Summary
דג זברה מייצג מודל חוליות חזקה שהיה תחת מנוצל למחקרים מטבוליים. כאן אנו מתארים את הדרך מהירה למדידה
Abstract
מטרה גוברת בתחום המטבוליזם היא לקבוע את ההשפעה של גנטיקה על היבטים שונים של מיטוכונדריה. הבנת יחסים אלה תעזור להבין את האטיולוגיה הבסיסית למגוון מחלות הקשורות בתפקוד המיטוכונדריה, כמו סוכרת והשמנת יתר. התקדמות במכשור, אפשרה הניטור של פרמטרים שונים של מיטוכונדריה בשורות תאים או הרקמות explants. כאן אנו מציגים שיטה לניתוח מהיר ורגיש של פרמטרי מיטוכונדריה in vivo במהלך התפתחות עוברית דג הזברה באמצעות מנתח סוסון ים Bioscience XF 24 תאי שטף. פרוטוקול זה משתמש בלכידת איילט microplates בי עובר יחיד יוצב בכל באר, המאפשרת מדידה של bioenergetics, כוללת: (i) הנשמה בסיסית; נשימה (ii) המיטוכונדריה הבזליים נשימה (iii) המיטוכונדריה בשל מחזור ה-ATP; (ד) המיטוכונדריה נשימה כשהתיר או יחסי הציבורoton דליפה ונשימה (iv) מקסימלי. שימוש בפרמטרי גישה זו עוברית דג זברת נשימה ניתן להשוות בין סוג פרוע ועוברים שעברו שינוי גנטי (מוטציה, גן על ביטוי או מציאת גן) או אלה מניפולציות פרמקולוגית. זה צפוי כי הפצתו של פרוטוקול זה תספק לחוקרים בכלים חדשים כדי לנתח את הבסיס הגנטי של הפרעות מטבוליות in vivo במודל של בעלי חיים בעלי חוליות רלוונטי זה.
Protocol
חלק 1: טיפול כימי של עוברי דג זברה
- לאסוף עוברי דג זברה לאחר הפריה. לדגור על 28.5 מעלות צלזיוס במדיום E3 ב100 × 15 מ"מ צלחות פטרי. הערה: לכלאה באתר או שמן אדום-O מכתים, 1-פניל-2-Thiourea (PTU) בריכוז סופי של 0.2 מ"מ הוא הוסיף לדכא היווצרות פיגמנט, 1, אך אינו הכרחי לניתוח סוסון ים.
- למחקרים פרמקולוגיים, להוסיף את הכימיקל הנדרש בריכוז סופי מתאים לפיתוח עוברי דג זברה בסביבות 26 הפרית הודעה לשעה (hpf) עם רכב בלבד שליטת הערה מתאימה:. למעכבים פרמקולוגיים רגישים לאור, עוברים יכולים להיות מותרים לפתח ב לפני חשכה לניתוח.
חלק 2: פרופיל מטבולים חי באמצעות 24 Analyser XF סוסון הים
- לפני כל ריצה, מחסנית Analyser סוסון ים XF 24 כי בתי O 2 ו-H
- הכנת צלחת האיון 24 גם XF 24. רצף הניסוי הבא הוא מועסק:
- מאז צריכת חמצן היא רגישה לתנודות טמפרטורה, 4 בארות המשמשות לבקרה לתנודות טמפרטורה אפשריות ברחבי הצלחת. בארות אלה אינם מכילות עוברים, אך מלאות ב700 μl של מדיום E3 (איור 2 א).
- את 20 הבארות הנותרות (ראה מסגרת 2.2) מלאות ב700 μl של מדיום E3 ועובר בכל אחד (2B איור).
- עבור כל ניסוי, 10 עוברי מטופלים עם רכב בלבד (שליטה) ו 10 טופל במעכבים כימיים (מטופלים). עוברי בקרה וטופלו לסירוגין (למשל A2 גם: עובר שליטה; גם A3: עובר שטופל: A4 גם: עובר שליטה; A5 עובר יחס טוב, וכו ').
- מסך לכיד איון הוא הוסיף בחלק העליון של. כל היטב כדי להבטיח שהדגימה נשארת בתא המדידה במשך הבדיקה (האיור 2B) הערה: עוברים כימיים שטופלו להישאר עם התמיסה הכימית המקורית לאורך כל ההליך, ללא צורך לשטוף את כימי לפני ההרצה של מנתח סוסון הים תכנית.
- פעם סיים, הצלחת הוא נטען לתוך Analyser סוסון הים וassay הוא התחיל.
- ניתוח של דגימות. שני מבחנים שונים מבוצעים באופן שגרתי.
