis of SSU rDNA reveals deep phylogenetic relationships among nematodes and accelerated evolution toward crown clades. Mol. Biol. Evol. 23, 1792-1800 (2006).
- Lambshead, P. J. D., Boucher, G. Marine nematode deep-sea biodiversity - hyperdiverse or hype. J. Biogeogr. 30, 475-485 (2003).
- Poinar, G. O. J., Thomas, G. M. Significance of Achromobacter nematophilus Poinar and Thomas (Achromobacteraceae: Eubacteriales) in the development of the nematode, DD-136 (Neoaplectana sp. Steinernematidae). Parasitol. 56, 385-390 (1966).
- Herbert, E. E., Goodrich-Blair, H. Friend and foe: the two faces of Xenorhabdus nematophila. Nat. Rev. Microbiol. 5, 634-646 (2007).
- Kaya, H. K., Gaugler, R. Entomopathogenic nematodes. Annu. Rev. Entomol. 38, 181-206 (1993).
- Bird, A. F., Akhurst, R. J. The nature of the intestinal vesicle in nematodes of the family Steinernematidae. Int. J. Parasitol. 13, 599-606 (1983).
- Martens, E. C., Goodrich-Blair, H. The Steinernema carpocapsae intestinal vesicle contains a subcellular structure with which Xenorhabdus nematophila associates during colonization initiation. Cell. Microbiol. 7, 1723-1735 (2005).
- Snyder, H. A., Stock, S. P., Kim, S. K., Flores-Lara, Y., Forst, S. New insights into the colonization and release process of Xenorhabdus nematophila and the morphology and ultrastructure of the bacterial receptacle of its nematode host, Steinernema carpocapsae. Appl. Environ. Microbiol. 73, 5338-5346 (2007).
- Abebe, E., Abebe-Akele, F., Morrison, J., Cooper, V., Thomas, W. K. An insect pathogenic symbiosis between a Caenorhabditis and Serratia. Virulence. 2, 158-161 (2011).
- Abebe, E., Jumba, M. An entomopathogenic Caenorhabditis briggsae. J. Exp. Biol. 213, 3223-3229 (2010).
- Torres-Barragan, A., Suazo, A., Buhler, W. G., Cardoza, Y. J. Studies on the entomopathogenicity and bacterial associates of the nematode Oscheius carolinensis. Biol. Control. 59, 123-129 (2011).
- Ye, W. M., Torres-Barragan, A., Cardoza, Y. Oscheius carolinensis n. sp (Nematoda: Rhabditidae), a potential entomopathogenic nematode from vermicompost. Nematology. 12, 121-135 (2010).
- Zhang, C., Liu, J. Heterorhabditidoides chongmingensis gen. nov., sp. nov. (Rhabditida: Rhabditidae), a novel member of the entomopathogenic nematodes. J. Invertebr. Pathol. 98, 153-168 (2008).
- Martens, E. C., Heungens, K., Goodrich-Blair, H. Early colonization events in the mutualistic association between Steinernema carpocapsae nematodes and Xenorhabdus nematophila bacteria. J. Bacteriol. 185, 3147-3154 (2003).
- Ciche, T. A., Ensign, J. C. For the insect pathogen, Photorhabdus luminescens, which end of a nematode is out. Appl. Environ. Microbiol. 69, 1890-1897 (2003).
- Ciche, T. A., Kim, K. S., Kaufmann-Daszczuk, B., Nguyen, K. C., Hall, D. H. Cell invasion and matricide during Photorhabdus luminescens transmission by Heterorhabditis bacteriophora nematodes. Appl. Environ. Microbiol. 74, 2275-2287 (2008).
- Easom, C. A., Joyce, S. A., Clarke, D. J. Identification of genes involved in the mutualistic colonization of the nematode Heterorhabditis bacteriophora by the bacterium Photorhabdus luminescens. BMC Microbiol. 10, 45 (2010).
- Somvanshi, V. S., Kaufmann-Daszczuk, B., Kim, K. S., Mallon, S., Ciche, T. A. Photorhabdus phase variants express a novel fimbrial locus, mad, essential for symbiosis. Mol. Microbiol. 77, 1021-1038 (2010).
