Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Visualisering Bakterier i Nematoder anvendelse af fluorescensmikroskopi

Published: October 19, 2012 doi: 10.3791/4298

Summary

For at undersøge mutualism mellem

Abstract

Symbioser, den leve sammen af ​​to eller flere organismer, er vidt udbredt i alle riger livet. Som to af de mest allestedsnærværende organismer på jorden, danner nematoder og bakterier en bred vifte af symbiotiske associationer, der spænder fra gavnlig for patogene 1-3. En sådan forening er det gensidigt fordelagtigt forhold mellem Xenorhabdus bakterier og Steinernema nematoder, der har vist sig som et modelsystem for symbiose 4. Steinernema nematoder er entomopatogen, ved hjælp af deres bakteriel symbiont at dræbe insekter 5. For transmission mellem insekt værter, kolonisere bakterierne i tarmen af nematoden er infektive juvenile fase 6-8. For nylig har adskillige andre nematodearter vist sig at udnytte bakterier til at dræbe insekter 9-13, og undersøgelser er begyndt at undersøge samspillet mellem de nematoder og bakterier i disse systemer <sup> 9.

Vi beskriver en fremgangsmåde til visualisering af en bakteriel symbiont inden for eller på en nematode vært, drage fordel af den optiske transparens af nematoder når de betragtes ved mikroskopi. Bakterierne er manipuleret til at udtrykke et fluorescerende protein, så deres visualisering ved fluorescensmikroskopi. Mange plasmider er tilgængelige, som bærer gener kodende for proteiner, der fluorescerer ved forskellige bølgelængder (dvs. grønt eller rødt), og konjugering af plasmider fra en donor Escherichia coli-stamme i en recipient bakteriel symbiont lykkes for en lang række bakterier. De beskrevne metoder blev udviklet til at undersøge sammenhængen mellem Steinernema carpocapsae og Xenorhabdus nematophila 14. Lignende fremgangsmåder er blevet anvendt til at undersøge andre nematode-bakterien sammenslutninger 9, 15-18 og fremgangsmåden derfor er generelt anvendelig.

The MetHod tillader karakterisering af bakteriel tilstedeværelse og lokalisering inden for nematoder på forskellige stadier af udvikling, der giver indsigt i karakteren af foreningen og processen med koloniseringen 14, 16, 19. Mikroskopisk analyse viser både kolonisering frekvens inden for en population og lokalisering af bakterier til værtsvæv 14, 16, 19-21. Dette er en fordel i forhold til andre metoder til overvågning bakterier i nematode befolkningsgrupper, såsom lydbehandling 22 eller formaling 23, som kan give de gennemsnitlige niveauer af kolonisering, men kan for eksempel ikke, diskriminere befolkninger med en høj frekvens af lav symbiont belastninger fra populationer med en lav frekvens af høje symbiont belastninger. Diskriminere frekvensen og belastningen af koloniserende bakterier kan være specielt vigtigt ved screening eller karakterisering af bakterielle mutanter for kolonisering fænotyper 21Af 24. Faktisk har fluorescensmikroskopi blevet anvendt i high-throughput screening af bakterielle mutanter for defekter i kolonisering 17, 18, ​​og er mindre arbejdskrævende end andre metoder, herunder sonikering 22, 25-27 og individuelle nematode dissektion 28, 29.

Protocol

1. Opførelse af et Fluorescerende bakteriestamme via Konjugering

  1. Grow modtageren stamme (symbiont der skal undersøges) og donorstammen natten over. Den donorstamme, sædvanligvis Escherichia coli, bør være i stand til at donere DNA gennem konjugation og skal transformeres med et plasmid (tabel 2), der bærer et gen kodende for et fluorescerende protein. Afhængigt af den plasmid, kan en konjugering hjælper-stamme også være påkrævet. I så fald bør denne stamme også dyrket natten over. Den donorstamme og hjælper-stamme bør dyrkes med antibiotika for at selektere for opretholdelse af plasmidet.
  2. Subkultur donor, hjælper og modtager stammer i næringsrige vækstmedier mangler antibiotika i et 1:100 forhold mellem kultur til medium.
  3. Vokser kulturerne ved en temperatur egnet for hver stamme, indtil de når mid-log fase vækst (OD600 ~ 0,6). For Xenorhabdus og E. coli dette stadium af vokseth nås tilnærmelsesvis 3-4 timer efter videredyrkning. Dette kan variere afhængigt af den stamme, eller i nogle tilfælde plasmidet, der anvendes.
  4. Bland stammerne i et mikrocentrifugerør og centrifugeres i 2 minutter ved 17.900 x g (13.000 opm i de fleste microfuges). Andelen af ​​donor og modtager, der giver de bedste resultater, vil variere for forskellige kombinationer, og muligvis bestemmes empirisk. For en Xenorhabdus recipient og E. coli donor, bruger vi en 3:1 eller 1:1. Hvis en hjælper-stamme er behov (fx E. coli), skal det tilsættes i samme forhold som donoren.
  5. Dekanteres.
  6. Resuspendere cellepelleten i 30 fil af frisk medium.
  7. Spot suspensionen på en næringsrige medier plade uden antibiotika, og lad stedet tørre.
  8. Inkubér pladen, inverteret, natten over ved en temperatur optimal for modtageren bakterien og tilladt for donor (og hjælper, hvis relevant). Pladen skalinkuberes i mindst 18 timer.
  9. Skrab op stedet og streak for enlige kolonier på en selektiv antibiotika plade. De antibiotika bør selektere mod donoren og til modtageren indeholder plasmidet. En eller to ekstra isolation striber kan være nødvendigt at isolere en ren kultur.
  10. Sikre de resulterende kolonier er modtageren symbiont, og ikke donor-stammen, ved screening for tilstedeværelsen af ​​modtagerens specifikke fænotyper, såsom kolonimorfologi, eller polymerasekædereaktion detektering af modtagerens-specifikke gener. Screene kolonier for tilstedeværelsen af ​​plasmidet ved polymerasekædereaktion af en kendt plasmidsekvens og fluorescens. Kolonierne bør fluorescere under det korrekte bølgelængde svarende til det fluorescerende protein.

