Summary
Um die Mutualismus zwischen studieren
Abstract
Symbiosen, das Zusammenleben von zwei oder mehr Organismen sind in allen Reichen des Lebens verbreitet. Als zwei der am weitesten verbreiteten Organismen auf der Erde bilden Nematoden und Bakterien eine breite Palette von symbiotische Assoziationen, die von Vorteil für pathogene 1-3. Eine solche Vereinigung ist die gegenseitig vorteilhafte Beziehung zwischen Xenorhabdus Bakterien und Steinernema Nematoden, die als Modellsystem Symbiose 4 entstanden ist. Steinernema Nematoden sind entomopathogenen, indem sie ihre bakteriellen Symbionten zu töten Insekten 5. Für die Übertragung von Insekten Gastgeber, besiedeln die Bakterien im Darm der Nematoden der infektiösen jugendlichen Stadium 6-8. In jüngster Zeit haben mehrere andere Nematoden wurde gezeigt, dass Bakterien nutzen zu töten Insekten 9-13, und Untersuchungen haben begonnen Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen den Nematoden und Bakterien in diesen Systemen <sup> 9.
Wir beschreiben ein Verfahren zur Visualisierung eines bakteriellen Symbionten innerhalb oder auf einer Nematode Host, unter Ausnutzung der optischen Transparenz der Nematoden, wenn durch Mikroskopie angesehen. Die Bakterien werden konstruiert, um ein fluoreszierendes Protein exprimieren, wodurch deren Visualisierung durch Fluoreszenzmikroskopie. Viele Plasmide zur Verfügung, die für Proteine kodierenden Genen tragen, die bei verschiedenen Wellenlängen (dh grün oder rot), und die Konjugation von Plasmiden aus einer Escherichia coli Donor-Stamm in einen Empfänger bakteriellen Symbionten fluoreszieren erfolgreich ist für ein breites Spektrum von Bakterien. Die beschriebenen Methoden wurden entwickelt, um den Zusammenhang zwischen Steinernema carpocapsae und Xenorhabdus nematophila 14 zu untersuchen. Ähnliche Verfahren sind verwendet worden, um andere nematodeninduzierbares Bakterium Assoziationen 9, 15-18 untersuchen und der Ansatz ist deshalb allgemein anwendbar.
Der method ermöglicht die Charakterisierung von bakteriellen Präsenz und Lokalisierung innerhalb Nematoden in verschiedenen Stadien der Entwicklung, Einblicke in die Natur des Vereins und der Prozess der Kolonisierung 14, 16, 19. Mikroskopischen Analyse ergibt sowohl Kolonisierung Frequenz innerhalb einer Population von Bakterien und Lokalisierung von Geweben 14, 16, 19-21 hosten. Dies ist ein Vorteil gegenüber anderen Methoden zur Überwachung Bakterien innerhalb Nematodenpopulationen, wie Ultraschallbehandlung 22 oder Schleifen 23, die Durchschnittswerte der Besiedlung bestimmt, die aber nicht zum Beispiel diskriminieren Populationen mit einer hohen Frequenz von niedrigen Lasten aus symbiont Populationen mit eine niedrige Frequenz von hoher Symbionten Lasten. Unterscheiden der Frequenz und der Last besiedelnden Bakterien kann besonders wichtig bei der Durchmusterung oder Charakterisierung bakteriellen Mutanten zur Besiedelung Phänotypen 21, 24. Tatsächlich hat Fluoreszenzmikroskopie in Hochdurchsatzscreening von bakteriellen Mutanten für Defekte in Kolonisierung 17, 18 eingesetzt, und ist weniger aufwendig als andere Verfahren, einschließlich Ultraschallbehandlung 22, 25-27 und Nematoden einzelnen Dissektion 28, 29.
Protocol
Ein. Bau eines Fluorescent Bakterienstamm via Konjugation
- Wachsen die Rezipientenstamm (Symbionten untersucht werden) und Donorstamm Nacht. Die Donorstamm, üblicherweise Escherichia coli, sollte fähig sein abgebenden DNA durch Konjugation und sollte mit einem Plasmid transformiert werden (Tabelle 2), die ein Gen für ein fluoreszierendes Protein trägt. Abhängig von dem Plasmid kann ein Konjugation Helferstamm auch erforderlich sein. Wenn ja, sollte dieser Stamm auch über Nacht gezüchtet werden. Die Donorstamm und Helferstamm sollte mit Antibiotika gezüchtet werden, um für die Wartung des Plasmids ausgewählt.
- Subculture den Spender, Helfer und Empfänger Stämme in nährstoffreichen Nährmedien fehlt Antibiotika in einer 1:100-Verhältnis von Kultur bis mittel.
