Summary
斑马鱼代表一个功能强大的的脊椎动物模型，一直用于代谢的研究。在这里，我们描述了一个快速的方法来衡量
Abstract
越来越代谢领域的目标是，以确定基因的影响线粒体功能的不同方面。了解这些关系，将有助于了解与线粒体功能障碍，如糖尿病和肥胖相关的疾病的基本病因。仪器仪表的最新进展，使不同的参数的监控线粒体功能的细胞系或组织外植体。在这里，我们提出了一种快速，灵敏的体内线粒体功能的参数分析斑马鱼胚胎发育过程中海马生物科学XF 24外通量分析方法。该协议利用微孔板，每孔放置在一个单一的胚胎胰岛捕捉，可以测量生物能学，包括：（i）基础呼吸;基础线粒体呼吸（二）（三）线粒体呼吸，由于ATP成交;（四）线粒体耦合呼吸或公关oton泄漏及（iv）最大呼吸。使用这种方法的胚胎斑马鱼的呼吸参数可以比较野生型和基因改变的胚胎（突变体，基因的过度表达或基因敲除）或操纵药理学。据预测，本协议的传播，为研究人员提供新的工具来分析此相关的脊椎动物动物模型的体内代谢紊乱的遗传基础。
Protocol
第1部分：化学处理的斑马鱼胚胎
- 收集斑马鱼胚胎在受精后。孵育在28.5℃下在E3介质的100×15毫米的培养皿中。 注：如果在 原位杂交或油红O染色，1 -苯基-2 -硫脲（PTU）的最终浓度为0.2 mM的被添加到抑制色素形成1，但不是必要的海马分析。
- 药理研究，在适当的斑马鱼胚胎在受精后26小时左右（HPF）的终浓度为所需的化学添加一个合适的工具，唯一的控制。 注意：光敏感的药物抑制剂，胚胎可以被允许发展在分析前的暗。
第2部分：现场代谢个人使用海马XF 24分析仪
- 每次运行前，海马XF 24分析仪墨盒，里面的O 2和H
- 制备24孔XF 24胰岛板。采用下面的实验序列：
- 由于氧的消耗是敏感的温度波动，四个井，用于控制整个板的可能的温度波动。这些井的不包含胚胎，但都充满了700微升E3类介质中（ 图2A）。
- 余下的20井（见2.2部分）填充E3类介质和每一个胚胎（ 图2B）与700微升。
- 对于每个实验，10的胚胎与车辆只（对照组）和10用化学抑制剂（处理的）处理。交替控制和处理的胚胎（ 例如 A2：控制胚胎;以及A3：处理过的胚胎以及A4：控制胚胎，治疗以及A5胚胎等）。
- 一个小岛拍摄屏幕的顶部添加每个孔中，以确保该标本保持在整个试验中（ 图2B）的测量室。 注：化学处理的胚胎保持其原始的化学溶液在整个过程中，没有需要洗出前的化学运行Seahorse的分析仪程序。
- 一旦完成后，板装入Seahorse的分析仪，并开始测定。
- 样本分析。两种不同的检测常规进行。
- 的基础呼吸/最大呼吸计划（持续时间约90分钟）。基础呼吸的改变支撑，而最大的呼吸代谢功能障碍，是衡量能源生产总量的能力，在此参数与一些病理和生理状态的改变。的备用呼吸能力，或系统，以进一步提高ATP生产的能力，同时也计算出从本次测试的减法的基础，从最大的呼吸。三重复的每个组合（2分钟）/（1分钟）/测量等待周期（2分钟），先建立基础的呼吸。在第三个周期的结束，使最终浓度为2.5μM的FCCP（线粒体protonophore /解偶联剂）被添加到每个孔中允许测量的最大呼吸。然后，在测量周期重复5〜8倍（ 图3）。
- ATP营业额/的质子漏程序（持续时间约60分钟）。呼吸，由于ATP营业额的主要功能，线粒体的ATP生产的形式，而由于质子漏，或脱钩呼吸呼吸，与其他参数的线粒体的功能，包括基础呼吸和活性氧物种的形成有着千丝万缕的联系。呼吸由于ATP周转后，加入25μM的寡霉素（抑制剂的A表示的呼吸中的差异TP酶）相比，基础呼吸的影响。非耦合呼吸，或呼吸由于质子泄漏，确定通过计算25μM鱼藤酮（一个复杂的I抑制剂）的添加后，寡霉素-介导的呼吸和呼吸之间的差异。每个线粒体抑制剂加入后，重复测量周期的8倍。
- 制备24孔XF 24胰岛板。采用下面的实验序列：
的运行结束时，计算平均值10控制和10个化学处理的胚胎。
第3部分：油红O染色
- 50斑马鱼胚胎在dechorionated用细镊子和4％PFA固定于4℃过夜
- 进行油红O染色，如前面所述2（参见图4）。
Representative Results
我们有兴趣了解特定基因的代谢，特别是呼吸速率和脂质代谢的作用。因此，我们治疗野生型斑马鱼胚胎从26高倍视野起与一个特定的药理由这些基因编码的酶的抑制剂。在50 hpf时，一半的车辆和抑制剂处理的胚胎进行了分析使用Seahorse的线粒体功能，而剩下的一半固定在4％PFA过夜，4℃，随后与油红O染色的脂质沉积。治疗与特定酶抑制剂导致1〜2倍，增加在基础呼吸（ 图4），这是与增加脂质沉积，特别是在端脑和下耳泡（ 图4B，C）。
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图1。化学处理的斑马鱼胚胎的示意图。野生型基因操纵，或药物治疗，斑马鱼的胚胎是背景。
图2。 XF24胰岛板成立。（A）四口井含有胚胎的介质温度控制（用X标记），其他/包含一个胚胎。 （B）的特写镜头一个（C6）50 HPF野生型胚胎处理的车辆（DMSO）所涵盖的一个小岛拍摄画面（箭头）。
图3。 Respirat50野生型斑马鱼斑马鱼胚胎中的离子参数。（A）对于每个测量，平均20个独立的胚胎。的基础呼吸（平均数：299.7 SD：75.7; SEM：16.9），最大呼吸（平均数：387.4 SD：93.3; SEM：20.9），备用呼吸能力（平均：87.7; SD：72.0; SEM：16.1）。 （B）对于每个测量，平均20个人的结果。基础线粒体的呼吸，由于ATP营业额;线粒体的耦合呼吸和非线粒体呼吸的线粒体呼吸。山：线粒体; SRC：备用呼吸容量SD：标准差），扫描电镜（SEM平均数的标准误差。结果消耗O 2为pmol /分钟/胚胎。 点击这里查看大图 。
图4。只代表了sentative结果的基础呼吸和脂质沉积的化学品接触。（A，B）50斑马鱼胚胎油红O染色，在横向视图。胚胎培养的选择性抑制剂（B）显示出更多的油红O染色相比，车辆处理的对照组胚胎前脑（箭头）和下耳泡（箭头）。 （C）基础呼吸〜2倍，增加化学处理的胚胎组（n = 10每个组的胚胎）。 O 2 /最小/胚胎pmol的结果。
Discussion
斑马鱼是一种行之有效的遗传模型的正向（ENU诱变）和反向（耕，锌指核酸酶，有针对性的基因敲除，吗啉击倒）遗传方法3,4，而在斑马鱼胚胎的基因的功能也可以很容易地阻止或激活使用特定的编码产物的选择性药效成分。由于它们的外部的发展和小尺寸，斑马鱼胚胎是特别适合于代谢分析。然而，在斑马鱼胚胎在体内的代谢和线粒体功能强大的测量，只有一个初步的说明报告5。海马分析最初被设计用于基于细胞的代谢研究，并已被证明，得到准确和可靠的结果6。这种新方法的应用斑马鱼的胚胎是重要的，并可能增加这种模式的代谢研究的更广泛的使用。
在这项研究中，我们展示了在斑马鱼胚胎海马分析仪，包括基础呼吸，最大呼吸，备用呼吸能力，ATP营业额和质子漏的呼吸参数的测量。我们还提供这样的测量可以如何与其他生理参数，在这种情况下，脂质蓄积，并在该测定系统中使用的药理抑制剂相关的一个例子。结合使用基因改变胚胎，这提供了一个有力的实验平台，为了解对新陈代谢的影响因素。
有很多种为这个新的方法的应用程序，与线粒体功能障碍被牵连在许多人类的疾病，如糖 尿病7 8，肥胖，多发性硬化症9，帕金森氏病10，阿尔茨海默氏病11和某些类型的癌症12。重要的是，O我们的工作是在体内 ，在那里所有的环境的影响-如细胞因子，与发展有关的生长等-是活跃的，从而提供了一种在体内的呼吸和代谢更新有关生理视图。由于化学屏幕也经常在野生型和突变的背景斑马鱼胚胎（ 图1），小说，影响呼吸，线粒体功能或代谢海马分析仪，可以很容易地确定使用的药品。使用Seahorse的分析仪产生的结果可与其他实验中使用，以提供额外的信息。这可以包括生理的分析，如油红染色，或分子生物学分析，如原位杂交特定的脂肪细胞的的标记如cebpα，PPARα，PPARγ，FAS等。
这种方法仍然有一定的局限性。虽然我们和其他人能够使用寡测量余吕杏茜的ATP生产和质子漏幼胚（ 见图3），在胚胎年龄超过60 HPF寡治疗是无效的。我们相信，在旧的胚胎寡不能扩散，容易在年轻的胚胎，结果无法解释。由于寡结果的测定呼吸由于ATP的营业额和非耦合呼吸，是强制性的，我们目前正在研究高浓度的寡旧胚胎。然而，抗霉素A治疗仍然有效的更长的时间，与其它的测量，如基础呼吸，最大呼吸和备用呼吸能力，可以在旧的斑马鱼胚胎，最多至68 hpf时（未示出）。
在使用当前的海马分析仪设置的另一个限制是每个胰岛捕捉板的物理空间内，使得它们只适合斑马鱼胚胎和年轻幼虫。因此，执行metabolIC饮食引起的肥胖的成年鱼的研究，例如，尚未技术上是可行的。不过，这项研究可能会提示板专为青少年或成年鱼的发展，从而延长了分析可能的范围内。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
作者要感谢迪肯大学斑马鱼设施的工作人员提供了良好的持续牧护理。将YG支持阿尔弗雷德·迪肯博士后研究奖学金和中央迪肯大学（Deakin University）的研究资助。 SLM NHMRC职业发展奖学金的支持。 ACW是支持的的NHMRC启用补助金。所有的作家都迪肯大学的分子医学研究所战略研究中心的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| XF 24 extracellular flux analyser | Seahorse Bioscience | 100737-101 | 24 well format |
| Islet Capture microplate | Seahorse Bioscience | 101122-100 | 24 well format |
| XF Calibrant Solution | Seahorse Bioscience | 100840-000 | |
| XF Assay Medium | Seahorse Bioscience | 101022-100 | |
| Oil-Red-O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml51 |
| E3 (embryonic medium) | Self made | - | http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml16 |
| 100X15 mm Petri dishes | Falcon | 35-1029 | |
| FCCP | Sigma | C2920 | |
| Oligomycin | Sigma | 75351 | |
| Antimycin A | Sigma | A8674 |
References
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