2. Produktion af Axeniske Nematodeæggene

  1. Grow 5 ml af den naturlige bakterielle symbiont natten over. At starte en kultur, kan bakterier inokuleret i lysogeni Broth (LB) eller andre culture medier direkte fra en fryser lager eller fra en stribe plade.
  2. Spred 600 pi af bakteriekulturen på 10 mm Lipid agar (LA) plader 29. Otte til ti plader vil give nok nematoder for de fleste arter.
  3. Der inkuberes i mørke uden fugtighed ved 25 ° C i to dage.
  4. Læg 5000 infektive juvenile nematoder, eller for andre stadier afhængigt af den nematode, der anvendes, i 500 pi medie til de bakterielle græsplæner. Pladerne inkuberes ved 25 ° C i 3 dage.
  5. Tjek dine plader for tilstedeværelsen af ​​voksne nematoder og æg. Placer 20 ul vand på et objektglas. Anvendelse af en steril pind skrabe-up en lille mængde af nematoder fra det bakterielle plæne. Anbring stick i vand og lad nematoderne at svømme væk. Kig på din slide under lav forstørrelse. For mere information om udseende se diskussionen og figur 2.
  6. Hvis æg og hunner er synlige, skal du fortsætte, ellers inkuberes pladerne ved 25 & df. eks C og tjek for korrekt udvikling hver 6-12 timer. Når kvinder indeholder æg, placere nogle få ml vand på overfladen af ​​pladerne. Ryst forsigtigt pladerne og hælde vandet ind i et 50 ml konisk rør. Nematoder bør komme ud af pladerne og ikke længere være synlige på pladens overflade. Skylles flere gange kan være nødvendige.
  7. Tillad nematoderne for at sedimentere til bunden af ​​røret.
  8. Skyl nematoder. Pipetteres det overskydende vand fra toppen af ​​røret. Refill med rent vand og lad voksne nematoder at bosætte sig. Pipetteres det overskydende vand.
  9. Fyld de koniske rør med æg opløsning. Når æg tilsættes timingen af ​​alle trin med æg løsning skal fortsætte nøjagtigt som beskrevet for maksimal ægproduktion. Inkuber rørene mens forsigtigt at ryste for præcis 10 min. De fleste nematoder skal opløses i slutningen af ​​inkuberingen.
  10. Umiddelbart centrifugere koniske rør ved 1250 xgi præcis 10 min (dette omfatter bringe centrifugen op i fartmen ikke ned til 0 x g. Brug bremse).
  11. Umiddelbart dekanteres supernatanten.
  12. Umiddelbart resuspendere pelleten med æg løsning ved pipettering.
  13. Umiddelbart udfylde konisk rør med æg opløsning og bland godt ved at vende 3-5 gange. Derefter straks spinde som i 2,10.
  14. Umiddelbart dekanteres supernatanten.
  15. Resuspendere pelleten i LB ved pipettering, overføres til et 15 ml konisk rør til forbedret pelletering under vasketrinnene. LB er standard for Steinernema spp. Andre buffere (fx et minimalt saltmedium) kan anvendes afhængigt af nematode-og bakterie, under hensyntagen til den puffer må ikke skade enten nematoden eller bakterie.
  16. Fyld glasset med LB og spin som i 2,10.
  17. Dekanteres, og resuspender i LB.
  18. Skylle nematoder totalt 3 gange ved at gentage 2,14 og 2,15.
  19. Fortynd de re-suspenderede Nematodeæggene til et passende volumen. Der bør være mindst 10 æg pr mikroliter. Fxgs kan opbevares i en 6 cm petriskål i 5 ml LB i mindst fire dage ved tilsætning af antibiotika, som inhiberer vækst af koloniserende bakterier og indpakning af pladen i parafilm. Æggene vil skulle vaskes én gang i 15 ml LB (som i 2.13 og 2.14) forud for inokulering på bakterielle græsplæner. Bemærk, at klækkes æggene i dette tidsrum, og kan ikke synkroniseres udviklingsmæssigt når de anvendes i kolonisation assays.