- Wachsen die Kulturen bei der geeigneten Temperatur für jeden Stamm, bis sie Mitte-log Wachstumsphase (OD 600 ~ 0,6) erreichen. Für Xenorhabdus und E. coli diese Stufe wachsenth etwa 3 bis 4 Stunden nach Subkultivierung erreicht. Dies kann je nach der Belastung, oder in einigen Fällen das Plasmid, verwendet.
- Mischen Sie die Stämme in einem Mikrozentrifugenröhrchen und Zentrifuge für 2 min bei 17.900 xg (13.000 rpm in den meisten microfuges). Der Anteil von Spender und Empfänger, die besten Ergebnisse liefert wird für verschiedene Kombinationen variieren und kann empirisch ermittelt werden. Empfänger für ein Xenorhabdus und E. coli Spender, verwenden wir ein 3:1 oder 1:1. Wenn ein Helfer-Stamm benötigt (zB E. coli), sollte er in dem gleichen Verhältnis wie dem Spender aufgenommen werden.
- Den Überstand umfüllen.
- Resuspendieren das Zellpellet in 30 ml frisches Medium.
- Finde die Suspension auf einer nährstoffreichen Medien Platte ohne Antibiotika, und lassen Sie den Ort, um zu trocknen.
- Inkubieren Sie die Platte, invertiert, über Nacht bei einer optimalen Temperatur für den Empfänger Bakterium und zulässig, dass der Spender (und Helfer, falls zutreffend). Die Platte sollteinkubiert mindestens 18 hr werden.
- Abkratzen der Stelle und streifenfrei für einzelne Kolonien auf einem selektiven Antibiotikum Platte. Die Antibiotika sollten gegen den Spender und den Empfänger mit dem Plasmid auszuwählen. Ein oder zwei zusätzliche Isolation Streifen kann notwendig sein, um eine reine Kultur zu isolieren.
- Sicherstellen, dass die resultierenden Kolonien sind der Empfänger Symbiont und nicht der Donorstamm, durch Screening auf die Gegenwart von empfängerspezifischen Phänotypen wie Koloniemorphologie oder Polymerasekettenreaktion Nachweis von Empfänger-spezifischen Genen. Screenen die Kolonien auf Anwesenheit des Plasmids durch Polymerasekettenreaktion eines bekannten Plasmidsequenz und Fluoreszenz. Die Kolonien sollte unter der richtigen Wellenlänge entsprechend dem fluoreszierenden Protein fluoreszieren.
2. Produktion von Axenische Nematodeneier
- Wachsen 5 ml der natürliche bakterielle Symbionten über Nacht. Um eine Kultur zu starten, können Bakterien in Lysogenie Broth (LB) oder andere cu geimpft werdenlture Medien direkt aus einem Gefrierschrank Lager oder aus einem Streifen Platte.
- Verteilt 600 ul der Bakterienkultur auf 10 mm Lipid Agar (LA) Platten 29. Acht bis zehn Platten erbringt genug Nematoden für die meisten Arten.
- Im Dunkeln ohne Feuchtigkeit bei 25 ° C für zwei Tage.
- Hinzufügen 5.000 infektiöse juvenile Nematoden oder anderen Stufen in Abhängigkeit von der Nematoden verwendet wird, in 500 ul Medium zu den Bakterienrasen. Die Inkubation erfolgt bei 25 ° C für 3 Tage.
- Überprüfen Sie Ihre Platten auf das Vorhandensein von adulte Nematoden und Eier. Platz 20 ul Wasser auf einen Objektträger. Verwendung einer sterilen Stick schaben-up eine geringe Menge an Nematoden aus der Bakterienrasen. Setzen Sie den Stick in das Wasser und damit die Nematoden zu schwimmen. Schauen Sie auf Ihre Folie unter geringer Vergrößerung. Für weitere Informationen über Aussehen siehe die Diskussion und Abbildung 2.
- Wenn Eier und Frauen sichtbar sind, weiter, andernfalls bebrüten die Platten bei 25 & dzB, C und für die richtige Entwicklung jedes 6-12 hr überprüfen. Wenn Weibchen Eier enthalten, legen Sie ein paar ml Wasser auf der Oberfläche der Platten. Vorsichtig schwenken die Platten und gießen das Wasser in einem 50 ml konischen Röhrchen. Nematoden kommen sollte weg von den Platten und nicht mehr auf der Plattenoberfläche sichtbar. Mehrere Spülungen erforderlich sein.
- Lassen Sie die Nematoden an den Boden des Röhrchens zu begleichen.
- Spülen Nematoden. Abpipettieren das überschüssige Wasser aus dem oberen Ende des Rohres. Refill mit sauberem Wasser ab und lassen adulte Nematoden zu begleichen. Pipettieren Sie das überschüssige Wasser.
- Füllen Sie die konische Röhrchen mit Ei Lösung. Sobald Ei zugegeben wird das Timing aller Schritte mit Ei Lösung muss gehen genauso vor wie für maximale Legeleistung beschrieben. Die Röhrchen unter leichtem Schütteln für genau 10 min. Meist Nematoden soll Ende der Inkubationszeit aufgelöst werden.