- Martens, E. C., Russell, F. M., Goodrich-Blair, H. Analysis of Xenorhabdus nematophila metabolic mutants yields insight into stages of Steinernema carpocapsae nematode intestinal colonization. Mol. Microbiol. 51, 28-45 (2005).
- Sugar, D. R., Murfin, K. E. Phenotypic variation and host interactions of Xenorhabdus bovienii SS-2004, the entomopathogenic symbiont of Steinernema jollieti nematodes. Env. Microbiol. 14, 924-939 (2012).
- Cowles, C. E., Goodrich-Blair, H. The Xenorhabdus nematophila nilABC genes confer the ability of Xenorhabdus spp. to colonize Steinernema carpocapsae nematodes. J. Bacteriol. 190, 4121-4128 (2008).
- Heungens, K., Cowles, C. E., Goodrich-Blair, H. Identification of Xenorhabdus nematophila genes required for mutualistic colonization of Steinernema carpocapsae nematodes. Mol. Microbiol. 45, 1337-1353 (2002).
- Goetsch, M., Owen, H., Goldman, B., Forst, S. Analysis of the PixA inclusion body protein of Xenorhabdus nematophila. J. Bacteriol. 188, 2706-2710 (2006).
- Bhasin, A., Chaston, J. M., Goodrich-Blair, H. Mutational Analyses Reveal Overall Topology and Functional Regions of NilB, a Bacterial Outer Membrane Protein Required for Host Association in a Model of Animal-Microbe Mutualism. J. Bacteriol. 194, 1763-1776 (2012).
- Ciche, T. A., Goffredi, S. K. Methods in General and Molecular Microbiology. Reddy, C. A. , ASM Press. 394-419 (2007).
- Goodrich-Blair, H., Clarke, D., Grewal, P. S., Ciche, T. A. Insect Pathogens, Molecular Approaches and Techniques. Stock, S. P., Boemare, N., Vandenberg, J., Glazar, I. , CABI Publishing. 239-269 (2009).
- Stock, S. P., Goodrich-Blair, H. Manual of Techniques in Invertebrate Pathology. Lacey, L. A. , Elsevier Press. 375-425 (2012).
- Martens, E. C., Gawronski-Salerno, J. Xenorhabdus nematophila requires an intact iscRSUA-hscBA-fdx locus to colonize Steinernema carpocapsae nematodes. J. Bacteriol. 185, 3678-3682 (2003).
- Vivas, E. I., Goodrich-Blair, H. Xenorhabdus nematophilus as a model for host-bacterium interactions: rpoS is necessary for mutualism with nematodes. J. Bacteriol. 183, 4687-4693 (2001).
- White, G. F. A method for obtaining infective nematode larvae from cultures. Science. 66, 302-303 (1927).
- Ciche, T. A., Ensign, J. C. For the insect pathogen Photorhabdus luminescens, which end of a nematode is out. Appl. Environ. Microbiol. 69, 1890-1897 (2003).
- Sicard, M., Brun, N. L. e Effect of native Xenorhabdus on the fitness of their Steinernema hosts: contrasting types of interaction. Parasitol. Res. 91, 520-524 (2003).
- Lambertsen, L., Sternberg, C., Molin, S. Mini-Tn7 transposons for site-specific tagging of bacteria with fluorescent proteins. Environ. Microbiol. 6, 726-732 (2004).
- Miller, W. G., Leveau, J. H., Lindow, S. E. Improved gfp and inaZ broad-host-range promoter-probe vectors. Mol. Plant Microbe Int. 13, 1243-1250 (2000).
- Teal, T. K., Lies, D. P., Wold, B. J., Newman, D. K. Spatiometabolic stratification of Shewanella oneidensis biofilms. Appl. Environ. Microbiol. 72, 7324-7330 (2006).
- Bao, Y., Lies, D. P., Fu, H., Roberts, G. P. An improved Tn7-based system for the single-copy insertion of cloned genes into chromosomes of Gram-negative bacteria. Gene. 109, 167-168 (1991).
- Woodring, J. L., Kaya, H. K. Steinernematid and Heterorhabditid Nematodes: A Handbook of Biology and Techniques. Southern Cooperative Series Bulletin 331. , Arkansas Agricultural Experiment Station. (1988).