3. Co-dyrkning Assay med Fluorescerende Bakterier

  1. Grow fluorescerende bakterier natten over, selektion for plasmidet om nødvendigt.
  2. Spred 600 pi af bakteriekulturen på 10 mm Lipid Agar plader med en steril pind. Inkuber ved 25 ° C i 2 dage.
  3. Sted 500-5.000 axeniske Nematodeæggene i alt 100-400 pi (optimalt 2000 nematoder i 200 ul) på hver lipid agarplade.
  4. Inkuber i mørke uden fugtighed ved 25 ° C, indtil IJs eller andre stadier af interesse, form. IJs vil være synlig som en fuzzy hvid ring på kanten af ​​pladen. At se på andre livsstadier henvises til protokol 4.
  5. Placere pladerne i en modificeret White trap 30. Fjern låget på lipid agarplade og placere bunden ind i bunden af ​​en tom 100 mm x 20 mm petriskål. Fyld store petriskål med vand eller en anden puffer egnet til nematode, at omgive den lille plade. Vandniveauet bør være omtrent halvdelen af ​​højden af ​​den lille plade.
  6. Inkuber vandudskilleren indtil afkom IJs er opstået i bufferen.
  7. Infektive juvenile nematoder kan opbevares i vand i en vævsdyrkningskolbe.

4. Indsamling af tidlige livsstadier til screening

  1. Brug skridt 3,1 gennem 3,4 til opsætning af analysen.
  2. Pladerne inkuberes, indtil den ønskede udviklingstrin er til stede. Daglig visuel inspektion kan være nødvendigt at bestemme timing. At inspicere pladerne, skal du bruge den procedure, der er beskrevet i protokol 2,5. For S. carpocapsae X. nematophila på LA-plader, bliver drægtige hunner være til stede i 4-5 dage, vil unge være til stede i 7 dage, og infektiøse unge vil begynde at blive produceret af 15-17 dage.
  3. Når de ønskede livsstadier er til stede, samle din prøve. Fyld en brønd i en plade med 96 brønde med 200 gl af PBS eller et andet egnet puffer. Forsigtigt skrabe nogle af de bakterielle græsplæne, der indeholder nematoder. En ært beløb (~ 50 mg) indeholder mindst flere hundrede nematoder når F1 afkom produceres, men mere kan være nødvendig for tidligere tidspunkter. Sæt pinden i brønden indeholdende buffer.
  4. Inkuber i 30 sekunder til et minut. Fjern stokken og skrabe den resterende rest. Bruge staven til at fjerne agar fra brønden. Nematoderne skal være synlige i bufferen. Flyt puffer blandingen til et rent mikrocentrifugerør.
  5. Behandl nematoderne med levamisol eller et andet lammende middel. Opløs et par korn af levamisol i 30 & mu, L vand. Tilføj 1-2 pi af dette mix for hver 50 ul prøve. Efter levamisol behandling nematoderne er ikke-levedygtige.
  6. Hvis prøverne vil ses senere, fastsættes som beskrevet i dette trin. Hvis ikke, gå til trin 4,6. Tilsæt 200 pi af fikseringsopløsning indeholdende 1X puffer og 4% paraformaldehyd. Bland forsigtigt, kan pipettering forårsage sarte livsstadier at lysere. Dæk med folie, og inkuber ved stuetemperatur på en ryster for lavt i mindst 18 timer.
  7. Anbring rørene i et rør rack, og tillade nematoderne for at sedimentere til bunden af ​​røret.
  8. Skylle nematoder for at fjerne baggrund. Afpipetteres overskydende væske og tilsæt 200 til 500 pi buffer og forsigtigt blandes. Gentag. Dette kan gentages et par gange for at fjerne mere baggrund om ønsket.
  9. Tillad nematoderne for at sedimentere til bunden af ​​røret og resuspender i det ønskede volumen.
  10. Hvis nematoder ikke er faste, skærm med det samme. Faste nematoder kan opbevares i køleskabet i optil to uger. Opbevares i mørke.

5. Screening Nematoder for bakteriel Association ved mikroskopi

  1. Vælg nogle nematoder at se under mikroskop ved at fjerne et lille udsnit af din blanding.
  2. For at sikre at nematoder stadig for billedet, behandle med et paralytisk middel som beskrevet i protokol 4.5. Hvis du ikke tager et billede eller nematoderne er allerede fast, kan dette trin springes over.
  3. Tilføj 20-30 ul nematoder i vand til din objektglas og læg et dækglas på toppen.
  4. Se hele nematoder under anvendelse af lysmikroskopi for at sikre nematoder er i synsfeltet.
  5. Vis nematoder ved hjælp af fluorescerende indstilling på mikroskop, der svarer til den fluorescens udtrykt af bakterierne.
  6. At identificere bakteriel lokalisering, tage billeder af nematoden under fluorescerende indstilling og en lysmikroskopi indstilling, og derefter overlejre billederne. De billeder skal være af samme field opfattelse. Det kan være nødvendigt at prøve flere forstørrelser og udsigt over nematode at finde bakterier.
  7. Fordelingen af ​​nematode kolonisering kan kvantificeres ved at tælle en population af nematoder, score for tilstedeværelsen eller fraværet af bakterier, og beregning af den procentvise koloniseret. Vi anbefaler at tælle før mindst 30 nematoder i befolkningen tælles i hver kategori (med eller uden kolonisering) for at opnå en pålidelig værdi.
  8. Når kun få nematoder hos befolkningen er koloniseret, kan det være nødvendigt at tælle flere tusinde nematoder inden den 30. overholdes. For high-throughput optælling bruge følgende trin.
  9. Stedet for at tælle nematoder enkeltvis aliquot befolkningen i en multi-brønds plade (fx en 24-brønds plade). Efter at nematoder har slået sig ned på bunden af ​​skålen, kan hver brønd skal scannes, på mikroskop, og antallet af koloniserede nematoder kan scores.
  10. Det samlede antal nematoder ina population kan identificeres ved seriefortyndinger af nematoder i brønden. Eksempelvis kan 1 ml nematoder sættes til en brønd, kan blandes godt ved omrøring med en pipettespids, og 3 ul blive fjernet og talt til kvantificering af den samlede befolkning i brønden.
  11. Procentdelen af ​​koloniserede nematoder kan opnås ved at dividere antallet koloniseret af det samlede antal nematoder i brønden.