- Sofort zentrifugieren konische Röhrchen bei 1250 xg für genau 10 min (dies schließt bringen die Zentrifuge bis zu beschleunigenaber nicht auf 0 x g. Verwenden Sie die Bremse).
- Unmittelbar Dekantieren des Überstandes.
- Unmittelbar resuspendieren des Pellets mit Ei-Lösung durch Pipettieren.
- Sofort füllen konischen Rohr mit Ei-Lösung und gut mischen durch Invertieren 3-5 mal. Dann sofort in 2,10 spinnen.
- Unmittelbar Dekantieren des Überstandes.
- Resuspendieren des Pellets in LB durch Pipettieren, zu einem 15 ml konischen Röhrchen übertragen Pelletierung zur Verbesserung während der Waschschritte. LB ist Standard für Steinernema spp. Andere Puffer (zB eine minimale Salz-Medium) verwendet abhängig von der Nematoden und Bakterien, unter Berücksichtigung der Puffer muss nicht schaden entweder die Nematoden oder Bakterium werden.
- Füllen Sie das Rohr mit LB und Spin in 2,10.
- Den Überstand umfüllen und in LB erneut zu suspendieren.
- Spülen Sie die Nematoden insgesamt 3-mal durch Wiederholung 2,14 und 2,15.
- Verdünnen Sie die resuspendierten Nematodeneier auf eine angemessene Lautstärke. Es sollte mindestens 10 Eier pro Mikroliter sein. ZBgs in einer 6-cm-Petrischale in 5 ml LB für mindestens vier Tage durch Zugabe Antibiotika das Wachstum von Bakterien zu hemmen besiedelnder und Wickeln der Platte in Parafilm gespeichert. Die Eier müssen noch einmal in 15 ml LB (wie in 2.13 und 2.14) vor dem Impfen auf Bakterienrasen gewaschen werden. Beachten Sie, dass Eier werden während dieser Zeit schlüpfen und darf nicht entwicklungspolitisch synchronisiert werden, wenn bei der Kolonisation Assays verwendet.
3. Co-Kultivierung Assay mit fluoreszierenden Bakterien
- Wachsen fluoreszierenden Bakterien über Nacht, Auswählen für das Plasmid, falls nötig.
- Ausgebreitet 600 ul der Bakterienkultur auf 10 mm Lipid Agarplatten mit einer sterilen Stick. Inkubieren bei 25 ° C für 2 Tage.
- Ort 500-5000 axenischen Nematodeneier in einer Gesamtmenge von 100 bis 400 ul (2000 optimal Nematoden in 200 ul) auf jedes Lipid Agarplatte.
- Im Dunkeln ohne Feuchtigkeit bei 25 ° C bis IJs oder anderen Stufen des Interesses bilden. IJs sichtbar sein wird als fuzzy weißer Ring an der Kante der Platte. An anderen Lebensphasen betrachten, sehen Protocol 4.
- Platzieren der Platten in einer modifizierten Weiß Abscheiders 30. Entfernen Sie den Deckel der Lipid-Agar-Platte und legen Sie die unten in den Boden eines leeren 100 mm x 20 mm Petrischale. Füllen der großen Petrischale mit Wasser oder anderen geeigneten Puffer in einen Fadenwurm, zum Umgeben der kleinen Platte. Der Wasserstand sollte ungefähr die Hälfte der Höhe des Plättchens liegen.
- Inkubieren Sie die Wasserfalle, bis Nachkommen IJs in den Puffer entstanden.
- Infektiöser juveniler Nematoden in Wasser in einer Zellkulturflasche gespeichert werden.
4. Collection of Early Life Stages für Screening
- Verwenden Sie die Schritte 3.1 bis 3.4 zum Einrichten des Assays.
- Die Platten, bis die gewünschten Lebensphasen vorhanden sind. Täglich Sichtkontrolle notwendig sein, um Timing zu bestimmen. Um die Platten zu inspizieren, verwenden Sie das Verfahren in Protokoll 2.5 beschrieben. Für S. carpocapsae X. nematophila auf LA Platten, trächtige Weibchen anwesend sein in 4-5 Tagen werden Jugendliche vorhanden sein in 7 Tagen, und infektiöse Jugendliche startet durch 15-17 Tage hergestellt werden.
- Wenn die gewünschten Lebensphasen vorhanden sind, sammeln Sie Ihre Probe. Füllen Sie eine Vertiefung einer 96-Well-Platte mit 200 ul PBS oder andere geeignete Puffer. Vorsichtig abkratzen einige der Bakterienrasen die Nematoden enthält. Eine erbsengroße Menge (~ 50 mg) stellt mindestens mehrere hundert Nematoden einmal F1 Nachkommen produziert werden, aber mehr notwendig sein für frühere Zeitpunkte. Setzen Sie den Stick in den Brunnen haltigem Puffer.
