Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Floresan Mikroskobu kullanılarak Nematodlar Bakteriler görselleştirme

Published: October 19, 2012 doi: 10.3791/4298
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Bacteriology, University of Wisconsin-Madison

Summary

Arasındaki karşılıkçılık incelenmesi

Abstract

Symbioses, iki veya daha fazla organizmaların birlikte yaşama, yaşamın tüm krallıkları boyunca yaygındır. Dünyanın en her yerde organizmaların iki olarak, nematod ve bakteri bu aralıktaki faydalıdır 1-3 patojenik simbiyotik dernekleri geniş bir dizi oluşturur. Böyle bir dernek Xenorhabdus bakteri ve sembiyoz 4 bir model sistem olarak ortaya çıkmıştır Steinernema nematodlar arasındaki karşılıklı ilişkinin olduğunu. Steinernema nematod böcekler 5 öldürmek için onların bakteriyel symbiont kullanarak, entomopatojen vardır. Böcek bilgisayarlar arasında iletimi için, bakteri nematod en infektif juvenil evre 6-8 bağırsak kolonize. Son zamanlarda, birkaç diğer nematod türlerinin böcekler 9-13 öldürmek bakteri kullanmak gösterilmiştir ve araştırmalar bu sistemlerde nematodlar ve bakteriler arasındaki etkileşimleri inceleyerek başladık <> 9 sup.

Biz mikroskobu ile izlendi nematodların optik şeffaflık yararlanarak, içinde veya bir nematod konak üzerindeki bir bakteriyel symbiont görselleştirme için bir yöntem açıklanmaktadır. Bakteriler floresan mikroskobu kendi görselleştirme sağlayan bir floresan proteini ifade için tasarlanmıştır. Birçok plazmidler farklı dalga boyları (yani yeşil veya kırmızı) ve bir alıcı bakteri symbiont içine bir bağış Escherichia coli suşundan plazmidlerin konjugasyon az floresan proteinleri kodlayan genlerin bakterilerin geniş bir yelpazede için başarılı taşıdıkları mevcuttur. Açıklanan yöntemler Steinernema carpocapsae ve Xenorhabdus nematophila 14 arasındaki ilişkiyi araştırmak amacıyla geliştirilmiştir. Benzer yöntemler diğer nematod-bakteri dernekler 9, 15-18 araştırmak için kullanılan ve yaklaşım bu nedenle genellikle uygulanabilir edilmiştir.

Method dernek ve kolonizasyon 14, 16, 19 sürecinin doğasını içgörü sağlayarak, farklı gelişim aşamalarında nematodlar içinde bakteriyel varlığı ve lokalizasyonu karakterizasyonu sağlar. Mikroskopik analiz dokular 14, 16, 19-21 barındırmak için bir bakteri nüfusu ve yerelleştirme içinde kolonizasyon sıklığı açısından ortaya koymaktadır. Bu, örneğin sonikasyon 22 veya kolonizasyon ortalama seviyesi sağlayabilir 23, öğütme gibi nematod popülasyonlarının içinde bakteri izlenmesi başka yöntemlere göre büyük bir avantaj, fakat, örneğin, popülasyonlarından düşük symbiont yüklerinin bir yüksek frekans ile popülasyonlar ayırt olmayabilir Yüksek symbiont yükleri düşük frekans. Kolonizasyon fenotipleri 21 bakteriyel mutantların tarama veya karakterize ederken frekans ve kolonize bakteri yükü farklılaştırması özellikle önemli olabilir, 24. Gerçekten de, floresan mikroskobu kolonizasyon, 17, 18 kusurlar için bakteriyel mutant yüksek verimli tarama teknikleri kullanılmaktadır ve sonikasyon 22, 25-27 ve bireysel nematod disseksiyon 28, 29 de dahil olmak üzere diğer yöntemler, daha az zahmetli bir iştir edilmiştir.

Protocol

1. Konjugasyon üzeri Floresan Bakteriyel Gerinim İnşaat

  1. Alıcı suşu (symbiont irdelenmesine) ve donör zorlanma gecede büyümek. Verici gerilme, genellikle Escherichia coli, birleşme yoluyla DNA verici yeteneğine sahip olmalıdır ve transforme edilmesi gereken bir floresan proteini kodlayan bir gen taşır, (Tablo 2) plazmid. Plazmid bağlı olarak, bir birleşme yardımcı yük de gerekli olabilir. Eğer öyleyse, bu gerginlik de gecede yetiştirilmelidir. Donör strain ve strain yardımcı plazmid bakımı için seçmek için antibiyotik ile yetiştirilmelidir.
  2. Orta kültür 1:100 oranında antibiyotik eksik besin açısından zengin büyüme ortamı içine donör, yardımcı ve alıcı suşlar altkültür.
  3. Onlar orta-log aşamalı büyüme (OD 600 ~ 0.6) ulaşana kadar her bir suş için uygun sıcaklıkta kültürleri büyütün. Xenorhabdus ve E. için Bu aşamada büyümek coliTh alt kültür sonra yaklaşık olarak 3-4 saat ulaşılır. Bu gerilme bağlı olarak değişebilir, veya bazı durumlarda da plazmid, kullanılmış olabilir.
  4. Bir mikrosantrifüj tüp ve 17,900 xg (çoğu mikrofüjler 13.000 rpm) 2 dakika süreyle santrifüj suşları karıştırın. En iyi sonuçlar verir donör ve alıcı oranı farklı kombinasyonlar için değişir ve ampirik olarak tespit edilmesi gerekebilir. Bir Xenorhabdus alıcı ve E. için coli donör, bir 3:1 veya 1:1 oranında kullanın. Bir yardımcı suşu (örneğin, E. coli) gerekli ise, bu verici olarak aynı oranda ilave edilmelidir.
  5. Süpernatant süzün.
  6. Taze medya 30 ul hücre pelletini yeniden askıya.
  7. Herhangi bir antibiyotik olmadan bir besin zengin medya plaka üzerine süspansiyon Nokta ve spot kurumasını bekleyin.
  8. Donör için alıcı bakteriye ve izin verilen (ve yardımcısı varsa) için optimal bir sıcaklıkta gecede ters plaka, inkübe edin. Plakası olmalıdırEn az 18 saat inkübe edilebilir.
  9. Bir seçici antibiyotik yüzeyindeki tek koloninin için spot ve çizgi kadar kazıyın. Antibiyotikler donör karşı ve plazmid içeren alıcı için seçmelisiniz. Bir ya da iki ilave izolasyon çizgiler saf bir kültür izole etmek için gerekli olabilir.
  10. Çıkan koloniler gibi koloni morfolojisi, veya alıcı-spesifik genlerin polimeraz zincir reaksiyonu tespiti gibi alıcının belirli fenotipler, varlığı için tarama tarafından alıcıya symbiont değil, donör zorlanma, emin olun. Bilinen bir dizi plasmid ve floresan polimeraz zincir reaksiyonu plazmid varlığı için koloniler ekran. Koloniler floresan protein karşılık gelen doğru dalga boyu altında flüorışı gerekmektedir.