6. Repræsentative resultater

Eksempel mikroskopbilleder af Steinernema nematoder associeret med Xenorhabdus-bakterier er vist i figur 3.. At skabe det sammensatte billede set i figur 3A, blev en fase kontrast billede overlejret med et fluorescerende billede. Pilen i Figur 3A viser de bakterier til stede i den infektiøse juvenile nematode (bar = 100 um). Figur 3B blev konstrueret på en lignende måde og viser en juvenil nematode with grønt fluorescerende protein mærkede bakterier (grønne stave) lokaliseret hele nematode intestinale lumen (bar = 20 pm). En population af nematoder fra to medier blev talt og bedømt for kolonisering af den bakterielle symbiont (tabel 1). For holdbare statistikker, er det bedst at tælle mindst 100 nematoder pr prøve med mindst 30 falder i hver kategori. Som det ses i tabel 1, er disse nematoder koloniseret i et niveau på ca 14,6% ved dyrkning på lipid agar og 68,6% ved dyrkning på leveren nyre agar. Andre nematoder og bakteriearter er blevet vist at have forskellige niveauer af kolonisering. For eksempel X. nematophila koloniserer 99% af S. carpocapsae infektive unge (Martens 2003), og P. luminescens koloniserer 26% af H. bacteriophora infektive unge (Ciche 2003).

Figur 1
Figur 1. Skematisk fremstilling af fremgangsmåden. A. Bakterien er manipuleret til at udtrykke et fluorescerende protein. B. Nematodeæggene isoleres fra voksne nematoder til fremstilling af sterile nematoder. C. sterile nematoder dyrkes sammen med fluorescerende bakterier. D. De resulterende livsstadier betragtes under en mikroskop at evaluere bakteriel tilstedeværelse i nematoden.

Figur 2
Figur 2. Skildring af voksne kvinder, der indeholder æg. A. Den skematiske viser den generelle udseende Steinernema hunner. Indsat: DIC billede af en S. feltiae drægtige hunner. Den sorte pil viser vulva. Hvide pile viser synlige æg. Billedet er ved 20X forstørrelse, og skalaen bjælke repræsenterer 100 um. B. DIC billede af et udviklet, men uklækkede S.feltiae nematode æg. Billedet er 40X forstørrelse, og skalaen bjælke repræsenterer 50 um. C. DIC billede af æg isoleret fra S. feltiae nematoder under 10X forstørrelse. Scale bar er 100 um.

Figur 3
Figur 3. Eksempel mikroskopbilleder af nematode-bakteriel forening. A. S. puntauvense nematoder var forbundet med deres bakterielle symbiont, X. bovienii, der udtrykker GFP. Billedet er et sammensat billede fremstillet ved at overlejre et fasekontrast billede med et fluorescerende billede fra den samme synsfelt. Pilen angiver fluorescerende bakterielle symbiont i nematoden vært. Scale søjle repræsenterer 100 um. B. Dette billede viser en S. carpocapsae juvenil nematode med GFP-udtrykkende X. nematophila lokaliseret i nematoden tarmen.Dette billede blev konstrueret gennem overlejring af et fluorescerende billede over en differentiel interferens kontrast billede. Den Målestokken repræsenterer 20 um.

Strain Antallet af nematoder med acteria Samlet Nematoder Tælles Procent af Nematoder olonized
S. puntauvense Lipid Agar 30 205 14,60%
S. puntauvense Lever Nyre Agar 72 105 68,60%

Tabel 1. Eksempel scoring af en nematode population for bakteriel tilstedeværelse. Ved dette forsøg axenisk S. puntauvense nematoder blev dyrket med deres GFP-udtrykkende symbiont på forskellige vækstmedier (lipid agar og lever-nyre agar 32) for at teste for kolonisering defekter. I alt mindst et hundred nematoder pr prøve blev talt og scoret for tilstedeværelse af bakterier. For statistisk styrke, replikater tre eksperimentelle skal tælles med mindst 30 nematoder falder ind under hver kategori.