- Inkubieren für 30 sec bis eine Minute. Entfernen Sie den Stick und abkratzen der verbleibende Rückstand. Verwenden Sie den Stick an einen Agar aus dem Bohrloch zu entfernen. Die Nematoden sichtbar sein soll innerhalb des Puffers. Bewegen Sie den Puffer-Gemisches zu einer sauberen Mikrozentrifugenröhrchen.
- Behandeln Sie die Nematoden mit Levamisol oder andere lähmende Agent. Lösen Sie ein paar Körner von Levamisol in 30 & mu; L Wasser. Fügen Sie 1-2 ul dieser Mischung für je 50 ul der Probe. Nach Levamisol Behandlung werden die Nematoden werden nicht lebensfähig.
- Wenn die Proben zu einem späteren Zeitpunkt angesehen werden, zu beheben, wie in diesem Schritt beschrieben. Wenn nicht, fahren Sie 4,6 fort. Fügen Sie 200 ul Fixierlösung mit 1X Puffer und 4% Paraformaldehyd. Vorsichtig mischen kann Pipettieren verursachen empfindliche Lebensphasen zu lysieren. Mit Folie abdecken und bei Raumtemperatur inkubieren auf einem Schüttler bei niedriger für mindestens 18 Stunden.
- Die Röhrchen in einer Röhrchenrahmen und erlauben die Nematoden um zum Boden des Röhrchens absetzen.
- Spülen Nematoden in den Hintergrund zu entfernen. Abpipettieren überschüssige Flüssigkeit und fügen Sie 200 bis 500 ul Puffer und vorsichtig mischen. Wiederholen. Dies kann wiederholt ein paar Mal mehr Hintergrund zu entfernen, falls gewünscht.
- Erlauben die Nematoden um zum Boden des Röhrchens absetzen und in der gewünschten Menge resuspendieren.
- Wenn die Nematoden sind nicht festgelegt, Bildschirm sofort. Feste Nematoden können im Kühlschrank bis gespeichert werdenbis zwei Wochen. Bewahren Sie in der Dunkelheit.
5. Screening Nematoden für bakterielle Vereinigung durch Mikroskopie
- Wählen Sie einige Nematoden unter dem Mikroskop, indem eine kleine Probe Ihrer Mischung zu sehen.
- Um sicherzustellen, dass die Nematoden noch für das Bild, mit einem Gelähmten Mittel gemäß Protokoll 4.5 beschrieben zu behandeln. Wenn Sie nicht teilnehmen ein Bild oder die Nematoden sind bereits fixiert, kann dieser Schritt übersprungen werden.
- Fügen 20-30 ul von Nematoden in Wasser, um Ihre Objektträger und legen Sie eine Deckglas an der Spitze.
- Erfahren gesamte Nematoden unter Verwendung von Lichtmikroskopie, um sicherzustellen, Nematoden im Sichtfeld.
- Erfahren Nematoden unter Verwendung des fluoreszierenden Einstellung am Mikroskop, das mit der Fluoreszenz von den Bakterien exprimiert entspricht.
- Um bakterielle Lokalisierung zu identifizieren, nehmen Fotos der Nematoden unter fluoreszierendem Einstellung und Lichtmikroskopie Einstellung, und dann überlagern die Bilder. Die Fotos müssen von der gleichen fiel seind betrachtet. Es kann notwendig sein, mehrere Vergrößerungen und Ansichten des Nematoden versuchen, die Bakterien zu finden.
- Die Verteilung der Nematode Kolonisierung kann durch Zählen einer Population von Nematoden, erziehlt auf die Anwesenheit oder Abwesenheit von Bakterien, und Berechnen der prozentuale kolonisiert quantifiziert werden. Wir empfehlen Zählen bis mindestens 30 Nematoden in der Bevölkerung in jeder Kategorie werden gezählt (mit oder ohne Kolonisation), um einen verlässlichen Wert zu erhalten.
- Wenn nur wenige Nematoden in der Bevölkerung besiedelt sind, kann es notwendig sein, mehrere tausend Nematoden zählen vor 30 beobachtet. Für High-Throughput-Zählen Sie die folgenden Schritte.
- Anstelle des Zählens Nematoden einzeln Aliquot die Population in eine Multi-Well-Platte (z. B. eine 24-Well-Platte). Nachdem die Nematoden dem Boden der Schale niedergelassen haben, kann jede Vertiefung auf dem Mikroskop gescannt werden und die Zahl der besiedelten Nematoden können erzielt.
- Die Gesamtzahl der Nematoden ina Bevölkerung kann durch serielle Verdünnungen von Nematoden im gut identifiziert werden. Zum Beispiel kann 1 ml von Nematoden hinzugefügt werden eine gut können gut vermischt unter Rühren mit einer Pipettenspitze und 3 ul entfernt und gezählt werden zur Quantifizierung der Gesamtbevölkerung in den Brunnen.