2. Axenic Nematod Yumurta üretimi

  1. Gece boyunca, doğal bakteri symbiont 5 ml büyütün. Bir kültürü başlatmak için, bakteri Lysogeny Broth (LB) veya diğer cu inoküle edilebilirdoğrudan bir dondurucu stok ya da bir çizgi plaka LTURE medya.
  2. 10 mm Lipid Agar (LA) plakaları 29 üzerine bakteriyel kültürün 600 ul yayın. Sekiz-on tabak türlerin çoğu için yeterli nematodlar verecektir.
  3. Iki gün boyunca 25 ° C'de nem olmadan karanlıkta inkübe edin.
  4. Bakteriyel çimler için medya 500 ul, kullanılan nematod bağlı 5.000 infektif juvenil nematodlar, diğer kademelere veya ekleyin. 3 gün için 25 ° C sıcaklıkta inkübe plakaları.
  5. Erişkin nematodlar ve yumurta varlığı için plakaları kontrol edin. Bir mikroskop lamı üzerine su 20 ul yerleştirin. Bakteriyel çim kazıma-up küçük bir miktar nematodların steril bir sopa kullanma. Suya sopa yerleştirin ve nematod yüzmek kapalı izin verir. Düşük büyütme altında slayt bak. Görünümü hakkında daha fazla bilgi için tartışma ve Şekil 2'ye bakınız.
  6. Yumurta ve kadınlarda görülebilir durumdaysa, devam, aksi halde 25 & d plakalar inkübeörneğin; düzgün gelişimi her 6-12 saat için C ve kontrol edin. Dişiler yumurta içeren olduğunda, plakaların yüzeyinde su birkaç ml yerleştirin. Yavaşça girdap plakaları ve 50 ml konik tüp içine su dökün. Nematodlar plakaların dökülmek ve artık plaka yüzey üzerinde görünür olması gerekir. Çeşitli durulama gerekli olabilir.
  7. Nematodlar tüpün dibine yerleşmek için izin verin.
  8. Nematodlar durulayın. Tüpün üst dan fazla su pipet. Temiz su ve yetişkin nematod yerleşmek için izin ile doldurun. Fazla su pipet.
  9. Yumurta çözeltisi ile konik boru doldurun. Yumurta solüsyonu eklendikten sonra yumurta çözümü ile tüm adımların zamanlaması tam olarak maksimum yumurta verimi için anlatılan işlemleri yapmalıdır. Nazikçe tam 10 dakika boyunca çalkalanırken inkübe edin. Çoğu nematod inkübasyon sonuna kadar çözülmüş olmalıdır.
  10. Hemen (bu hız santrifüj getirerek içerir tam 10 dk 1250 xg'de konik tüpler santrifüjama aşağı 0 x g. ) Frenini kullanın.
  11. Hemen süpernatant süzün.
  12. Hemen pipetleme yumurta çözüm pelet yeniden askıya.
  13. Hemen yumurta solüsyonu ile konik tüp doldurun ve tersini 3-5 kat iyice karıştırın. Sonra hemen 2.10 olarak dönerler.
  14. Hemen süpernatant süzün.
  15. Pipetleme LB pelet yeniden askıya, yıkama adımları sırasında geliştirilmiş peletleme için bir 15 ml konik tüp aktarabilirsiniz. LB Steinernema spp için standarttır. Diğer tamponlar (minimal tuzlar ortamı gibi) tampon nematod veya bakteri ya da zarar vermemelisin akılda tutarak, nematod ve bakteri bağlı olarak kullanılabilir.
  16. 2.10 gibi LB ve spin ile tüp doldurun.
  17. Süpernatant Durusu ve LB yeniden askıya.
  18. 2.14 ve 2.15 tekrarlayarak nematodların 3 kez toplam durulayın.
  19. Uygun bir birime yeniden askıya nematod yumurtası seyreltin. Mikrolitre başına en az 10 yumurta olmalıdır. Örnekgs kolonize olan bakterilerin gelişimini inhibe antibiyotik ekleme ve parafilm içinde plaka sarma göre en az dört gün için 5 ml LB içinde bir 6-santimetrelik bir petri tabağına saklanabilir. Yumurtalar önce bakteriyel çimler üzerine inokülasyon için bir kez 15 ml LB (2.13 ve 2.14 gibi) yıkanmış gerekecektir. Yumurta bu dönemde yumurtadan olacaktır ve kolonizasyon deneylerde kullanıldığı zaman gelişimsel senkronize olmayabilir unutmayın.