- תכנית אסאל נשימה / נשימה מרבית (כ משך. 90 דקות). שינויים בנשימה בסיסית לחזק תפקוד מטבולים, ואילו הנשמה מרבית היא מדד לקיבולת כוללת ייצור אנרגיה ושינויים בפרמטר זה קשור למספר מצבים פתולוגיים הן ופיסיולוגיים. קיבולת הנשימה, או קיבולת למערכת נוספת כדי להגדיל את ייצור ה-ATP, מחושבת גםמבדיקה זו על ידי החיסור של בסיס מהנשמה מקסימלי. שלוש חזרות של כל תמהיל (2 דקות) / מחזור המדידה (2 דקות) לחכות דקות (1) / מבוצעת כדי להקים בסיס נשימה ראשונה. בסיומו של המחזור השלישי, ריכוז סופי של 2.5 מיקרומטר של FCCP (המיטוכונדריה protonophore / uncoupler) נוסף לכל גם מאפשר מדידה של נשימה מרבית. אז מחזור המדידה חוזר על עצמו 5-8 פעמים (איור 3).
- תכנית ה-ATP מחזור / דליפת פרוטון (משך כ. 60 דקות). נשימה עקב תחלופת ATP מייצגת את הפונקציה העיקרית של המיטוכונדריה בצורה של ייצור ה-ATP, תוך נשימה עקב דליפת פרוטון, או בנשימה כשהתיר, קשורה קשר בל אנתק עם פרמטרים אחרים של מיטוכונדריה כולל הנשמת בסיס והיווצרות מיני חמצן תגובתי. נשימה עקב תחלופת ATP מיוצגת על ידי ההבדל בנשימה לאחר התוספת של oligomycin מיקרומטר 25 (מעכב שלsynthase TP) בהשוואה לנשימה בסיסית. הנשמה נותקה, או בנשימה עקב דליפת פרוטון, נקבעה על ידי חישוב ההפרש בין נשימת oligomycin בתיווך ונשימה לאחר התוספת של 25 מיקרומטר rotenone (מעכב אני מורכב). מחזורי מדידה חוזרים 8 פעמים לאחר תוספת של כל מעכב המיטוכונדריה.
- הכנת צלחת האיון 24 גם XF 24. רצף הניסוי הבא הוא מועסק:
בתום הריצות, אומרים ערכים של 10 שליטה ו10 עוברים שטופלו כימי מחושבים.
חלק 3: שמן אדום-O כתמים
- עוברים ב50 hpf הם dechorionated באמצעות מלקחיים עדינים וקבועים ב4% PFA הלילה ב 4 ° C.
- שמן אדום-O צביעה מבוצעת, כפי שתוארה קודם לכן 2 (ראה איור 4).
Representative Results
אנחנו מעוניינים בהבנת גני התפקיד ספציפיים בחילוף חומרים, ובמיוחד קצב נשימה וחילוף חומרים של שומנים בדם. לכן, אנחנו מטופלי עוברי דג זברת סוג בר מ26 ואילך hpf עם מעכב תרופתי ספציפי של אנזים מקודד על ידי אחד מהגנים הללו. בגיל 50 hpf, מחצית מהרכב ועוברי מעכב טופל נותחה באמצעות סוסון הים למיטוכונדריה, ואילו המחצית הנותרת היו קבועה ב4% PFA הלילה ב 4 ° C ומוכתם בהמשך לתצהיר שומנים עם שמן האדום-O. טיפול במעכב האנזים הספציפי הוביל ~ עלייה של 2 קיפול בנשימה בסיסית (איור 4 א), שהיה קשור עם עלייה בתצהיר שומנים במיוחד בtelencephalon ומתחת לשלפוחית otic (האיור 4B, C).
pload/4300/4300fig1highres.jpg "/>
איור 1. ייצוג סכמטי של טיפול כימי של עוברי דג זברה. wildtype, מניפולציות גנטיות, או טיפול תרופתי עוברי דג זברה הוא רקע.
איור 2. צלחת XF24 איון להגדיר. () ארבע בארות מכילות בינוניות עוברי רק כבקרת טמפרטורה (מסומן על ידי X) ואחרים מכילים עוברים אחד / כן. (ב) תקריב של באר אחת (C6) מראה עובר 50 hpf פראי סוג שטופל ברכב (DMSO) מכוסה על ידי מסך ללכוד איון (ראש החץ).