- Der Prozentsatz der kolonisiert Nematoden können, indem die Anzahl kolonisiert durch die Gesamtzahl von Nematoden im Bohrloch erhalten werden.
6. Repräsentative Ergebnisse
Beispiel Mikroskopbilder von Steinernema Nematoden mit Xenorhabdus Bakterien zusammenhängen, sind in Abbildung 3 dargestellt. Um das zusammengesetzte Bild in 3A gesehen zu erzeugen, wurde eine Phase Kontrastbild mit einer fluoreszierenden Bild überlagert. Der Pfeil in 3A zeigt die Bakterien innerhalb des infektiösen juvenilen Nematoden (bar = 100 um). 3B wurde in ähnlicher Weise aufgebaut und stellt einen juvenilen Nematoden with grün fluoreszierende Protein markierten Bakterien (grün Stangen) in den Nematoden Darmlumen (bar = 20 um) lokalisiert. Eine Population von den Nematoden aus beiden Medien wurden gezählt und erzielte für die Besiedlung durch die bakterielle Symbionten (Tabelle 1). Für robuste Statistik, ist es am besten mindestens 100 Nematoden pro Probe mit mindestens 30 fallen in jeder Kategorie zu zählen. Wie in Tabelle 1 ersichtlich ist, sind diese Nematoden bei einem Gehalt von ca. 14,6% kolonisiert, wenn am Lipid Agar und 68,6% gewachsen, wenn auf Leber Niere Agar gezüchtet. Nematoden und anderen Bakterienspezies ist gezeigt worden, um verschiedene Kolonisierung haben. Zum Beispiel X. nematophila besiedelt 99% der S. carpocapsae infektiöse Jugendliche (Martens 2003) und P. luminescens besiedelt 26% der H. bacteriophora infektiöse Jugendliche (Ciche 2003).
Abbildung 1. Schematische Darstellung des Verfahrens. A. Das Bakterium wurde entwickelt, um ein fluoreszierendes Protein exprimieren. B. Nematode Eier aus adulten Nematoden isoliert sind, um sterile Nematoden zu produzieren. C. Die sterilen Nematoden mit den fluoreszierenden Bakterien co-kultiviert. D. Die daraus resultierenden Lebensphasen unter a angesehen Mikroskop zu beurteilen bakterielle Präsenz in der Nematoden.
Abbildung 2. Darstellung der erwachsenen Weibchen die Eier enthalten. A. Das Schema zeigt das allgemeine Aussehen der Steinernema Weibchen. Einschub: DIC Bild einer S. feltiae trächtig weiblich. Der schwarze Pfeil zeigt die Vulva. Weiße Pfeile sichtbare Eier. Das Bild ist bei 20-facher Vergrößerung und der Maßstab entspricht 100 um. B. DIC Bild eines entwickelt, aber nicht geschlüpften S.feltiae Nematoden Ei. Das Bild ist 40-facher Vergrößerung und der Maßstab entspricht 50 um. C. DIC Bild von Eiern isoliert von S. feltiae Nematoden unter 10facher Vergrößerung. Maßstab ist 100 um.
Abbildung 3. Beispiel mikroskopische Aufnahmen von Nematoden-bakterielle Vereins. A. S. puntauvense Nematoden wurden mit ihren bakteriellen Symbionten, X. verbunden bovienii, GFP. Das Bild ist ein zusammengesetztes Bild durch Überlagerung eine Phase kontrastreiches Bild mit einem fluoreszierenden Bild aus dem gleichen Sichtfeld erzeugt. Der Pfeil zeigt die fluoreszierende bakteriellen Symbionten innerhalb des Fadenwurms Host. Maßstab entspricht 100 um. B. Dieses Bild zeigt ein S. carpocapsae juvenile Nematoden mit GFP-exprimierenden X. nematophila innerhalb der Nematoden Darm lokalisiert.Dieses Bild wurde durch Überlagerung ein fluoreszierendes Bild über einen Differential-Interferenz-Kontrast Bild konstruiert. Der Maßstab entspricht 20 um.
| Belasten | Anzahl von Nematoden mit acteria | Insgesamt Nematoden gezählt | Prozent der Nematoden olonized |
| S. puntauvense Lipid Agar | 30 | 205 | 14,60% |
| S. puntauvense Leber Nieren Agar | 72 | 105 | 68,60% |
Tabelle 1. Beispiel Scoring eines Nematoden Population für bakterielle Präsenz. In diesem Experiment axenischen S. puntauvense Nematoden wurden mit ihren GFP-exprimierenden Symbionten auf verschiedenen Nährmedien (Lipid-Agar und Leber-Nieren-Agar 32), um für die Besiedlung Mängel testen gewachsen. Eine Gesamtzahl von mindestens einem hundred Nematoden pro Probe gezählt wurden, und auf die Anwesenheit von Bakterien hat. Für statistische Power, repliziert drei experimentellen sollte mit mindestens 30 Nematoden fallen in jeder Kategorie gezählt werden.