3. Floresan Bakteriler ile Co-ekimi Assay

  1. Gerekirse plazmid için seçerek, gecede floresan bakteriler büyümek.
  2. Steril bir çubuk ile 10 mm Lipid Agar plaklarına bakteriyel kültürün 600 ul yayın. 2 gün boyunca 25 ° C'de inkübe edin.
  3. Her lipit agar plaka üzerine 100 ila 400 ul (200 ul optimum 2.000 nematod) toplam yerleştirin 500-5,000 axenic nematod yumurtası.
  4. 25 nem olmadan karanlıkta inkübe ° C IJs, veya ilgi, formun diğer evrelere kadar. IJs bir fu gibi görünür olacakplakasının kenar üzerinde zzy beyaz bir halka. Diğer yaşam evreleri bakmak için, Protokol 4'e bakın.
  5. Modifiye edilmiş bir beyaz tuzak 30 plakaları yerleştirin. Lipid agar plaka kapağını çıkarın ve boş bir 100 mm x 20 mm Petri kabı dibine alt yerleştirin. Küçük tabak surround, su ile büyük bir Petri kabı veya nematod uygun diğer tampon doldurun. Su seviyesi küçük plaka yaklaşık olarak yarısı yükseklikte olmalıdır.
  6. Döl IJs tampona ortaya kadar su tutucu inkübe edin.
  7. Enfektif çocuk nematodlar bir doku kültürü şişesi içinde su içinde muhafaza edilebilir.

4. Tarama için Erken Yaşam Evreleri Koleksiyonu

  1. Kullanım tahlil kurmak için 3.4 ile 3.1 adım.
  2. İstediğiniz yaşam evrelerinde mevcut olana plakalar inkübe edin. Günlük görsel kontrol zamanını belirlemek için gerekli olabilir. Plakaları denetlemeyi için, Protokol 2,5 açıklanan yordamı kullanın. S. için carpocapsae X ile m> eggsgrown LA plakaları üzerinde nematophila, gebe kadınlarda 4-5 gün mevcut olacak, gençlerin 7 gün mevcut olacak ve infektif juvenil 15-17 gün üretilmeye başlayacaktır.
  3. İstediğiniz yaşam evrelerinde mevcut olduğunda, örnek toplamak. 200 ul PBS ya da diğer uygun bir tampon ile bir 96 kuyulu plakanın bir kuyu doldurun. Yavaşça nematodlar içeren bakteriyel çim bazı kazıyın. Bezelye büyüklüğünde bir miktarda (~ 50 mg) F1 soyu üretilir kez, en azından birkaç yüz nematod sağlayacaktır, fakat daha erken zaman noktası için gerekli olabilir. De içeren tampon içine sopa yerleştirin.
  4. Bir dakika 30 saniye süreyle inkübe edin. Sopa çıkarın ve kalan kalıntı kazıyın. De herhangi bir agar kaldırmak için sopa kullanın. Nematodlar tampon içinde görünür olmalıdır. Temiz bir mikrofuge'de tüp tampon karışımı taşıyın.
  5. Levamizol veya diğer felç ajan ile nematodlar davranın. 30 & Mu içine levamizol birkaç tane eritin, Su l. Örneğin her 50 ul için bu karışımı 1-2 ul ekleyin. Levamizol Tedaviden sonra nematodların cansız olacaktır.
  6. Örnekler daha sonraki bir tarihte izlendi edilecek ise bu adımda açıklandığı gibi, düzeltin. Değilse, 4.6 adıma atlayın. 1X tampon ve% 4 paraformaldehid içeren fiksatif solüsyonu 200 ul ekleyin. İyice karıştırın, pipetleme hassas yaşam evreleri lyse neden olabilir. Folyo ile kaplayın, ve en azından 18 saat boyunca düşük bir karıştırma cihazı üzerinde, oda sıcaklığında inkübe edilir.
  7. Bir raf tüp içinde tüp yerleştirin ve nematodların tüpün altına yerleştirmek için izin verir.
  8. Arka planı kaldırmak için nematodlar durulayın. Aşırı sıvı kapalı pipet ve 200 eklemek - tampon 500 ul ve hafifçe karıştırın. Tekrarlayın. Bu istenirse bir kaç kat daha fazla arka planı kaldırmak için tekrar edilebilir.
  9. Nematodlar tüpün dibine yerleşmeye ve istenilen hacimde yeniden askıya izin verin.
  10. Hemen nematodlar sabit değilse, ekran. Sabit nematodlar kadar buzdolabında saklanabiliriki hafta. Karanlıkta saklayın.