איור 3. Respiratפרמטרים ליונים 50 עוברי דג זברה פרא סוג hpf. () לכל מדידה, הממוצע של 20 עוברים הבודדים מוצגים. נשימת אסאל (Mean: 299.7; SD: 75.7; SEM: 16.9), נשימה מקסימלי (ממוצע: 387.4; SD: 93.3; SEM: 20.9), קיבולת נשימת חילוף (ממוצע: 87.7; SD: 72.0; SEM: 16.1). (ב) לכל מדידה, הממוצע של 20 תוצאות הבודדות מוצג. נשימת אסאל המיטוכונדריה; נשימה המיטוכונדריאלי בשל מחזור ה-ATP; נשימה המיטוכונדריאלי כשהתיר ונשימה שאינה של המיטוכונדריה. הר: המיטוכונדריה; SRC: קיבולת נשימת חילוף; SD: סטיית תקן, SEM: שגיאת תקן של ממוצע. תוצאות מוצגות בpmol של O 2 צרך / דקות / עובר. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 4. מייצגתוצאות sentative של חשיפה כימית בנשימה בסיסית ובתצהיר שומנים. (A, B) 50 עובר hpf המוכתם בשמן האדום O בתצוגה לרוחב. העובר הודגרו עם מעכב סלקטיבי (ב ') מציג כתמים אדומים-O-שמן יותר בtelencephalon (ראש החץ) ומתחת לשלפוחית otic (חץ) בהשוואה לעובר שליטה ברכב שטופל. (C) הנשמת אסאל תערוכות ~ גידול של פי 2 בעוברים שטופלו כימי (N = 10 עוברים לכל קבוצה). תוצאות מוצגות בpmol של O 2 / דקות / עובר.
Discussion
דג זברה הוא מודל גנטי מבוסס היטב לשניהם קדימה (ENU mutagenesis) והפוך (עבד, אבץ האצבע nuclease ממוקד עקום החוצה, מציאת morpholino) גישה גנטית, 3,4, בעוד תפקוד גן בעוברי דג זברה יכול גם להיחסם בקלות או הופעל שימוש בתרכובות תרופתיות סלקטיביים ספציפיות למוצרים המקודדים. בשל ההתפתחות החיצונית שלהם והגודל קטן, עובר דג הזברה הם מתאימים במיוחד לניתוח מטבולים. עם זאת, מדידה חזקה של פרופיל המטבולי ומיטוכונדריה in vivo בעוברי דג זברה לא הושגה, ורק אחד תיאור ראשוני דיווחה 5. ניתוח סוסון הים תוכנן במקור למחקרים מטבוליים מבוססי תאים והודגם לתת תוצאות מדויקות ואמינות 6. היישום של מתודולוגיה חדשה זו לעוברי דג זברה הוא משמעותי, וסביר להניח כדי להגדיל את השימוש הרחב יותר של מודל זה למחקרים מטבוליים.
במחקר זה, אנו מדגימים מדידה של מגוון פרמטרי נשימה בעוברי דג זברה באמצעות Analyser סוסון הים, כולל הנשמה בסיסית, נשימה מקסימלי, יכולת נשימה פנויה, מחזור ה-ATP ודליפת פרוטון. אנו מספקים גם דוגמה לאופן שיכולות להיות מתואמות עם מדידות כאלה פרמטרים פיסיולוגיים אחרים, בהצטברות שומנים במקרה זה, ושל השימוש במעכבים תרופתיים במערכת assay זה. בשילוב עם השימוש בעוברים גנטיים שהשתנו, זה מספק פלטפורמה ניסיונית רבה עצמה להבנת גורמים המשפיעים על חילוף חומרים.
יש מגוון של יישומים למתודולוגיה חדשה זו, עם תפקוד המיטוכונדריה הוא מעורב במחלות של בני אדם רבות, כגון סוכרת 7 סוכרת, השמנת יתר 8, 9 טרשת נפוצה, פרקינסון 10, אלצהיימר 11 ואיזה סוג של 12 סוגי הסרטן. חשוב לציין, oעבודה מתבצעת ur in vivo, שבו כל ההשפעות הסביבתיות - כגון ציטוקינים וכו ', פיתוח הקשור לצמיחה - הן פעילות, ובכך לספק מבט פיסיולוגי רלוונטי בנשימת vivo ופרופיל מטבולים. כמסכים כימיים גם מבוצעים באופן שגרתי בסוג פרוע ועוברי דג זברה מוטנטים רקע (איור 1), תרופות חדשניות שהשפעת הנשימה, תפקוד המיטוכונדריה או חילוף חומרים יכולה להיות מזוהית בקלות באמצעות מנתח סוסון הים. תוצאות שנוצרו באמצעות מנתח סוסון הים יכולות לשמש בשילוב עם מבחנים אחרים כדי לספק מידע נוסף. זה יכול לכלול ניתוח פיסיולוגי, כגון כתמי שמן אדומים, או ניתוח מולקולרי, כמו כלאה באתרו לסמני adipocyte ספציפיים כגון cebpα, Pparα, Pparγ, FAS וכו '
יש להישאר כמה מגבלות מתודולוגיה זו. למרות שאנו ואחרים היו מסוגלים להשתמש oligomycin לMEAsייצור ה-ATP ויור דליפת פרוטון בעוברים צעירים 5 (ראה איור 3), בעוברים מעל גיל 60 טיפול hpf oligomycin אינו יעיל. אנו מאמינים כי בעוברים מבוגרים oligomycin לא יכול לנטרל בקלות מאשר בעוברים צעירים עושים את התוצאות אי אפשר לפרש. מאחר שתוצאות oligomycin הן חובה לקביעת נשימה עקב מחזור ה-ATP והנשמה נותקה, אנו כרגע בבדיקת ריכוזים גבוהים יותר של עוברים oligomycin למבוגרים. עם זאת, antimycin A טיפולים להישאר יעילים יותר, עם מדידות אחרות, כגון נשימה בסיסית, נשימה מרבית ואת יכולת נשימה פנויה, ניתן לבצע בעוברי דג זברה מבוגרים, עד 68 hpf (לא מוצג).
מגבלה נוספת בבאמצעות הגדרת Analyser סוסון הים הנוכחית היא גם מרחב הפיזי בתוך כל צלחת לכידת איון, כזה שהם מתאימים רק לעוברי דג זברה וזחלים צעירים. לכן, ביצוע metabolמחקרי IC על השמנת דיאטה מושרה בדגים בוגרים, למשל, עדיין לא אפשרי מבחינה טכנית. עם זאת, מחקר זה עשוי להנחות את הפיתוח של צלחות שתוכננו במיוחד לדגים צעירים או מבוגרים, וכך להרחיב את היקף ניתוח אפשרי.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות לחברי צוות של מתקן אוניברסיטת דיקין דג הזברה למתן טיפול גידול בעלי מתמשך מצוין. י.ג. נתמך על ידי מלגת אלפרד דיקין דוקטורי מחקר ומענק מחקר מרכזי מאוניברסיטת דיקין. SLM נתמך על ידי מלגת פיתוח קריירת NHMRC. ACW נתמך על ידי גרנט הפעלת NHMRC. כל המחברים נתמכים על ידי המרכז למחקר הרפואי המולקולרי והאסטרטגי מחקר באוניברסיטת דיקין.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| XF 24 extracellular flux analyser | Seahorse Bioscience | 100737-101 | 24 well format |
| Islet Capture microplate | Seahorse Bioscience | 101122-100 | 24 well format |
| XF Calibrant Solution | Seahorse Bioscience | 100840-000 | |
| XF Assay Medium | Seahorse Bioscience | 101022-100 | |
| Oil-Red-O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml51 |
| E3 (embryonic medium) | Self made | - | http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml16 |
| 100X15 mm Petri dishes | Falcon | 35-1029 | |
| FCCP | Sigma | C2920 | |
| Oligomycin | Sigma | 75351 | |
| Antimycin A | Sigma | A8674 |
References
- Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish. , Oxford University Press. (2002).
- Schlombs, K., Wagner, T., Scheel, J. Site-1 protease is required for cartilage development in zebrafish. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 14024-14029 (2003).
- Ingham, P. W. The power of the zebrafish for disease analysis. Hum. Mol. Genet. 18, R107-R112 (2009).
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).
- Stackley, K. D., Beeson, C. C., Rahn, J. J., Chan, S. S. Bioenergetic profiling of zebrafish embryonic development. Plos One. 6, e25652 (2011).
- McGee, S. L., Sadli, N., Morrison, S., Swinton, C., Suphioglu, C. DHA protects against zinc mediated alterations in neuronal cellular bioenergetics. Cell Physiol. Biochem. 28, 157-162 (2011).
- Sivitz, W. I., Yorek, M. A. Mitochondrial dysfunction in diabetes: from molecular mechanisms to functional significance and therapeutic opportunities. Antioxid. Redox Signal. 12, 537-577 (2010).
- Bournat, J. C., Brown, C. W. Mitochondrial dysfunction in obesity. Curr. Opin. Endocrinol. Diabetes Obes. 17, 446-452 (2010).
- Ghafourifar, P., et al. Mitochondria in multiple sclerosis. Front Biosci. 13, 3116-3126 (2008).
- Winklhofer, K. F., Haass, C. Mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease. Biochim. Biophys. Acta. 1802, 29-44 (2010).
- Maruszak, A., Zekanowski, C. Mitochondrial dysfunction and Alzheimer's disease. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 35, 320-330 (2011).
- de Moura, M. B., dos Santos, L. S., S, L., Van Houten, B. Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases and cancer. Environ. Mol. Mutagen. 51, 391-405 (2010).