Tabelle 2. Fluoreszenzprotein Plasmide enthielten. Eine Liste potentieller Plasmide zum Einsetzen eines fluoreszierenden Proteins in das bakterielle Symbionten gegeben aufgeführten nach Name des Plasmids. Andere Informationen enthalten sind das fluoreszierende Protein codiert, Antibiotikum Kassette für Plasmiderhaltung verwendet, andere Gebrauchsanweisungen, die Quelle des Plasmids. Die Konzentration in Klammern vermerkt ist die Konzentration des Antibiotikums für X verwendet nematophila. Jedes dieser Plasmide wurde erfolgreich in entweder Xenorhabdus oder Photorhabdus verwendet. Weitere Informationen können aus den angegebenen Zitaten erhalten werden. Abhängigauf das Bakterium getestet, können einige Plasmide nicht auf der Grundlage des fluoreszierenden Proteins, Antibiotika-Selektion, Insertionsstelle bzw. Replikationsursprung arbeiten. Die Plasmide oben aufgeführten enthalten verschiedene Funktionen, die den Einsatz in dem Bakterium von Interesse zu ermöglichen. Beispielsweise Mini-Tn7-KSGFP Einsätze in das attTn7 Stelle des Chromosoms, während pECM20 Einsätze in das X. nematophila Chromosom durch homologe Rekombination. Alternativ werden die Plasmide pPROBE extrachromosomal, gewartet und jedes pPROBE Plasmid hat die gleiche Grundgerüst und Fluorophor aber unterschiedliche Selektionsmarker oder Replikationsursprünge ihre Verwendung in einer Vielzahl von taxonomischen oder Mutante Hintergründen zu ermöglichen.
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Discussion
Die hier beschriebene Protokoll stellt ein Verfahren zur optischen Detektion von Bakterien in einer Nematode Host (Abbildung 1). Diese Methode nutzt die optische Transparenz von Nematoden und die Fähigkeit zur Fluoreszenz-Label Bakterien, mit der in vivo-Analyse von Bakterien innerhalb des Nematoden Host (Abbildung 3). Insbesondere, identifiziert dieser Ansatz bakteriellen Lokalisation innerhalb seines Wirtes. Durch Zählen einer Nematoden Bevölkerung und Scoring für bakterielle Präsenz, kann die Häufigkeit der bakteriellen Besiedelung über die Nematoden Bevölkerung bestimmt (Tabelle 1). Dieses Verfahren ist eine von vielen möglichen Techniken, die zur Untersuchung der Interaktionen zwischen Hosts und Nematoden bakteriellen Symbionten ausgenutzt werden kann. Ähnliche Methoden wurden bisher die bakteriellen Symbionten zu isolieren, wachsen Nematoden axenisch und bearbeiten beide Partner 25-27 beschrieben.
Das Protokoll beschriebenen here wurde im Xenorhabdus nematophila-Steinernema carpocapsae Modellsystem 14 entwickelt, und ähnliche Ansätze in anderen entomopathogenen Nematoden bakteriellen Assoziationen 9,15,17,18 benutzt worden. Mehrere Bedingungen müssen erfüllt sein, um diese Methode auf andere Nematoden-bakterielle Systeme anzuwenden. Erstens muss das bakterielle Symbionten können vom Host isoliert und gezüchtet werden unabhängig in Kultur. Zweitens muss die Symbionten in der Lage sein zu nehmen DNA durch Transformation oder Konjugation, um das fluoreszierende Protein einzuführen. Drittens, für die besten Ergebnisse, muss der Nematoden eine Bühne, die gemacht axenischen und wieder in Bakterien werden können. Jedoch selbst wenn der Nematode nicht aus den Bakterien isoliert werden könnte es immer noch möglich sein, um die Assoziation visualisieren: anstelle der Zugabe axenischen Eier auf den Rasen von fluoreszierenden Bakterien, einen herkömmlich angehobenen Lebensstadium und fortfahren mit dem Protokoll, wie beschrieben. Alle Ergebnisse werden von dem Vorbehalt th leidenan Bakterien, die nicht ausdrücklich GFP kann mit GFP-exprimierenden Bakterien zur Lokalisierung auf spezifische Gewebe Nematoden konkurrieren, und aus diesem Grund sollten nicht Kolonisierung durch mikroskopische Auszählung gemessen werden. Solange jedoch die Bakterien, die kein GFP exprimieren drastisch outcompete GFP-exprimierenden Bakterien, GFP-exprimierende Bakterien sollten Nematoden Geweben lokalisiert in zumindest einigen Tieren in der Population und schlagen wichtige Gewebestellen für bakterielle Kolonisation. Ein langjähriger Einschränkung der Verwendung von fluoreszierenden Protein-exprimierenden Stämmen ist, dass sie eine Vielzahl unterschiedlicher Effizienz als ein Stamm, der nicht exprimiert fluoreszierende Proteine (zB 12) zu kolonisieren.