5. Mikroskopi Bakteriyel Derneği Tarama Nematodlar

  1. Sizin karışımı küçük bir örnek çıkarılarak mikroskop altında görüntülemek için bazı nematod seçin.
  2. Nematodlar resim için hala emin olmak için, Protokol 4.5 açıklandığı gibi bir paralitik ajan ile tedavi. Bir resim almayan veya nematod zaten sabit ise, bu adım atlanabilir.
  3. Mikroskop slayt su kurtları 20-30 ul ekleyin ve üstüne bir lamel yerleştirin.
  4. Nematodlar görüş alanında olmasını sağlamak için ışık mikroskobu kullanılarak, tam nematodlar görüntüle.
  5. Bakteriler tarafından ifade floresan karşılık mikroskop floresan ayarını kullanarak nematodlar görüntüle.
  6. Bakteriyel lokalizasyonu belirlemek için, floresan ayarı ve ışık mikroskobu ayarı altında nematod fotoğraf çekmek ve daha sonra görüntüler üst üste. Fotoğraflar aynı fiel olmaları gerekirgörünümü d. Bu bakteriler için nematod çeşitli büyütme ve izleme denemek için gerekli olabilir.
  7. Nematod kolonizasyon dağılımı bakterilerin varlığı veya yokluğu için puanlama ve yüzde kolonize hesaplanırken, nematod nüfus sayımı ile belirlenebilir. Biz nüfus içinde en az 30 nematod güvenilir bir değer elde etmek için (kolonizasyonu olan veya olmayan) her kategoride sayılır kadar sayma öneririz.
  8. Nüfus içinde sadece birkaç nematodlar kolonize olan zaman, yaklaşık 30 önce birkaç bin nematod saymak için gerekli görülmektedir olabilir. High-throughput sayma için aşağıdaki adımları kullanın.
  9. Bir çok-plaka içine ayrı ayrı yerine nematod sayma, kısım nüfus (24 plaka gibi). Nematodlar çanak dibine yerleşti sonra, her bir kuyunun mikroskop taranabilir ve kolonize nematod sayısını attı edilebilir.
  10. Nematod sayısı ina nüfus içinde oldukça nematodların seri seyreltmeler ile tespit edilebilir. Örneğin, nematodlar, 1 ml ilave edilebilir bir de, iyi bir pipet ucu ve 3 ul ile karıştırılarak karışık çıkarıldı ve iyi toplam ölçümü için nüfus sayılabilir.
  11. Kolonize nematod yüzdesi olarak da nematod toplam sayısı tarafından kolonize sayısına bölünmesi ile elde edilebilir.

6. Temsilcisi Sonuçlar

Xenorhabdus bakteriler ile ilişkili Steinernema nematod örnekleri mikroskop Şekil 3 'de gösterilmiştir. Şekil 3A görülen kompozit görüntüyü oluşturmak için, bir faz kontrast görüntü floresan görüntü ile üst üste oldu. Şekil 3A 'daki ok bakterilerin enfeksiyon yapıcı çocuk nematodu (bar = 100 um) içinde mevcut olduğunu gösterir. Şekil 3B, benzer bir şekilde yapılmış ve bir çocuk nematod wi tasvir edilmiştirinci yeşil floresan protein etiketli bakteri (yeşil çubuklar) nematod bağırsak lümeninde (bar = 20 mikron) çapında lokalize. İki medya nematod nüfusu bakteriyel symbiont (Tablo 1) tarafından sayılır ve kolonizasyonu için skorlandı. Sağlam istatistikler için, en az 30 her kategoride düşen numune başına en az 100 nematod saymak için en iyisidir. Tablo 1'de görüldüğü gibi karaciğer, böbrek agar üzerinde büyüdüğü zaman lipit agar ve% 68,6 üzerinde büyüdüğü zaman, bu nematodlar yaklaşık% 14,6 düzeyinde kolonize edilmiştir. Diğer nematod ve bakteri türlerinin kolonizasyon farklı düzeylerde olduğu gösterilmiştir. Örneğin X. için nematophila S.% 99 kolonize carpocapsae infektif juvenil (Martens 2003) ve P. luminescens H. 26% kolonize bacteriophora infektif juvenil (Ciche 2003).

Şekil 1
Şekil 1. Yöntemin şematik. A. bir bakteri, floresan proteinini ifade tasarlanmıştır. B. Nematod yumurtaları steril nematod üretmek için yetişkin nematod izole edilmiştir. C. Steril nematodlar floresan bakteri ile birlikte yetiştirilmektedir. D. nedeniyle yaşam aşamaları altında görüntülenebilir mikroskop nematod içinde bakteriyel varlığının araştırılması.

Şekil 2,
Şekil 2. Yumurta içeren yetişkin kadın tasviri. A. şematik Steinernema kadınların genel görünümünü gösterir. Ankastre: Bir S. DIC görüntüsü feltiae kadın gravid. Siyah ok vulva gösterir. Beyaz oklar görünür yumurta göstermektedir. Görüntü 20X büyütme ve ölçek çubuğu 100 mikron temsil eder. Gelişmiş ama çıkmamış S. B. DIC görüntüsünematod yumurta feltiae. Görüntü 40X büyütme ve ölçek çubuğu 50 mikron temsil eder. Yumurtaların C. DIC görüntü izole S. gelen 10X büyütme altında nematodlar feltiae. Ölçek çubuğu 100 mikron.

Şekil 3
Nematod-bakteriyel dernek Şekil 3. Örnek mikroskop görüntüleri. A. S. puntauvense nematodlar onların bakteriyel symbiont, X ile ilişkili bulunmuştur bovienii, ifade GFP. Görüntünüzün aynı alanda bir floresan görüntü ile bir faz kontrast görüntü overlaying tarafından üretilen bir kompozit görüntü. Ok nematod konak içindeki floresan bakteriyel symbiont gösterir. Ölçek çubuğu 100 mikron temsil eder. B. Bu görüntü S. gösterir GFP ifade X'de carpocapsae juvenil nematod nematophila nematod bağırsak yerleşmiştir.Bu görüntü bir diferansiyel girişim kontrast görüntünün üzerinde floresan görüntü overlaying yoluyla inşa edilmiştir. Ölçek çubuğu 20 mikron temsil eder.

Zorlanma Acteria ile Nematodlar sayısı Toplam Nematodlar Sayılan Nematodlar Yüzde olonized
S. puntauvense Lipid Agar 30 205 14.60%
S. puntauvense Karaciğer Böbrek Agar 72 105 68.60%

Tablo 1. Bakteriyel varlığı için bir nematod popülasyonu örneği puanlama. Bu deneyde, axenic S. puntauvense nematodlar kolonizasyon kusurları sınamak için farklı büyüme ortamı üzerindeki GFP ifade symbiont (lipid agar ve karaciğer, böbrek agar 32) ile yetiştirilmiştir. En az bir hundre toplamnumune başına d nematod bakterilerin varlığı için sayılır ve skorlandı. Istatistiksel güç için, üç deney her kategoride düşen en az 30 nematodlar ile sayılmalıdır çoğaltır.

Tablo 2
Tablo 2. Fluoresan proteini içeren plazmid. Bakteri symbiont içine bir floresan protein yerleştirilmesi için potansiyel plazmid plazmid bir listesi adı göre listelenir verilir. Dahil Diğer bilgiler plazmid bakım için kullanılan floresan protein kodlanmış, antibiyotik kaset, kullanmak için başka yönergeler, plazmid kaynağıdır. Parantez içinde not konsantrasyon X için kullanılan antibiyotik konsantrasyonu nematophila. Bu plazmidler her Xenorhabdus veya Photorhabdus da başarıyla kullanılmaktadır. Ek bilgiler belirtildiği atıf elde edilebilir. Bağlıtest edilen bakteri, bazı plazmid floresan protein, antibiyotik seçimi, insersiyon veya çoğaltma kökeni dayalı çalışmayabilir. Yukarıda belirtilen plazmid ilgi bakteri kullanımı mümkün kılabilir farklı özellikleri içerir. Örneğin, kromozom attTn7 sitesi içine mini Tn7-KSGFP uçlar ise X içine pECM20 ekler homolog rekombinasyon ile nematophila kromozom. Alternatif olarak, plazmidler pPROBE extrachromosomally korunur ve her bir plazmid pPROBE aynı omurga ve florofor sahiptir, ancak taksonomik ya da mutant arka çeşitli kullanımlarını sağlamak için farklı seçilebilir marker ya da replikasyon kökeni sahiptir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada açıklanan protokol bir evsahibi nematodu (Şekil 1) içinde bakteri optik tespit için bir yöntem sağlar. Bu yöntem, nematod konak (Şekil 3) içinde bakteri in vivo analizi sağlayan, nematod optik şeffaflık ve floresan etiket bakterilerin yeteneği yararlanır. Özellikle, bu yaklaşım onun konak içinde bakteriyel yerelleştirme tanımlar. Bakteriyel varlığı için bir nematod popülasyonu ve puanlama sayarak, nematod popülasyonu üzerinde bakteri kolonizasyonu sıklığını (Tablo 1) tespit edilebilir. Bu yöntem, nematod barındıran ve bakteriyel simbiont arasındaki etkileşimleri incelemek için kullanılabilir birçok potansiyel tekniklerden biridir. İlgili yöntemleri, bakteriyel symbiont izole axenically nematod büyür ve ortakları 25-27 hem işlemek için daha önce tarif edilmiştir.

Protokolü h tarifere Xenorhabdus nematophila-Steinernema carpocapsae model sisteminde 14 yılında geliştirilen ve benzer yaklaşımlar diğer entomopatojen nematod-bakteriyel dernekler 9,15,17,18 kullanılmıştır. Çeşitli koşullar diğer nematod-bakteriyel sistemler için bu yöntemi uygulamak için yerine getirilmesi gerekir. İlk olarak, bakteri symbiont ana izole edilmiş ve bağımsız olarak kültür içinde yetiştirilir edilmesi gerekir. İkincisi, symbiont floresan proteini tanıtmak amacıyla dönüşüm veya konjugasyon yoluyla DNA almak mümkün olmalıdır. Üçüncüsü, en iyi sonuçlar için, nematod axenic bakteri ve yeniden ortaya yapılabilir bir sahne olmalı. Yerine floresan bakteri çim axenic yumurta ekleyerek, bir geleneksel kaldırdı hayat sahnesinde ekleyebilir ve açıklandığı gibi protokol ile devam edelim: Ancak, nematod bakteri izole edilemez bile hala dernek görselleştirmek mümkün olabilir. Herhangi bir sonuç ihtar inci yaşayacaktırifade GFP belirli nematod dokulara lokalizasyonu için GFP ifade bakteri ile rekabet, ve bu nedenle olacak yok bakterilere, kolonizasyon mikroskobik sayım ile ölçülen edilmemelidir. Ancak, sürece büyük ölçüde GFP ifade etmezler bakteri outcompete GFP ifade bakteri, GFP ifade bakteri nüfusu en azından bazı hayvanlarda nematod dokulara lokalize ve bakteriyel kolonizasyon için önemli doku siteler önermek gerekir. Floresan proteini ifade suşları kullanarak uzun soluklu ihtar onlar (örneğin 12) floresan proteinleri ifade etmez bir gerginlik farklı verimlilik ile bir ana kolonize olmasıdır.

Bu protokolü açıklanan Adımlar kullanılmakta olan nematod ve bakteri türlerinin bağlı olarak optimizasyon gerektirebilir. Bakterinin konjugasyon için değiştirilebilir bazı koşullar uzunluğu ve sıcaklık büyüme, alıcıya donör oranı ve plazma vardırid kullanılır. Ilgili plazmid örnekleri Tablo 2'de listelenmiştir. Bu plasmidlerin her başarılı bir şekilde nematod ana 14,17,20,24,33-35 ile bağlantılı olarak Xenorhabdus ya da Photorhabdus bakteri ya da kullanılmaktadır. Nematod kolonizasyonu sırasında floresan protein stabil bakım sağlamak için hedef bakteri kromozomu içine yerleştireceği bir plazmid kullanmak en iyisidir. Ayrıca, bazı bakteriler bu plazmidler sürebilir olmayabilir. Örneğin, pECM20 sadece X kullanılmıştır Hedef bakterinin bu bölgeye sahip değilse plazmid eklemek olmazsınız; plazmid ve kromozoma arasında bir homolog bölgenin kullanılarak kromozom içine bu plazmid ekler nedeniyle nemtaophila ve çok yakından bakteri suşlarının 14 ilişkilidir. Diğer bakteriler, X için bu plazmit kullanmak nematophila bölgeye özgü hedef bakteri bir genomik bölge ile ikame edilmiş olması gerekir. Bazı plazmid-dönüşüm planları r de olacakProtokol 1 belirli değişiklikler equire. Örneğin, mini-Tn 7-KSGFP ve FBK-miniTn 7-ΩGm-DsRed bakteriyel kromozom eklemek için bir yardımcı plazmid içeren transpozisyonu genler (tsnABCDE) 33,35,36 gerektirir. Konjugasyon 2 saatlik kültürleri (~ OD 600 0.3-0.4) eşit oranlarda karıştırılıp bu Tn plazmidler 7 tabanlı olan en etkili yöntemdir.

Başarılı bir birleşme sonra kullanılan plazmid karşılık gelen doğru seçici plakalar kullanmak için önemlidir. Seçici plakalar verici ve yardımcı suşlarına karşı alıcı ve ters seçim olarak plazmid varlığını belirlemek için plazmid üzerinde kodlanmış antibiyotik içermelidir. Örneğin, X. pECM20 konjugasyonu zaman kullanılan nematophila karşı seçimi ampisilin nedeniyle X. nematophila ampisiline dirençli ve donör suşu ampisilin duyarlıdır. Antibiyotik karşı seçim y kullanılamıyorsaSistemimizde, verici gerektiren bir diaminopimelic asit (DAB) kullanılabilir. Büyümek için DAP-gerektiren suşları, DAP öncesi konjugasyon ve konjugasyon adımları sırasında katı ve sıvı büyüme ortamı eklendi, ve karşı-seçim aşamalarında atlandı. DAP devamsızlık donör gerginlik büyümek olmaz ve olduğunda etkili bir karşı-seçilmiş.

Başarılı yumurta izolasyonu sağlamak için doğru bir yumurta üretimi (Şekil 2) için kontrol etmek önemlidir. Izolasyon zamanda, dişi nematod yumurta dolu olmalı ve bazı yumurta medya (Şekil 2A) görünür olmalıdır. Dişi nematod döllenmiş yumurta üretiminde ise en azından bazı süpernatant yumurta gözle çıkmamış nematod (Şekil 2B) olarak gelişmiş olacaktır. S. için carpocapsae, yumurta biraz önce nematod ve kuluçka gelişmekte oblong için küresel değişecektir. Nematod büyümesinin zamanlama ya da koşullar da döllenmiş yumurta en üst düzeye çıkarmak için değiştirilmesi gerekebilirkısaltma veya uzatma süre yumurta hasat öncesi, ya da alternatif medya belirli nematod türleri için uygun kullanarak dahil, verim. Izolasyon sonunda, yumurta tampon (Şekil 2C) içinde kolayca görünür olmalıdır. Optimizasyon isteyebilir yumurta izolasyon protokolü Parametreler yumurta çözüm ağartıcı ve KOH konsantrasyonları, yumurta çözüm inkübasyon süresi veya santrifüj hızı bulunmaktadır. Yumurta yalıtım yumurta üretir ama hiçbir nematodlar eş-ekim döneminde ortaya çıkarsa, bu izole yumurta cansız olması mümkündür. Canlılığı kontrol etmek için, tampon içinde izole yumurta bırakmak ve nematod yumurtadan bekleyin. Yumurta izolasyon bir ya da iki gün içinde yumurtadan olmalıdır ve daha sonra, çocuk nematodlar birlikte kültivasyonu deneyde kullanılabilir. Yumurtalar ancak eş-yetiştirme tahlil sırasında ortaya çıkmaz, bu ko-kültivasyonu için kullanılan büyüme koşulları ya da orta değiştirmek için gerekli olabilir. Biz önceki Studie unutmayıns bir antibiyotik kokteyl (örneğin 3,37) olarak nematodların iliklerine bakteri içermeyen nematod izole ettim. Burada tarif yaklaşım bakteriyostatik antibiyotikler, antibiyotik dirençli bulunan bakterilerin, ve nematodlar üzerinde antibiyotik etkisi kullanarak komplikasyonlar da dahil olmak üzere antibiyotik iliklerine, ve uyarılar bazı ücretsizdir. Nematod Bazı aşamalarında da antibiyotiklere dirençli ve 3 kendi bakteriyel simbiont tutabiliriz. Son olarak, mikroskopi için, nematod immobilizasyon için gerekli olan konsantrasyon, levamizol farklı nematod nesillerin ile farklı olabileceğini not edin.

Bu yöntem, ilgilenilen sisteminde bir kez kurulduktan sonra, daha fazla bilgi elde etmek için teknik değiştirmek mümkündür. Nematod yaşam döngüsü (Protokol 4) önceki zaman noktalarında bakarak, bir bakteri ve nematod ilişkisi 14,16 başlatmak nasıl tespit etmek mümkün olabilir. Buna ek olarak, bu yaklaşım, t kullanılabilirlerkolonizasyon 17,18 algılamak için floresan kullanarak, simbiyoz dahil bakteriyel faktörleri tanımlamak için yüksek verimlilik mutant ekranlar yapmak o. Böyle imza tagged mutajenez gibi diğer yöntemler radyoaktif işaretli probların kullanımı gerektiren ve 22,28 tüketen daha fazla zaman vardır. Bu nedenle, nematodlar bakteriyel symbiont görselleştirme için floresan mikroskop kullanımı nematod konak ile bakteri etkileşimleri araştırmak için etkin ve verimli bir tarama yöntemidir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

Yazarlar kullanılan bu protokol ve araçları geliştirme katkıları için Eugenio Vivas, Kurt Heungens, Eric Martens, Charles Cowles, Darby Şeker, Eric Stabb, ve Todd Ciche teşekkür etmek istiyorum. KEM ve JMC Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) Ulusal Araştırma Hizmet Ödülü T32 (AI55397 "Sağlık ve Hastalık mikrop") tarafından desteklenmiştir. JMC Ulusal Bilim Vakfı (NSF) Lisansüstü Araştırma Bursu ile desteklenmiştir. Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı (IOS-0920631 ve IOS-0950873) hibe tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lipid Agar
(sterile)		 8 grams nutrient broth, 15 grams agar, 5 grams yeast extract, 890 ml water, 10 ml 0.2 g/ml MgCl2. 6H20, 96 ml corn syrup solution*, 4 ml corn oil*
Stir media while pouring plates
*add sterile ingredient after autoclaving
Corn Syrup Solution
(sterile)		 7 ml corn syrup, 89 ml water
mix and autoclave
Egg Solution 16.6 ml 12% sodium hypochlorite, 5 ml 5M KOH, 80 ml water
Lysogeny Broth
(sterile)		 5 grams yeast extract, 10 grams tryptone, 5 grams salt, 1 L water
mix and autoclave
Microfuge Fisher 13-100-675 Any microfuge that holds microfuge tubes will work
Centrifuge Beckman 366802 Large table top centrifuge that holds 15 ml and 50 ml conical tubes
Sterile 60 mm X 15 mm Petri Dish Fisher 0875713
50 ml centrifuge tubes Fisher 05-539-6
15 ml centrifuge tubes Fisher 05-531-6
Sterile 100 mm X 20 mm Petri Dish Fisher 0875711Z Deeper than standard Petri dishes
24-well plate Greiner Bio-One 662000-06
Microscope The microscope needs florescent capabilities compatible with your fluorophore
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710
PBS
(sterile)		 8 g NaCL
0.2 g KCL
1.44 g Na2HPO4
0.24 g KH2PO4
1 L water

Adjust to a pH of 7.4 and water to 1 L and autoclave
Microfuge tubes Fisher 05-408-138 2 ml or 1.5 ml tubes
Shaker Any shaker that causes the liquid to gently move will work
Diaminopimelic acid Sigma D-1377 If needed, supplement media to a concentration or 1 mM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Holterman, M., van der Wurff, A. Phylum-wide analysis of SSU rDNA reveals deep phylogenetic relationships among nematodes and accelerated evolution toward crown clades. Mol. Biol. Evol. 23, 1792-1800 (2006).
  2. Lambshead, P. J. D., Boucher, G. Marine nematode deep-sea biodiversity - hyperdiverse or hype. J. Biogeogr. 30, 475-485 (2003).
  3. Poinar, G. O. J., Thomas, G. M. Significance of Achromobacter nematophilus Poinar and Thomas (Achromobacteraceae: Eubacteriales) in the development of the nematode, DD-136 (Neoaplectana sp. Steinernematidae). Parasitol. 56, 385-390 (1966).
  4. Herbert, E. E., Goodrich-Blair, H. Friend and foe: the two faces of Xenorhabdus nematophila. Nat. Rev. Microbiol. 5, 634-646 (2007).
  5. Kaya, H. K., Gaugler, R. Entomopathogenic nematodes. Annu. Rev. Entomol. 38, 181-206 (1993).
  6. Bird, A. F., Akhurst, R. J. The nature of the intestinal vesicle in nematodes of the family Steinernematidae. Int. J. Parasitol. 13, 599-606 (1983).
  7. Martens, E. C., Goodrich-Blair, H. The Steinernema carpocapsae intestinal vesicle contains a subcellular structure with which Xenorhabdus nematophila associates during colonization initiation. Cell. Microbiol. 7, 1723-1735 (2005).
  8. Snyder, H. A., Stock, S. P., Kim, S. K., Flores-Lara, Y., Forst, S. New insights into the colonization and release process of Xenorhabdus nematophila and the morphology and ultrastructure of the bacterial receptacle of its nematode host, Steinernema carpocapsae. Appl. Environ. Microbiol. 73, 5338-5346 (2007).
  9. Abebe, E., Abebe-Akele, F., Morrison, J., Cooper, V., Thomas, W. K. An insect pathogenic symbiosis between a Caenorhabditis and Serratia. Virulence. 2, 158-161 (2011).
  10. Abebe, E., Jumba, M. An entomopathogenic Caenorhabditis briggsae. J. Exp. Biol. 213, 3223-3229 (2010).
  11. Torres-Barragan, A., Suazo, A., Buhler, W. G., Cardoza, Y. J. Studies on the entomopathogenicity and bacterial associates of the nematode Oscheius carolinensis. Biol. Control. 59, 123-129 (2011).
  12. Ye, W. M., Torres-Barragan, A., Cardoza, Y. Oscheius carolinensis n. sp (Nematoda: Rhabditidae), a potential entomopathogenic nematode from vermicompost. Nematology. 12, 121-135 (2010).
  13. Zhang, C., Liu, J. Heterorhabditidoides chongmingensis gen. nov., sp. nov. (Rhabditida: Rhabditidae), a novel member of the entomopathogenic nematodes. J. Invertebr. Pathol. 98, 153-168 (2008).
  14. Martens, E. C., Heungens, K., Goodrich-Blair, H. Early colonization events in the mutualistic association between Steinernema carpocapsae nematodes and Xenorhabdus nematophila bacteria. J. Bacteriol. 185, 3147-3154 (2003).
  15. Ciche, T. A., Ensign, J. C. For the insect pathogen, Photorhabdus luminescens, which end of a nematode is out. Appl. Environ. Microbiol. 69, 1890-1897 (2003).
  16. Ciche, T. A., Kim, K. S., Kaufmann-Daszczuk, B., Nguyen, K. C., Hall, D. H. Cell invasion and matricide during Photorhabdus luminescens transmission by Heterorhabditis bacteriophora nematodes. Appl. Environ. Microbiol. 74, 2275-2287 (2008).
  17. Easom, C. A., Joyce, S. A., Clarke, D. J. Identification of genes involved in the mutualistic colonization of the nematode Heterorhabditis bacteriophora by the bacterium Photorhabdus luminescens. BMC Microbiol. 10, 45 (2010).
  18. Somvanshi, V. S., Kaufmann-Daszczuk, B., Kim, K. S., Mallon, S., Ciche, T. A. Photorhabdus phase variants express a novel fimbrial locus, mad, essential for symbiosis. Mol. Microbiol. 77, 1021-1038 (2010).
  19. Martens, E. C., Russell, F. M., Goodrich-Blair, H. Analysis of Xenorhabdus nematophila metabolic mutants yields insight into stages of Steinernema carpocapsae nematode intestinal colonization. Mol. Microbiol. 51, 28-45 (2005).
  20. Sugar, D. R., Murfin, K. E. Phenotypic variation and host interactions of Xenorhabdus bovienii SS-2004, the entomopathogenic symbiont of Steinernema jollieti nematodes. Env. Microbiol. 14, 924-939 (2012).
  21. Cowles, C. E., Goodrich-Blair, H. The Xenorhabdus nematophila nilABC genes confer the ability of Xenorhabdus spp. to colonize Steinernema carpocapsae nematodes. J. Bacteriol. 190, 4121-4128 (2008).
  22. Heungens, K., Cowles, C. E., Goodrich-Blair, H. Identification of Xenorhabdus nematophila genes required for mutualistic colonization of Steinernema carpocapsae nematodes. Mol. Microbiol. 45, 1337-1353 (2002).
  23. Goetsch, M., Owen, H., Goldman, B., Forst, S. Analysis of the PixA inclusion body protein of Xenorhabdus nematophila. J. Bacteriol. 188, 2706-2710 (2006).
  24. Bhasin, A., Chaston, J. M., Goodrich-Blair, H. Mutational Analyses Reveal Overall Topology and Functional Regions of NilB, a Bacterial Outer Membrane Protein Required for Host Association in a Model of Animal-Microbe Mutualism. J. Bacteriol. 194, 1763-1776 (2012).
  25. Ciche, T. A., Goffredi, S. K. Methods in General and Molecular Microbiology. Reddy, C. A. , ASM Press. 394-419 (2007).
  26. Goodrich-Blair, H., Clarke, D., Grewal, P. S., Ciche, T. A. Insect Pathogens, Molecular Approaches and Techniques. Stock, S. P., Boemare, N., Vandenberg, J., Glazar, I. , CABI Publishing. 239-269 (2009).
  27. Stock, S. P., Goodrich-Blair, H. Manual of Techniques in Invertebrate Pathology. Lacey, L. A. , Elsevier Press. 375-425 (2012).
  28. Martens, E. C., Gawronski-Salerno, J. Xenorhabdus nematophila requires an intact iscRSUA-hscBA-fdx locus to colonize Steinernema carpocapsae nematodes. J. Bacteriol. 185, 3678-3682 (2003).
  29. Vivas, E. I., Goodrich-Blair, H. Xenorhabdus nematophilus as a model for host-bacterium interactions: rpoS is necessary for mutualism with nematodes. J. Bacteriol. 183, 4687-4693 (2001).
  30. White, G. F. A method for obtaining infective nematode larvae from cultures. Science. 66, 302-303 (1927).
  31. Ciche, T. A., Ensign, J. C. For the insect pathogen Photorhabdus luminescens, which end of a nematode is out. Appl. Environ. Microbiol. 69, 1890-1897 (2003).
  32. Sicard, M., Brun, N. L. e Effect of native Xenorhabdus on the fitness of their Steinernema hosts: contrasting types of interaction. Parasitol. Res. 91, 520-524 (2003).
  33. Lambertsen, L., Sternberg, C., Molin, S. Mini-Tn7 transposons for site-specific tagging of bacteria with fluorescent proteins. Environ. Microbiol. 6, 726-732 (2004).
  34. Miller, W. G., Leveau, J. H., Lindow, S. E. Improved gfp and inaZ broad-host-range promoter-probe vectors. Mol. Plant Microbe Int. 13, 1243-1250 (2000).
  35. Teal, T. K., Lies, D. P., Wold, B. J., Newman, D. K. Spatiometabolic stratification of Shewanella oneidensis biofilms. Appl. Environ. Microbiol. 72, 7324-7330 (2006).
  36. Bao, Y., Lies, D. P., Fu, H., Roberts, G. P. An improved Tn7-based system for the single-copy insertion of cloned genes into chromosomes of Gram-negative bacteria. Gene. 109, 167-168 (1991).
  37. Woodring, J. L., Kaya, H. K. Steinernematid and Heterorhabditid Nematodes: A Handbook of Biology and Techniques. Southern Cooperative Series Bulletin 331. , Arkansas Agricultural Experiment Station. (1988).

Tags

Mikrobiyoloji Sayı 68 Moleküler Biyoloji Bakteriyoloji Gelişim Biyolojisi Kolonizasyon, Simbiyoz nematod bakteri floresan mikroskobu
Floresan Mikroskobu kullanılarak Nematodlar Bakteriler görselleştirme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Murfin, K. E., Chaston, J.,… More

Murfin, K. E., Chaston, J., Goodrich-Blair, H. Visualizing Bacteria in Nematodes using Fluorescent Microscopy. J. Vis. Exp. (68), e4298, doi:10.3791/4298 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter