Summary
Zebrafish rappresenta un potente modello vertebrato che è stato sotto-utilizzato per studi metabolici. Qui si descrive un metodo rapido per misurare la
Abstract
Un obiettivo crescita nel campo del metabolismo è quello di determinare l'impatto della genetica su diversi aspetti della funzione mitocondriale. La comprensione di queste relazioni aiuterà a comprendere l'eziologia di fondo per una serie di malattie legate alla disfunzione mitocondriale, come il diabete e l'obesità. I recenti progressi nella strumentazione, ha permesso il monitoraggio dei parametri distinti della funzione mitocondriale in linee cellulari o espianti di tessuto. Presentiamo qui un metodo per un'analisi rapida e sensibile di parametri funzione mitocondriale in vivo durante lo sviluppo embrionale di zebrafish usando l'Seahorse Bioscience XF 24 analizzatore extracellulare flusso. Questo protocollo utilizza la cattura Islet micropiastre in cui un singolo embrione si trova in ciascun pozzetto, consente la misurazione della bioenergetica, tra cui: (i) la respirazione basale, (ii) la respirazione mitocondriale basale (iii) la respirazione mitocondriale a causa di fatturato ATP, (iv) mitocondriale respirazione disaccoppiato o prOton perdita e (iv) la respirazione massimo. Utilizzando questo approccio embrionali parametri respiratori zebrafish può essere paragonato tra wild-type e di embrioni geneticamente modificati (mutante, gene sovra-espressione o knockdown gene) o quelli manipolato farmacologicamente. Si prevede che la diffusione di questo protocollo fornirà ai ricercatori nuovi strumenti per analizzare le basi genetiche dei disturbi metabolici in vivo nel modello animale vertebrato rilevante.
Protocol
Parte 1: trattamento chimico di embrioni di zebrafish
- Raccogliere embrioni di zebrafish dopo la fecondazione. Incubare a 28,5 ° C in terreno E3 in 100 × 15 millimetri Petri. Nota: per ibridazione in situ o Oil-Red-O colorazione, 1-fenil-2-tiourea (PTU) ad una concentrazione finale di 0,2 mM viene aggiunto inibire la formazione di pigmento, 1 ma non è necessario per l'analisi Seahorse.
- Per gli studi farmacologici, aggiungere la sostanza chimica necessaria ad una concentrazione finale adeguata per lo sviluppo di embrioni di zebrafish in circa 26 ore dopo la fecondazione (HPF) con un adeguato controllo con solo veicolo. Nota: per gli inibitori farmacologici sensibili alla luce, gli embrioni possono essere consentito di sviluppare in il priore buio per l'analisi.
Parte 2: il profilo metabolico dal vivo con il Seahorse XF 24 Analyser
- Prima di ogni esecuzione, il Seahorse XF 24 cartuccia Analyser che ospita il 2 O e H
- Preparazione del 24 pozzetti XF piastra da 24 isole. La seguente sequenza sperimentale è impiegato:
- Poiché il consumo di ossigeno è sensibile alle variazioni di temperatura, quattro pozzi sono usati per controllare le fluttuazioni di temperatura possibili attraverso la piastra. Questi pozzetti non contengono embrioni, ma sono riempiti con 700 pl di mezzo E3 (Figura 2A).
- I restanti 20 pozzi (cfr. parte 2.2) sono riempiti con 700 ml di mezzo di E3 e un embrione ciascuno (Figura 2B).
- Per ogni esperimento, 10 embrioni sono trattati con veicolo (controllo) e 10 trattati con inibitore chimico (trattata). Embrioni di controllo e trattato si alternano (ad esempio, ben A2: embrione di controllo; bene A3: embrione trattato: A4 anche: embrione di controllo; ben embrione A5 trattamento, ecc.)
- Una schermata di acquisizione isolotto è aggiunto in cima. ogni pozzetto per garantire che il campione rimane nella camera di misura all'interno del dosaggio (Figura 2B) Nota: trattati chimicamente embrioni rimangono con la soluzione chimica originale durante l'intera procedura, senza necessità di lavare il prodotto chimico prima esecuzione dell'analizzatore Seahorse programma.
- Una volta terminata, la lastra viene caricata nel Analyser Seahorse ed il dosaggio viene avviato.
- Analisi di campioni. Due diverse prove sono eseguite di routine.
- Basale respirazione / Massimo programma respirazione (durata circa 90 min.). Le alterazioni della respirazione basale sostenere disfunzione metabolica, mentre la respirazione massima è una misura della capacità totale di produzione di energia e alterazioni in questo parametro associato con un certo numero di stati sia patologici e fisiologici. La capacità respiratoria di riserva, o la capacità di sistema di aumentare ulteriormente la produzione di ATP, viene inoltre calcolatada questa prova dalla sottrazione di respirazione basale da massima. Tre ripetizioni di ciascuna miscela (2 min) / attesa (1 min) / misura (2 min) ciclo viene eseguita per stabilire prima la respirazione basale. Al termine del terzo ciclo, una concentrazione finale di 2,5 pM di FCCP (mitocondriale protonophore / disaccoppiatore) viene aggiunto a ciascun pozzetto permettendo la misurazione della respirazione massima. Il ciclo di misura viene quindi ripetuto 5-8 volte (Figura 3).
- ATP fatturato / Proton programma di perdita (durata circa 60 min.). La respirazione a causa di fatturato ATP rappresenta la principale funzione dei mitocondri in forma di produzione di ATP, mentre la respirazione a causa della perdita di protoni, o respirazione disaccoppiati, è strettamente legata ad altri parametri della funzione mitocondriale tra cui la respirazione basale e reattiva la formazione di specie di ossigeno. Respirazione a causa turnover ATP è rappresentato dalla differenza di respirazione dopo l'aggiunta di 25 pM oligomicina (un inibitore di ATP sintasi) rispetto alla respirazione basale. Respirazione disaccoppiata, o respirazione a causa di perdita protonica, viene determinato calcolando la differenza tra oligomicina-mediata respirazione respirazione e dopo l'aggiunta di 25 uM rotenone (un inibitore del complesso I). Cicli di misura vengono ripetuti 8 volte dopo l'aggiunta di ciascun inibitore mitocondriale.
- Preparazione del 24 pozzetti XF piastra da 24 isole. La seguente sequenza sperimentale è impiegato:
Alla fine delle piste, i valori medi del controllo 10 e 10 embrioni trattati chimicamente sono calcolati.
Parte 3: Oil-Red-O di colorazione
- Gli embrioni a 50 HPF sono dechorionated utilizzando una pinza sottile e fissate in 4% PFA per una notte a 4 ° C.
- Oil-Red-O colorazione viene effettuata, come precedentemente descritto 2 (vedi Figura 4).
Representative Results
Siamo interessati a capire il ruolo dei geni specifici sul metabolismo, in particolare il tasso di respirazione e il metabolismo dei lipidi. Pertanto, abbiamo trattato selvatici embrioni di zebrafish tipo da 26 in poi HPF con uno specifico inibitore farmacologico di enzima codificato da uno di questi geni. A 50 HPF, metà del veicolo e inibitore trattati embrioni sono stati analizzati utilizzando la Seahorse per la funzione mitocondriale, mentre la restante metà sono stati fissati in 4% PFA notte a 4 ° C e successivamente trattata per deposizione di lipidi con Oil-Red-O. Il trattamento con l'inibitore di enzima specifico condotto un ~ 2 volte più elevata respirazione basale (Figura 4A), che è stata associata con un aumento deposizione di lipidi soprattutto nel telencefalo e sotto la vescicola otica (Figura 4B, C).
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Figura 1. Rappresentazione schematica di trattamento chimico di embrioni di zebrafish. Wildtype, geneticamente manipolati, trattati farmacologicamente o embrioni di zebrafish sono sfondo.
Figura 2. XF24 piatto isolotto impostare. (A) Quattro pozzi contenere mezzo embrionale solo come il controllo della temperatura (indicate con una X) e gli altri contengono un embrione / bene. (B) Close-up di un pozzo (C6) che mostra un 50 embrione wild type hpf trattati con veicolo (DMSO) coperta da una schermata di acquisizione isolotto (punta di freccia).
Figura 3. Respiratparametri di ioni per selvatici di tipo 50 embrioni di zebrafish HPF. (A) Per ogni misura, la media dei 20 embrioni singoli è presentato. Respirazione basale (media: 299,7; SD: 75.7; SEM: 16.9), la respirazione massima (media: 387,4; SD: 93.3; SEM: 20,9), la capacità respiratoria di ricambio (media: 87,7; SD: 72.0; SEM: 16.1). (B) Per ciascuna misurazione, la media dei 20 singoli risultati è presentato. Basale respirazione mitocondriale; respirazione mitocondriale a causa di fatturato ATP mitocondriale respirazione disaccoppiato e non mitocondriale respirazione. Mt: mitocondriale; SRC: ricambio capacità respiratoria; SD: Deviazione Standard, SEM: Errore standard della media. I risultati sono presentati in pmol di O 2 consumata / min / embrione. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 4. Rappresenrisultati rappresentativi dell'esposizione a sostanze chimiche sulla respirazione basale e la deposizione di lipidi. (A, B) 50 HPF embrioni colorati con olio rosso O in vista laterale. L'embrione incubate con l'inibitore selettivo (B) mostra più la colorazione Oil-Red-O nel telencefalo (punta di freccia) e sotto la vescicola otica (freccia) rispetto ad un veicolo trattato con embrione di controllo. (C) respirazione basale mostra un aumento di circa 2 volte negli embrioni trattati chimicamente (n = 10 embrioni per gruppo). I risultati sono presentati in pmol di O 2 / min / embrione.
Discussion
Zebrafish è una consolidata modello genetico sia in avanti (ENU mutagenesi) e reverse (Tilling, zinc finger nucleasi mirata knock-out, knockdown morfolino) approcci genetici 3,4, mentre la funzione del gene in embrioni di zebrafish può anche essere facilmente bloccato o attivato utilizzando selettivi composti farmacologici specifici per i prodotti codificati. Grazie al loro sviluppo esterno e piccole dimensioni, embrioni di zebrafish sono particolarmente adatti per l'analisi metabolica. Tuttavia, la misura del profilo metabolico robusta e funzione mitocondriale in vivo in embrioni di zebrafish non è stato raggiunto, con una sola descrizione preliminari riportate 5. Analisi Seahorse stato originariamente progettato per basati su celle studi metabolici e ha dimostrato di dare risultati precisi e affidabili 6. L'applicazione di questa nuova metodologia di embrioni di zebrafish è significativo, e in grado di aumentare l'uso più ampio di questo modello per gli studi metabolici.
In questo studio, abbiamo dimostrato la misurazione di una serie di parametri di respirazione in embrioni di zebrafish utilizzando l'analizzatore Seahorse, tra cui la respirazione basale, respirazione massima, di ricambio capacità respiratoria, fatturato ATP e perdite protone. Forniamo anche un esempio di come tali misurazioni possono essere correlati con altri parametri fisiologici, in questo caso accumulo di lipidi, e dell'uso di inibitori farmacologici in questo sistema di analisi. In combinazione con l'uso di embrioni geneticamente alterati, questo fornisce una potente piattaforma sperimentale per comprendere i fattori che incidono sul metabolismo.
Ci sono una varietà di applicazioni per questa nuova metodologia, con disfunzione mitocondriale è implicato in molte malattie umane, come il diabete mellito 7, obesità 8, 9 sclerosi multipla, Parkinson 10, morbo di Alzheimer 11 e alcuni tipi di cancro 12. È importante sottolineare che, our lavoro viene eseguito in vivo, in cui tutte le influenze ambientali - quali citochine, sviluppo connesse etc crescita - sono attivi, fornendo così una vista fisiologicamente rilevante nella respirazione vivo e profilo metabolico. Come schermi chimici sono eseguiti di routine in wild type e mutanti embrioni di zebrafish sfondo (Figura 1), i prodotti farmaceutici innovativi che influenza la respirazione, la funzione dei mitocondri e metabolismo rischiano di essere facilmente identificabili con l'analizzatore Seahorse. I risultati ottenuti utilizzando l'analizzatore Seahorse potrebbe essere utilizzato in combinazione con altri saggi di fornire ulteriori informazioni. Questo può includere analisi fisiologica, come olio rosso-colorazione, o analisi molecolare, come l'ibridazione in situ per adipociti marcatori specifici come cebpα, PPARa, PPARy, ecc FAS
Restano alcune limitazioni a questa metodologia. Anche se e gli altri erano in grado di utilizzare oligomicina per misuraure produzione di ATP e perdita protonica sugli embrioni giovani 5 (vedi figura 3), in embrioni di età superiore ai 60 Trattamento hpf oligomicina è inefficiente. Riteniamo che nei vecchi embrioni oligomicina non può diffondere con la stessa facilità che nei giovani embrioni rendendo i risultati impossibili da interpretare. Dal momento che i risultati oligomicina sono obbligatori per la determinazione della respirazione a causa di fatturato ATP e la respirazione disaccoppiato, stiamo attualmente studiando concentrazioni più elevate di oligomicina per gli anziani embrioni. Tuttavia, antimicina A trattamenti rimangono più efficace, con altre misure, come la respirazione basale, respirazione massima e ricambio capacità respiratoria, può essere eseguita in embrioni di zebrafish anziani, fino a 68 HPF (non mostrato).
Un'altra limitazione utilizzando l'attuale configurazione Analyser Seahorse è lo spazio fisico all'interno di ogni piastra di cattura isolotto bene, in modo tale che essi sono adatti solo per embrioni di zebrafish e larve giovani. Pertanto, eseguendo metabolic studi sulla dieta obesità indotta nei pesci adulti, per esempio, non è ancora tecnicamente possibile. Tuttavia, questo studio possono indurre lo sviluppo di lastre appositamente studiati per il novellame o adulto, in modo da estendere l'ambito di analisi possibili.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare i membri del personale del Fondo per la Deakin University Zebrafish per fornire un'eccellente assistenza in corso allevamento. YG è supportato da una borsa di studio di ricerca post-dottorato e Alfred Deakin un assegno di ricerca Central da Deakin University. SLM è supportato da una borsa di studio NHMRC sviluppo della carriera. ACW è sostenuta da una sovvenzione NHMRC Attivazione. Tutti gli autori sono supportati dal Molecular & Medical Research Centre di ricerca strategica presso Deakin University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| XF 24 extracellular flux analyser | Seahorse Bioscience | 100737-101 | 24 well format |
| Islet Capture microplate | Seahorse Bioscience | 101122-100 | 24 well format |
| XF Calibrant Solution | Seahorse Bioscience | 100840-000 | |
| XF Assay Medium | Seahorse Bioscience | 101022-100 | |
| Oil-Red-O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml51 |
| E3 (embryonic medium) | Self made | - | http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml16 |
| 100X15 mm Petri dishes | Falcon | 35-1029 | |
| FCCP | Sigma | C2920 | |
| Oligomycin | Sigma | 75351 | |
| Antimycin A | Sigma | A8674 |
References
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