Schritte in diesem Protokoll beschriebenen erfordern die Optimierung je nach Nematoden und Bakterien-Spezies, die verwendet werden. Zur Konjugation des Bakteriums einige Bedingungen, die verändert werden können, sind die Länge und die Temperatur des Wachstums, das Verhältnis von Spender zum Empfänger, und plasmid verwendet. Beispiele relevanter Plasmide sind in Tabelle 2 aufgeführt. Alle diese Plasmide wurden erfolgreich in entweder Xenorhabdus oder Photorhabdus Bakterien in Verbindung mit deren Nematoden Host 14,17,20,24,33-35 verwendet. Um stabile Aufrechterhaltung des fluoreszierenden Proteins während Nematoden Kolonisierung gewährleisten, ist es am besten, einen Plasmid, in das Chromosom des Zielbakterium einzufügen verwenden wird. Ferner können bestimmte Bakterien nicht nehmen diese Plasmide. Zum Beispiel hat pECM20 nur in X. verwendet worden nemtaophila und sehr eng verwandt Bakterienstämme 14, weil diese Plasmid-Einsätze in das Chromosom mit einer homologen Bereich zwischen dem Plasmid und Chromosom; das Plasmid nicht eingefügt werden, wenn das Ziel Bakterium fehlt diese Region. Um dieses Plasmid für andere Bakterien, die X verwenden nematophila-spezifischen Region muss mit einer genomischen Region vom Zielbakterium substituiert sein. Einige Plasmid-Transformation Systeme wird auch rEquire bestimmte Änderungen aus dem Protokoll 1. Beispielsweise Mini-Tn 7-KSGFP und pBK-7-miniTn ΩGm-DsRed erfordern einen Helferplasmid enthaltenden Umsetzung Gene (tsnABCDE) 33,35,36 in das bakterielle Chromosom einzufügen. Konjugation ist am effizientesten mit diesen Tn 7-basierte Plasmide, wenn man 2-Stunden-Kulturen (~ 0,3 bis 0,4 OD 600) in gleichen Verhältnissen gemischt werden.
Nach erfolgreicher Konjugation ist es wichtig, korrekte selektiven Platten entsprechend dem Plasmid verwendet nutzen. Die selektiven Platten sollte das Antibiotikum auf dem Plasmid kodiert wird, um das Vorhandensein des Plasmids in den Empfänger und einem Zähler-Selektion gegen den Donor-und Helper-Stämme auszuwählen. Wenn zum Beispiel das Konjugieren pECM20 in X. nematophila der Zähler-Auswahl verwendet wird, Ampicillin, weil X. nematophila ist Ampicillin-resistente und der Spender Stamm Ampicillin empfindlich. Wenn Antibiotika Gegenselektion nicht verfügbar ist yunserem System, ein Diaminopimelinsäure (DAP) erfordern Donor verwendet werden. Wachsen DAP-erfordernde Stämme wird DAP zum festen und flüssigen Nährmedien während der Vor-Konjugation und Konjugation Schritte hinzugefügt, weggelassen und während Gegenselektion Stufen. Wenn DAP fehlt ist die Donorstamm wird nicht wachsen und effektiv entgegen ausgewählten.
Um eine erfolgreiche Ei-Isolation zu gewährleisten ist es wichtig, genau für die Eiererzeugung (Abbildung 2) zu überprüfen. Zum Zeitpunkt der Trennung, sollte weiblichen Nematoden voller Eier und ein paar Eier sollten sichtbar sein in den Medien (Abbildung 2A). Wenn weibliche Nematoden produzieren befruchtete Eier zumindest einige Überstand Eier werden sichtbar als unhatched Nematoden (2B) entwickelt haben. Für S. carpocapsae, werden die Eier von sphärischen ändern leicht vor der Entwicklung Nematoden und Schraffuren länglich. Der Zeitpunkt und Bedingungen der Nematoden das Wachstum möglicherweise auch geändert werden, um befruchtete Eizelle zu maximierenergeben, einschließlich Verkürzung oder Verlängerung des Zeitraums vor Ei Ernte, oder mit einem alternativen Medium auf die besonderen Gegebenheiten Nematodenarten. Am Ende der Isolierung sollten Eier gut sichtbar in dem Puffer (2C). Parameter im Ei isoliert Protokoll, das die Optimierung erfordern, gehören Bleich-und KOH-Konzentrationen in der Ei-Lösung, Inkubationszeit in Ei-Lösung oder Zentrifugation Geschwindigkeit. Wenn das Ei Isolation erzeugt aber keine Eier Nematoden entwickeln während der Co-Kultivierung ist es möglich, dass die isolierten Eier nicht lebensfähig sind. Um für die Lebensfähigkeit zu überprüfen, lassen Sie die isolierte Eier in Puffer und warten Nematoden zu schlüpfen. Die Eier sollten in ein oder zwei Tagen der Isolation schlüpfen und dann die juvenile Nematoden in der Co-Kultivierung Assay verwendet werden. Wenn die Eier schlüpfen, aber nicht während der Cokultivierung Assay zu entwickeln, kann es erforderlich sein, um die Wachstumsbedingungen oder Medium für Cokultivierung verwendet ändern. Wir stellen fest, dass bei der bisherigen studies haben Bakterien-freie Nematoden durch Einweichen die Nematoden in einem Antibiotikum Cocktail (zB 3,37) isoliert. Der Ansatz beschreiben wir hier frei von einige der Einschränkungen des Antibiotikums Einweichen, einschließlich Komplikationen bei der Verwendung bakteriostatische Antibiotika, Antibiotika-resistenten kontaminierenden Bakterien, und antibiotische Wirkungen auf die Nematoden. Bestimmte Phasen der Nematoden können auch resistent gegen Antibiotika und behalten ihre bakteriellen Symbionten 3. Schließlich stellen wir fest, dass für die Mikroskopie, die Konzentration von Levamisol notwendig Nematoden Immobilisierung kann mit verschiedenen Nematoden clades variieren.
Sobald dieses Verfahren in dem System von Interesse festgestellt, ist es möglich, die Technik zu ändern, um mehr Informationen abzuleiten. Dazu suchen Sie in früheren Zeitpunkten in dem Fadenwurm Lebenszyklus (Protokoll Nr. 4), kann man in der Lage sein zu erkennen, wie das Bakterium und Nematoden ihre Assoziation 14,16 initiieren. Darüber hinaus kann dieser Ansatz verwendet werden to Durchführung einen hohen Durchsatz mutierten Bildschirme bakteriellen Faktoren in der Symbiose beteiligt sind, mittels Fluoreszenz zur Besiedlung 17,18 zu erkennen. Andere Verfahren wie Signatur markiert Mutagenese erfordern die Verwendung von radioaktiv markierten Sonden und sind zeitaufwendig 22,28. Daher ist der Einsatz von Fluoreszenzmikroskopie für bakterielle Symbionten Visualisierung in Nematoden ein effektives und effizientes Screening-Werkzeug zur Untersuchung von Wechselwirkungen mit einem bakteriellen Nematoden-Host.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Die Autoren möchten sich Eugenio Vivas, Kurt Heungens, Eric Martens, Charles Cowles, Darby Sugar, Eric Stabb und Todd Ciche für ihre Beiträge danken für die Entwicklung dieses Protokolls und Werkzeuge verwendet. KEM und JMC wurden von den National Institutes of Health (NIH) National Research Service Award T32 (AI55397 "Mikroben in Health and Disease") unterstützt. JMC wurde von der National Science Foundation (NSF) Graduate Research Fellowship unterstützt. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem National Science Foundation (IOS-0.920.631 und IOS-0950873) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipid Agar (sterile) |
8 grams nutrient broth, 15 grams agar, 5 grams yeast extract, 890 ml water, 10 ml 0.2 g/ml MgCl2. 6H20, 96 ml corn syrup solution*, 4 ml corn oil* Stir media while pouring plates *add sterile ingredient after autoclaving |
||
| Corn Syrup Solution (sterile) |
7 ml corn syrup, 89 ml water mix and autoclave |
||
| Egg Solution | 16.6 ml 12% sodium hypochlorite, 5 ml 5M KOH, 80 ml water | ||
| Lysogeny Broth (sterile) |
5 grams yeast extract, 10 grams tryptone, 5 grams salt, 1 L water mix and autoclave |
||
| Microfuge | Fisher | 13-100-675 | Any microfuge that holds microfuge tubes will work |
| Centrifuge | Beckman | 366802 | Large table top centrifuge that holds 15 ml and 50 ml conical tubes |
| Sterile 60 mm X 15 mm Petri Dish | Fisher | 0875713 | |
| 50 ml centrifuge tubes | Fisher | 05-539-6 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Fisher | 05-531-6 | |
| Sterile 100 mm X 20 mm Petri Dish | Fisher | 0875711Z | Deeper than standard Petri dishes |
| 24-well plate | Greiner Bio-One | 662000-06 | |
| Microscope | The microscope needs florescent capabilities compatible with your fluorophore | ||
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| PBS (sterile) |
8 g NaCL 0.2 g KCL 1.44 g Na2HPO4 0.24 g KH2PO4 1 L water Adjust to a pH of 7.4 and water to 1 L and autoclave |
||
| Microfuge tubes | Fisher | 05-408-138 | 2 ml or 1.5 ml tubes |
| Shaker | Any shaker that causes the liquid to gently move will work | ||
| Diaminopimelic acid | Sigma | D-1377 | If needed, supplement media to a concentration or 1 mM |
References
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