Tabel 2
Tabel 2. Fluorescerende protein indeholdende plasmider. En liste over potentielle plasmider til insertion af et fluorescerende protein i bakterielle symbiont er givet angivet ved navn plasmid. Andre medtaget oplysninger er det fluorescerende protein kodet antibiotikum kassette bruges til plasmid vedligeholdelse, andre brugsanvisninger, kilden af ​​plasmidet. Den koncentration angivet i parentes er den koncentration af antibiotikum, der anvendes til X. nematophila. Hver af disse plasmider er blevet anvendt med succes i enten Xenorhabdus eller Photorhabdus. Yderligere oplysninger kan fås ved henvendelse til de angivne citater. Afhængigpå bakterien, der testes, kan nogle plasmider ikke arbejde baseret på det fluorescerende protein, antibiotisk selektion, indføringsstedet eller replikationsorigin. Plasmiderne anført ovenfor indeholde forskellige funktioner, der kan muliggøre brug i bakterie af interesse. For eksempel, mini-Tn7-KSGFP indsættes i den attTn7 sted af kromosomet mens pECM20 indsættes i den X. nematophila kromosomet ved homolog rekombination. Alternativt bliver pPROBE plasmider holdes ekstrakromosomalt, og hver pPROBE plasmid har samme rygraden og fluorophor, men har forskellige selekterbare markører eller replikationsstartområder for at muliggøre deres anvendelse i en række forskellige taksonomiske eller mutante baggrunde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollen beskrevet her tilvejebringer en fremgangsmåde til optisk påvisning af bakterier i en nematode host (fig. 1). Denne fremgangsmåde drager fordel af den optiske transparens af nematoder og evnen til fluorescerende mærke bakterier, muliggør in vivo-analyse af bakterier i nematode værten (fig. 3). Specifikt denne tilgang identificerer bakteriel lokalisering indenfor sin vært. Ved at tælle en nematode population og scoring for bakteriel tilstedeværelse, kan hyppigheden af bakteriel kolonisering over nematode population bestemmes (tabel 1). Denne metode er en af ​​mange mulige teknikker, som kan anvendes til undersøgelse af samspillet mellem nematode værter og bakterielle symbionter. Beslægtede fremgangsmåder er tidligere blevet beskrevet for at isolere det bakterielle symbiont, vokser nematoder axenisk, og manipulere begge partnere 25-27.

Protokollen beskrevet here blev udviklet i Xenorhabdus nematophila-Steinernema carpocapsae modelsystem 14, og lignende fremgangsmåder er blevet anvendt i andre insektspecifikke nematode-bakterielle foreninger 9,15,17,18. En række betingelser skal være opfyldt for at kunne anvende denne metode til andre nematode-bakterielle systemer. Det første skal den bakterielle symbiont kunne isoleres fra værten og dyrket uafhængigt i kultur. For det andet skal symbiont kunne optager DNA ved transformation eller konjugation for at indføre det fluorescerende protein. For det tredje, for de bedste resultater skal nematode have en fase, der kan gøres axenisk og genindføres i bakterier. Men selv om nematoden ikke kan isoleres fra de bakterier, kan det stadig være muligt at visualisere foreningen: I stedet for at tilsætte axeniske æg til plænen af ​​fluorescerende bakterier, tilføje en konventionelt hævet livsfase og fortsætte med protokollen som beskrevet. Alle resultater vil lide under det forbehold thi bakterier, der ikke udtrykker GFP vil konkurrere med GFP-udtrykkende bakterier for lokalisering til specifikke nematode væv, og på grund af dette bør kolonisering ikke måles ved mikroskopisk tælling. Med mindre de bakterier, der ikke udtrykker GFP drastisk udkonkurrere GFP-udtrykkende bakterier, bør GFP-udtrykkende bakterier lokalisere til nematode væv i det mindste i nogle dyr i befolkningen og foreslå vigtige vævssteder til bakteriekolonisering. En mangeårig advarsel for at anvende fluorescerende-protein-udtrykkende stammer er, at de kan kolonisere en vært med forskellig effektivitet end en stamme, der ikke udtrykker fluorescerende proteiner (fx 12).

Der er beskrevet i denne protokol kan kræve optimering afhængigt af nematoden og bakteriearter, der bliver brugt. Til konjugering af bakterien nogle betingelser, der kan ændres, er længden og temperaturen af ​​vækst, forholdet mellem donor til recipient, og plasmid anvendes. Eksempler på relevante plasmider er anført i tabel 2.. Alle disse plasmider er blevet anvendt med succes i enten Xenorhabdus eller Photorhabdus bakterier i forbindelse med deres nematode host 14,17,20,24,33-35. For at sikre stabil opretholdelse af det fluorescerende protein under nematode kolonisering er det bedst at anvende et plasmid, der indsættes i kromosomet af mål-bakterie. Endvidere kan nogle bakterier ikke optage disse plasmider. For eksempel har pECM20 kun blevet anvendt i X. nemtaophila og meget nært beslægtede bakteriestammer 14, fordi dette plasmid indsættes i kromosomet under anvendelse af en homolog region mellem plasmidet og kromosom, plasmid vil ikke indsætte hvis målet bakterien mangler denne region. At anvende dette plasmid til andre bakterier, til X. nematophila-specifik region skal være substitueret med en genomisk region fra mål-bakterie. Nogle plasmid-transformation ordninger vil også require visse ændringer af protokol 1. For eksempel 7-ΩGm-DsRed mini-Tn 7-KSGFP og pBK-miniTn kræver et hjælpe-plasmid indeholdende gennemførelse gener (tsnABCDE) 33,35,36 at indsætte i det bakterielle kromosom. Konjugering er mest effektiv med disse Tn 7-baserede plasmider, når 2-timers kulturer (~ OD600 fra 0,3 til 0,4) blandes i lige store forhold.

Efter vellykket konjugering er det vigtigt at anvende korrekte selektive plader svarende til det anvendte plasmid. De selektive plader bør indeholde antibiotikummet kodes på plasmidet at selektere for tilstedeværelsen af ​​plasmidet i recipienten og en mod-selektion mod donor-og hjælper-stammer. For eksempel, når konjugering pECM20 i X. nematophila den brugte mod-selektion er ampicillin fordi X. nematophila er ampicillinresistent og donorstammen er ampicillin sensitiv. Hvis antibiotika mod-selektion er ikke tilgængelig i yvores system, en diaminopimelinsyre (DAP), som kræver donor kan anvendes. At vokse DAP-kræver stammer, er DAP tilsættes til faste og flydende vækstmedier, i præ-konjugation og konjugering trin, og udelades under counter-valg etaper. Når DAP er fraværende donor-stammen vil ikke vokse, og er effektivt mod-valgte.

At sikre vellykket æg isolering er det vigtigt nøjagtigt at kontrollere for ægproduktion (figur 2). På tidspunktet for isolation bør kvindelige nematoder være fuld af æg og nogle æg skal være synlige i medierne (figur 2A). Hvis kvindelige nematoder producerer befrugtede æg i det mindste nogle supernatant æg vil være synligt udviklet som uklækkede nematoder (figur 2B). For S. carpocapsae, vil æggene skifte fra sfærisk til let aflange forud for udvikling af nematoder og udrugning. Timingen af ​​eller betingelserne for nematodevækst muligvis også ændres for at maksimere befrugtede ægudbytte, herunder forkortelse eller forlængelse af tidsrum før æg høst, eller ved hjælp af alternative medier egnede til de specifikke nematodeart. Ved afslutningen af isolationen bør æg er let synlige i puffer (figur 2C). Parametre i ægget isolation protokol, som kan kræve optimering omfatter blegemiddel og KOH-koncentrationer i ægget opløsning, inkubationstid i æg opløsning eller centrifugering hastighed. Hvis ægget isolation producerer æg, men ingen nematoder udvikles i løbet af co-dyrkning, er det muligt, at de isolerede æg er ikke-levedygtige. For at kontrollere for levedygtighed, lad de isolerede æg i buffer og vente på nematoder at klække. Æggene udklækkes inden for en eller to dage efter isolering og dernæst de juvenile nematoder kan anvendes i samdyrkning assay. Hvis æggene udklækkes, men ikke udvikler under samdyrkning assay, kan det være nødvendigt at ændre vækstbetingelserne eller medium anvendt til samdyrkning. Vi bemærker, at tidligere studies har isoleret bakteriefrit nematoder ved opblødning nematoderne i en antibiotisk cocktail (fx 3,37). Den fremgangsmåde vi beskriver her er fri for nogle af de forbehold af antibiotika iblødsætning, herunder komplikationer med anvendelse af bakteriostatisk antibiotika, antibiotikaresistente kontaminerende bakterier og antibiotiske virkninger for nematoder. Visse af nematoder kan også være resistente over for antibiotika og bevarer deres bakterielle symbionter 3. Endelig noterer vi, at for mikroskopi, kan koncentrationen af ​​levamisol nødvendig for nematode immobilisering variere med forskellige nematode grupperne.

Når denne fremgangsmåde er blevet etableret i systemet af interesse, er det muligt at ændre teknikken at udlede mere information. Ved at kigge på tidligere tidspunkter i nematode livscyklus (protokol nr. 4), kan man være i stand til at identificere, hvordan bakterien og nematode indlede deres forening 14,16. Desuden kan denne fremgangsmåde anvendes to gennemføre et højt gennemløb mutant skærme at identificere bakterielle faktorer involveret i den symbiose, ved hjælp af fluorescens at opdage kolonisering 17,18. Andre metoder, såsom signatur mærkede mutagenese kræver anvendelse af radioaktivt mærkede prober og er mere tidskrævende 22,28. Derfor er anvendelse af fluorescensmikroskopi for bakteriel symbiont visualisering i nematoder er en effektiv screening værktøj til undersøgelse bakterielle interaktioner med en nematode vært.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke Eugenio Vivas, Kurt Heungens, Eric Martens, Charles Cowles, Darby Sugar, Eric Stabb, og Todd Ciche for deres bidrag til udviklingen af ​​denne protokol, der bruges og værktøjer. KEM og JMC blev støttet af National Institutes of Health (NIH) National Research Service Award T32 (AI55397 "Mikrober i sundhed og sygdom"). JMC blev støttet af en National Science Foundation (NSF) Graduate Research Fellowship. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Science Foundation (IOS-0.920.631 og IOS-0.950.873).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lipid Agar
(sterile)
8 grams nutrient broth, 15 grams agar, 5 grams yeast extract, 890 ml water, 10 ml 0.2 g/ml MgCl2. 6H20, 96 ml corn syrup solution*, 4 ml corn oil*
Stir media while pouring plates
*add sterile ingredient after autoclaving
Corn Syrup Solution
(sterile)
7 ml corn syrup, 89 ml water
mix and autoclave
Egg Solution 16.6 ml 12% sodium hypochlorite, 5 ml 5M KOH, 80 ml water
Lysogeny Broth
(sterile)
5 grams yeast extract, 10 grams tryptone, 5 grams salt, 1 L water
mix and autoclave
Microfuge Fisher 13-100-675 Any microfuge that holds microfuge tubes will work
Centrifuge Beckman 366802 Large table top centrifuge that holds 15 ml and 50 ml conical tubes
Sterile 60 mm X 15 mm Petri Dish Fisher 0875713
50 ml centrifuge tubes Fisher 05-539-6
15 ml centrifuge tubes Fisher 05-531-6
Sterile 100 mm X 20 mm Petri Dish Fisher 0875711Z Deeper than standard Petri dishes
24-well plate Greiner Bio-One 662000-06
Microscope The microscope needs florescent capabilities compatible with your fluorophore
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710
PBS
(sterile)
8 g NaCL
0.2 g KCL
1.44 g Na2HPO4
0.24 g KH2PO4
1 L water

Adjust to a pH of 7.4 and water to 1 L and autoclave
Microfuge tubes Fisher 05-408-138 2 ml or 1.5 ml tubes
Shaker Any shaker that causes the liquid to gently move will work
Diaminopimelic acid Sigma D-1377 If needed, supplement media to a concentration or 1 mM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Holterman, M., van der Wurff, A. Phylum-wide analysis of SSU rDNA reveals deep phylogenetic relationships among nematodes and accelerated evolution toward crown clades. Mol. Biol. Evol. 23, 1792-1800 (2006).
  2. Lambshead, P. J. D., Boucher, G. Marine nematode deep-sea biodiversity - hyperdiverse or hype. J. Biogeogr. 30, 475-485 (2003).
  3. Poinar, G. O. J., Thomas, G. M. Significance of Achromobacter nematophilus Poinar and Thomas (Achromobacteraceae: Eubacteriales) in the development of the nematode, DD-136 (Neoaplectana sp. Steinernematidae). Parasitol. 56, 385-390 (1966).
  4. Herbert, E. E., Goodrich-Blair, H. Friend and foe: the two faces of Xenorhabdus nematophila. Nat. Rev. Microbiol. 5, 634-646 (2007).
  5. Kaya, H. K., Gaugler, R. Entomopathogenic nematodes. Annu. Rev. Entomol. 38, 181-206 (1993).
  6. Bird, A. F., Akhurst, R. J. The nature of the intestinal vesicle in nematodes of the family Steinernematidae. Int. J. Parasitol. 13, 599-606 (1983).
  7. Martens, E. C., Goodrich-Blair, H. The Steinernema carpocapsae intestinal vesicle contains a subcellular structure with which Xenorhabdus nematophila associates during colonization initiation. Cell. Microbiol. 7, 1723-1735 (2005).
  8. Snyder, H. A., Stock, S. P., Kim, S. K., Flores-Lara, Y., Forst, S. New insights into the colonization and release process of Xenorhabdus nematophila and the morphology and ultrastructure of the bacterial receptacle of its nematode host, Steinernema carpocapsae. Appl. Environ. Microbiol. 73, 5338-5346 (2007).
  9. Abebe, E., Abebe-Akele, F., Morrison, J., Cooper, V., Thomas, W. K. An insect pathogenic symbiosis between a Caenorhabditis and Serratia. Virulence. 2, 158-161 (2011).
  10. Abebe, E., Jumba, M. An entomopathogenic Caenorhabditis briggsae. J. Exp. Biol. 213, 3223-3229 (2010).
  11. Torres-Barragan, A., Suazo, A., Buhler, W. G., Cardoza, Y. J. Studies on the entomopathogenicity and bacterial associates of the nematode Oscheius carolinensis. Biol. Control. 59, 123-129 (2011).
  12. Ye, W. M., Torres-Barragan, A., Cardoza, Y. Oscheius carolinensis n. sp (Nematoda: Rhabditidae), a potential entomopathogenic nematode from vermicompost. Nematology. 12, 121-135 (2010).
  13. Zhang, C., Liu, J. Heterorhabditidoides chongmingensis gen. nov., sp. nov. (Rhabditida: Rhabditidae), a novel member of the entomopathogenic nematodes. J. Invertebr. Pathol. 98, 153-168 (2008).
  14. Martens, E. C., Heungens, K., Goodrich-Blair, H. Early colonization events in the mutualistic association between Steinernema carpocapsae nematodes and Xenorhabdus nematophila bacteria. J. Bacteriol. 185, 3147-3154 (2003).
  15. Ciche, T. A., Ensign, J. C. For the insect pathogen, Photorhabdus luminescens, which end of a nematode is out. Appl. Environ. Microbiol. 69, 1890-1897 (2003).
  16. Ciche, T. A., Kim, K. S., Kaufmann-Daszczuk, B., Nguyen, K. C., Hall, D. H. Cell invasion and matricide during Photorhabdus luminescens transmission by Heterorhabditis bacteriophora nematodes. Appl. Environ. Microbiol. 74, 2275-2287 (2008).
  17. Easom, C. A., Joyce, S. A., Clarke, D. J. Identification of genes involved in the mutualistic colonization of the nematode Heterorhabditis bacteriophora by the bacterium Photorhabdus luminescens. BMC Microbiol. 10, 45 (2010).
  18. Somvanshi, V. S., Kaufmann-Daszczuk, B., Kim, K. S., Mallon, S., Ciche, T. A. Photorhabdus phase variants express a novel fimbrial locus, mad, essential for symbiosis. Mol. Microbiol. 77, 1021-1038 (2010).
  19. Martens, E. C., Russell, F. M., Goodrich-Blair, H. Analysis of Xenorhabdus nematophila metabolic mutants yields insight into stages of Steinernema carpocapsae nematode intestinal colonization. Mol. Microbiol. 51, 28-45 (2005).
  20. Sugar, D. R., Murfin, K. E. Phenotypic variation and host interactions of Xenorhabdus bovienii SS-2004, the entomopathogenic symbiont of Steinernema jollieti nematodes. Env. Microbiol. 14, 924-939 (2012).
  21. Cowles, C. E., Goodrich-Blair, H. The Xenorhabdus nematophila nilABC genes confer the ability of Xenorhabdus spp. to colonize Steinernema carpocapsae nematodes. J. Bacteriol. 190, 4121-4128 (2008).
  22. Heungens, K., Cowles, C. E., Goodrich-Blair, H. Identification of Xenorhabdus nematophila genes required for mutualistic colonization of Steinernema carpocapsae nematodes. Mol. Microbiol. 45, 1337-1353 (2002).
  23. Goetsch, M., Owen, H., Goldman, B., Forst, S. Analysis of the PixA inclusion body protein of Xenorhabdus nematophila. J. Bacteriol. 188, 2706-2710 (2006).
  24. Bhasin, A., Chaston, J. M., Goodrich-Blair, H. Mutational Analyses Reveal Overall Topology and Functional Regions of NilB, a Bacterial Outer Membrane Protein Required for Host Association in a Model of Animal-Microbe Mutualism. J. Bacteriol. 194, 1763-1776 (2012).
  25. Ciche, T. A., Goffredi, S. K. Methods in General and Molecular Microbiology. Reddy, C. A. , ASM Press. 394-419 (2007).
  26. Goodrich-Blair, H., Clarke, D., Grewal, P. S., Ciche, T. A. Insect Pathogens, Molecular Approaches and Techniques. Stock, S. P., Boemare, N., Vandenberg, J., Glazar, I. , CABI Publishing. 239-269 (2009).
  27. Stock, S. P., Goodrich-Blair, H. Manual of Techniques in Invertebrate Pathology. Lacey, L. A. , Elsevier Press. 375-425 (2012).
  28. Martens, E. C., Gawronski-Salerno, J. Xenorhabdus nematophila requires an intact iscRSUA-hscBA-fdx locus to colonize Steinernema carpocapsae nematodes. J. Bacteriol. 185, 3678-3682 (2003).
  29. Vivas, E. I., Goodrich-Blair, H. Xenorhabdus nematophilus as a model for host-bacterium interactions: rpoS is necessary for mutualism with nematodes. J. Bacteriol. 183, 4687-4693 (2001).
  30. White, G. F. A method for obtaining infective nematode larvae from cultures. Science. 66, 302-303 (1927).
  31. Ciche, T. A., Ensign, J. C. For the insect pathogen Photorhabdus luminescens, which end of a nematode is out. Appl. Environ. Microbiol. 69, 1890-1897 (2003).
  32. Sicard, M., Brun, N. L. e Effect of native Xenorhabdus on the fitness of their Steinernema hosts: contrasting types of interaction. Parasitol. Res. 91, 520-524 (2003).
  33. Lambertsen, L., Sternberg, C., Molin, S. Mini-Tn7 transposons for site-specific tagging of bacteria with fluorescent proteins. Environ. Microbiol. 6, 726-732 (2004).
  34. Miller, W. G., Leveau, J. H., Lindow, S. E. Improved gfp and inaZ broad-host-range promoter-probe vectors. Mol. Plant Microbe Int. 13, 1243-1250 (2000).
  35. Teal, T. K., Lies, D. P., Wold, B. J., Newman, D. K. Spatiometabolic stratification of Shewanella oneidensis biofilms. Appl. Environ. Microbiol. 72, 7324-7330 (2006).
  36. Bao, Y., Lies, D. P., Fu, H., Roberts, G. P. An improved Tn7-based system for the single-copy insertion of cloned genes into chromosomes of Gram-negative bacteria. Gene. 109, 167-168 (1991).
  37. Woodring, J. L., Kaya, H. K. Steinernematid and Heterorhabditid Nematodes: A Handbook of Biology and Techniques. Southern Cooperative Series Bulletin 331. , Arkansas Agricultural Experiment Station. (1988).

Tags

Mikrobiologi Molecular Biology Bakteriologi Developmental Biology kolonisering, Symbiose nematode bakterier fluorescensmikroskopi
Visualisering Bakterier i Nematoder anvendelse af fluorescensmikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Murfin, K. E., Chaston, J.,More

Murfin, K. E., Chaston, J., Goodrich-Blair, H. Visualizing Bacteria in Nematodes using Fluorescent Microscopy. J. Vis. Exp. (68), e4298, doi:10.3791/4298 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter